We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
Eén van de kardinale processen van ontsteking de infiltratie van immuuncellen uit de lumen van het bloedvat aan het omringende weefsel. Dit gebeurt wanneer endotheelcellen die lijn bloedvaten, wordt kleefmiddel circulerende immuuncellen zoals monocyten. In vitro meting van deze hechting is tot nu toe gedaan door het kwantificeren van het totale aantal monocyten die voldoen aan een endotheel laag hetzij als direct count of indirecte meting van de fluorescentie van hechtende monocyten. Hoewel dergelijke metingen geven de gemiddelde kleverigheid van het endotheel celpopulatie, zijn ze verstoord door een aantal factoren, zoals het aantal cellen, en kan de hoeveelheid endotheelcellen die eigenlijk lijm niet bekend. Hier beschrijven wij en tonen een methode die de opsomming van lijm cellen mogelijk maakt binnen een geteste populatie van endotheelcellen monolaag. Endotheliale cellen worden gekweekt op dekglaasjes en volgende gewenstebehandeling uitgedaagd met monocyten (die kunnen fluorescerend worden gemerkt). Na incubatie van een spoelprocedure, waarbij meerdere ronden van onderdompeling en drainage worden de cellen gefixeerd. Adhesive endotheelcellen, die worden omgeven door monocyten worden gemakkelijk geïdentificeerd en opgesomd, waardoor een adhesie index die het werkelijke percentage van endotheliale cellen in de populatie dat hechtmiddel zijn openbaart.
Infiltratie van immuuncellen zoals monocyten over de endotheliale cellaag die lijn bloedvaten is een belangrijke stap in het proces van ontsteking 1. Hierdoor kan de homing van immuuncellen (immunocyten) een plaats van letsel. In andere gevallen en locaties, zoals de kransslagader en halsslagader, kan infiltratie van monocyten door de endotheliale laag tot ongewenste langdurige verblijf van deze cellen in de wand van de slagader, kan leiden tot de vorming van plaques 2. In alle gevallen van immunocyt infiltratie, de eerste stap is de activering van de endotheelcellen in een gelokaliseerd gebied van het bloedvat. Endotheelcellen worden geactiveerd door pro-inflammatoire cytokines zoals TNF-α en IL-6 tot expressie van celoppervlakte-eiwitten zoals VCAM, ICAM en E-selectine waarmee het aannemen en bevestiging van de immunocyten op het endotheelceloppervlak 3- vergemakkelijken vergroten 6.
<p class = "jove_content"> Aanvankelijk meting van endotheelcellen de hechting werd uitgevoerd door het tellen van monocyten die gehandeld op grond van monolaag 7 endotheliale uitgevoerd. De beperkingen van deze techniek in termen van nauwkeurigheid geleid tot het gebruik van radioactief gemerkte lymfocyten of monocyten, gevolgd door kwantificeren van radioactieve stoffen, die overeenkomt met lymfocyten of monocyten adhesie 4. Deze methode werd uiteindelijk vervangen door een fluorescentie gebaseerde methode, waarbij immunocyten plaats werden gelabeld met fluorescentie kleurstof en onderworpen aan dezelfde procedure als hierboven met het verschil dat in plaats fluorescentie radioactiviteit wordt gemeten 8. Momenteel is deze methode heeft ontpopt als de meest handige en in kit-vorm wordt verkocht door een aantal commerciële leveranciers. Hoewel dit assay daaraan gekoppelde hechting tussen de controles en experimentele monsters kunnen meten, is het niet bekend of er een verandering in fluorescentie wordt veroorzaakt door een gelijkmatige verandering kleverigheid over de gehele endothelial celpopulatie of als de verandering wordt veroorzaakt door een verschil van kleverigheid bij een subpopulatie van cellen. Het is ook duidelijk dat de stringentie van wassen oefent een grote invloed op het resultaat, en nog belangrijker, wordt de uniformiteit van het afspoelen ongebonden monocyten tussen verschillende endotheliale monolagen grote invloed op de mate waarin de resultaten van de herhalingen en de reproduceerbaarheid van de resultaten tussen monsters . Recenter verschillende systemen monocyten pomp in media in een monolaag van endotheelcellen werden gebruikt om dit probleem aan te pakken 9. Bovendien zijn deze stromingssystemen het effect van dwarskracht op de endotheliale cellen recapituleren ook. Hoewel de voordelen van dergelijke systemen duidelijk en zeer aantrekkelijk, is het ook belangrijk te beseffen dat hoewel kan endotheelcel hechting sterk worden uitgebreid, zoals het geval is bij acute ontsteking, door factoren zoals TNFa, andere activatoren, zoals ioniserende straling 10 Elicit verandert thoed zijn niet gemakkelijk gedetecteerd binnen in vitro experimentele termijnen die door deze zeer strenge systemen. Hoewel zulke kleine veranderingen van endotheelcellen kleverigheid gemakkelijk gemist of verworpen in vitro, het niet noodzakelijkerwijs goedaardig in vivo, wanneer deze kleine veranderingen binnen levenstijd, die kenmerkend is voor chronische ontsteking, zijn indrukwekkende resultaten oefenen. Vandaar dat een robuuste en gevoelige en specifieke methode voor het opsporen en meten van endotheelcellen kleverigheid vereist.Hier melden wij een methode om de hechting van endotheelcellen direct te meten. Deze methode is niet afhankelijk van fluorescentiemeting als indirecte surrogaat indicator van endotheelcellen hechting. Het onthult of veranderingen in hechting zijn te wijten aan een uniforme verandering in alle cellen of beperkt tot een sub-populatie. Bovendien maakt co-kleuring van endotheliale cellen met markers zoals senescentie-geassocieerde beta-galactosidase, cellevensvatbaarheid marker, Calcien AM en antilichamen tegen het celoppervlak en intracellulaire eiwitten, waardoor de vereniging van individuele lijm endotheelcellen bepaalde cel staten of expressie van specifieke eiwitten.
De monocyt adhesie bovenbeschreven bepaling werd met succes gebruikt in experimenten ontworpen om de biologische effecten van ioniserende straling op endotheliale monolagen 10 bestuderen. Hoewel dit niet de enige methode om de hechting van een endotheel monolaag beoordelen is de enige methode die de kwantificering van de hoeveelheid of het percentage endotheel cellen in een monolaag die kleeflaag. Dit is een belangrijk onderscheid globale kwantitatieve verandering in binding van monocyten, zoals gemeten door andere methoden kunnen worden toegeschreven hetzij een algemene toename kleverigheid van alle cellen van het endotheel monolaag of de toename kleverigheid van een subpopulatie van endotheelcellen binnen de monolaag, zoals in het bovenstaande voorbeeld. De waarde van het hebben van deze gegevens wordt geïllustreerd door het feit dat de mogelijkheid om het percentage van endotheliale cellen die verbeterde hechting vertoonden kwantificeren na bestraling tot de ineskunnen concluderen dat dit effect niet te wijten aan genetische mutatie van een bepaald gen als het percentage cellen die lijm was werden zeer hoger (meer dan 1000 maal), hetgeen door willekeurige mutatie van een gen verwacht zou worden door röntgenstraling bij die dosis .
De factor die goede reproduceerbaarheid van de resultaten mogelijk is het regime wassen. Aangezien het wassen omvat het onderdompelen van de glazen dekglaasje in de wasbuffer, gevolgd door deppen op een weefsel wordt variabiliteit in de buffer turbulentie die onvermijdelijk gevolg is van de oude methode pipetteren van de wasbuffer in een put vermeden. Inderdaad was de observatie van buitensporige variabiliteit tussen replicaten verkregen volgens de methode die wij pipetteren gedwongen een wasprocedure die de variabiliteit element uit de wasstap bedenken.
Toegegeven, de beperkingen van deze test liggen in de noodzaak van handmatige telling van monocyten clusters, die n doenot laat het worden aangepast voor high throughput analyse. Ten tweede, de beslissing over hoeveel monocyten vormen een cluster moet semi-willekeurig worden bepaald en het niveau te hoog ingesteld worden en leiden tot uitsluiting van een aantal echte clusters. Het ontbreken van dwarskracht in deze werkwijze kan ook worden gezien als een beperking in experimenten waarbij grove verbeterde hechting van endotheelcellen wordt geïnduceerd (bijv + TNFa). In andere gevallen echter, het gebrek aan afschuifkracht is een voordeel aangezien het de detectie van minder overdreven vergroting van kleverigheid. Bescheiden toename monocyten hechtvermogen kan bijzonder belangrijk en relevant zijn. In vivo, monocyten niet (in een typisch experimentele tijd) verwachting te bevestigen in grote aantallen endotheelcellen met een bescheiden toename van kleverigheid, grotendeels te wijten aan afschuifkracht. Mettertijd echter een aantal monocyten zou waarschijnlijk, en dit is eerder het milieu van chronische ontsteking vertegenwoordigen. Zoals,afwezigheid van afschuifkracht kan een voordeel zijn omdat het de mogelijkheid voor kleine toename in endotheelcellen hechting worden geopenbaard in experimentele tijdframes die kenmerkend kort mogelijk te vluchtig om bescheiden toename kleverigheid onder schuifspanning worden waargenomen zijn.
Het vermogen om de cellen na deze assay overige analyses zoals senescentie assay en immunofluorescentiekleuring onderwerpen vergroot de bruikbaarheid van deze werkwijze het mogelijk is bij hechting van specifieke endotheelcellen bepaalde cellulaire eiwitten of cellulaire toestanden zoals hierboven is aangetoond, een eigenschap die is niet beschikbaar bij de oudere hechting assays.
Deze methode is gebruikt met EST2 geïmmortaliseerde humane coronaire endotheelcellen en vergelijkbare resultaten werden ook verkregen met primaire humane coronaire endotheelcellen 10, waaruit blijkt dat het niet specifiek voor alleen een bepaalde cellijn. Ook de adoption van deze wijze van testen van hechting van endotheelcellen niet uitsluiten onderwerpen dezelfde cellen op de standaard adhesietest die fluorescentie van gemerkte immunocyten meet. Samen dit verslag blijkt dat deze methode is veelzijdig, inclusief en levert veel meer informatie dan de standaard adhesietest.
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |