We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
En av kardinalprocesserna inflammation är infiltration av immunceller från lumen av blodkärlet till den omgivande vävnaden. Detta inträffar när endotelceller, vilka bekläder blodkärl, blir lim på cirkulerande immunceller såsom monocyter. In vitro-mätning av denna vidhäftningsförmåga har hittills gjorts genom att kvantifiera det totala antalet monocyter som vidhäftar till ett endotelskikt antingen som en direkt räkning eller genom indirekt mätning av fluorescensen av vidhäftande monocyter. Även om sådana mätningar gör indikerar den genomsnittliga vidhäftningsförmågan hos endotelceller befolkningen, de förväxlas med ett antal faktorer, såsom antalet celler, och inte avslöja hur stor andel av endotelceller som faktiskt lim. Här beskriver vi och demonstrera ett förfarande som möjliggör räkning av vidhäftande celler i en testad population av endoteliala monoskikt. Endotelceller odlas på täckglas och följande önskasbehandling utmanas med monocyter (som kan vara fluorescensmärkt). Efter inkubation en sköljförfarande, som innefattar multipla omgångar av nedsänkning och avledning, fixeras cellerna. Adhesiva endotelceller, som är omgivna av monocyter identifieras lätt och uppräknade, vilket ger en vidhäftningsindex som avslöjar den faktiska andelen endotelceller inom populationen som är adhesiv.
Infiltrering av immunceller, såsom monocyter över endotelcellskikt som kantar blodkärlen är ett viktigt steg i processen av inflammation en. Detta gör att målsökande av immunceller (immunocyter) till en skadestället. I andra fall och platser såsom kranskärls och halspulsådern kan infiltration av monocyter genom endotelskiktet leda till oönskade långsiktiga bosättning av dessa celler i väggen i artären, vilket kan leda till bildandet av plack 2. I alla fall av immunocyt infiltration, innefattar det första steget av aktiveringen av endotelceller i ett lokaliserat område av blodkärlet. Endotelceller aktiveras av proinflammatoriska cytokiner såsom TNF-α och IL-6 för att öka expression av cellyteproteiner såsom VCAM, ICAM och E-selektin som underlättar rekrytering och fastsättning immunocyter på den endoteliala cellytan 3- 6.
<p class = "jove_content"> Initialt mätning av endotelcellsadhesion utfördes genom att räkna monocyter som vidhäftade till endoteliala monoskikt 7. Begränsningarna med denna metod när det gäller precision ledde till användning av radiomärkt lymfocyter eller monocyter, följt av kvantifiering av radioaktivt material som motsvarar lymfocyter eller monocyter vidhäftning 4. Denna metod så småningom ersatts av en fluorescensbaserad metod, varigenom immunocyter av intresse märktes med fluorescensfärgämne och utsattes för samma procedur som ovan med den skillnaden att fluorescens istället för radioaktivitet mätes 8. För närvarande denna metod har visat sig vara det mest bekväma och säljs i byggsats av flera kommersiella leverantörer. Även om denna analys kan mäta relativa nivåer av vidhäftning mellan kontroller och experimentprover, inte avslöja det om en förändring i fluorescens beror på en enhetlig förändring i vidhäftning över hela endothelial cellpopulation eller om ändringen beror på en skillnad på vidhäftnings inom en sub-population av celler. Det är också uppenbart att stringensen tvätt utövar en djupgående effekt på resultatet, och ännu viktigare, kommer enhetligheten att skölja av obundna monocyter mellan olika endotelceller cellmonoskikt påverkar i hög grad på hur nära resultaten från replikat och reproducerbarhet mellan proven . På senare tid har flera system som pumpar monocyter i media över en endotel encellsskiktet används för att ta itu med det här problemet 9. Dessutom är dessa flödessystem rekapitulera även effekten av skjuvkraften på endotelcellerna. Medan fördelarna med sådana system är tydliga och mycket attraktivt, är det också viktigt att inse att även om endotelcell vidhäftning i hög grad kan utökas, vilket är fallet vid akut inflammation, av faktorer såsom TNFa, vissa andra aktivatorer, såsom joniserande strålning 10 Elicit ändrar thatt är inte lätt detekteras inom in vitro experimentella tidsramar som dessa mycket stränga system. Även om sådana små förändringar av endotelceller vidhäftning är enkelt missat eller avfärdas in vitro, är det inte nödvändigtvis godartad in vivo, där sådana små förändringar i en livstid, som är karaktäristisk för kronisk inflammation, kan utöva mycket betydande resultat. Därför en robust, men ändå känslig och specifik metod för att detektera och mäta endotelceller vidhäftning behövs.Här rapporterar vi en metod för att mäta vidhäftningsförmågan hos endotelceller direkt. Denna metod är inte beroende av fluorescensmätning som en indirekt surrogat indikator på endotelceller vidhäftning. Det visar om förändringar i vidhäftning beror på enhetliga förändring i alla celler eller begränsad till en delpopulation. Dessutom gör det co-färgning av endotelceller med markörer såsom åldrande associerade beta-galaktosidas, cellviabiliteten marker, Calcien AM och antikroppar mot cellytan och intracellulära proteiner, vilket gör att en sammanslutning av enskilda vidhäftande endotelceller till vissa celltillstånd eller uttryck av specifika proteiner.
Monocyt vidhäftning analys som beskrivs ovan användes framgångsrikt i experiment utformade för att studera de biologiska effekterna av joniserande strålning på endotel monolager 10. Även om detta inte är den enda metod som finns tillgänglig för att bedöma vidhäftningsförmågan hos en endotel monoskikt, är det den enda metod som tillåter kvantifiering av andelen eller procentandelen endotelceller inom ett monoskikt som är vidhäftande. Detta är en viktig skillnad som en global kvantitativ förändring i vidhäftning av monocyter, kan mätt med andra metoder tillskrivas antingen till en allmän ökning av vidhäftningsförmågan hos alla celler i endothelial monolager eller till ökningen vidhäftningsförmågan hos en undergrupp av endotelceller inom monolagret, såsom visas i exemplet ovan. Värdet av att ha denna information exemplifieras av det faktum att möjligheten att kvantifiera den andel av endotelceller som uppvisade förbättrad vidhäftningsförmåga efter bestrålning ledde till de ineskapabel slutsatsen att denna effekt inte beror på genetisk mutation av en viss gen som den procentuella andelen celler som var adhesiv var kraftigt ovan (mer än 1000 gånger mer) den som skulle förväntas från slumpmässig mutation av en gen av röntgenstrålning vid denna dos .
Den faktor som medger god reproducerbarhet av resultaten är tvätt regimen. Som tvättproceduren involverar nedsänkning av glastäckglas i tvättbuffert följt genom att badda på en vävnad, är variabiliteten i buffert turbulens som oundvikligen uppstår från den gamla metoden med pipettering av tvättbuffert i en brunn undvikas. I själva verket var det observation av överdriven variabilitet mellan replikat som erhållits med hjälp av pipetteringsmetod som tvingade oss att ta fram en tvättproceduren som bort variationen elementet från tvättningssteget.
Visserligen de begränsningar av denna analys ligger i behovet att utföra manuell räkning av monocyt kluster, som gör not att den kan anpassas för högeffektiv analys. För det andra har beslutet om hur många monocyter utgör ett kluster som skall fastställas halv godtyckligt och nivån kan ställas in för hög och resulterar i uteslutning av vissa äkta kluster. Avsaknaden av skjuvkraft i denna metod kan också ses som en begränsning i experiment där grovt förbättrad vidhäftning av endotelceller induceras (t.ex. + TNFa). I andra situationer dock bristen på skjuvkraft är en fördel eftersom det gör det möjligt att upptäcka mindre överdriven ökning av vidhäftning. Modest ökning av monocyt vidhäftning kan vara särskilt viktig och relevant. In vivo monocyter skulle inte (i en typisk experimentell tid) förväntas att fästa i stora skaror till endotelceller med blygsam ökning i vidhäftningsförmåga, till stor del på grund av tvärkraft. Med tiden dock vissa monocyter skulle förmodligen, och det är mer sannolikt att representera miljön av kronisk inflammation. Som sådan,avsaknad av tvärkraft kan vara en fördel, eftersom det ger möjlighet till små ökningar i endotelceller vidhäftnings att uppenbaras i experimentella tidsramar som är typiskt kort och möjligen alltför flyktig för att medge blygsam ökning av vidhäftnings att observeras under skjuvspänning.
Förmågan att utsätta cellerna efter denna analys till andra analyser såsom åldrande analys och immunofluorescensfärgning ökar användbarheten av denna metod eftersom den tillåter en sammanslutning av vidhäftning av specifika endotelceller till särskilda cellulära proteiner eller cellulära tillstånd som visats ovan, en funktion som är inte tillgängligt med äldre vidhäftningsanalyser.
Denna metod har använts med est2-immortaliserade humana koronara endotelceller och liknande resultat erhölls också med primära humana koronara endotelceller 10, vilket visar att det inte är specifikt för bara en viss cellinje. Även ADOption av denna metod för analys av vidhäftning av endotelceller utesluter inte utsätta samma celler med standardvidhäftningsanalys som mäter fluorescens av märkta immunocyter. Tillsammans visar denna rapport att denna metod är mångsidig, inkluderande och ger mycket mer information än standard adhesionsanalysen.
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |