We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
Uno dei processi cardinali di infiammazione è l'infiltrazione di cellule immunitarie dal lume del vaso sanguigno al tessuto circostante. Questo si verifica quando le cellule endoteliali, che rivestono i vasi sanguigni, diventano adesivo circolanti cellule immunitarie come monociti. In vitro degli questo adesività è finora fatto quantificando il numero totale di monociti che aderiscono ad uno strato endoteliale sia come conteggio diretto o attraverso la misura indiretta della fluorescenza di monociti aderenti. Mentre tali misurazioni indicano l'adesività media della popolazione di cellule endoteliali, sono confusi da una serie di fattori, come il numero di cellule, e non rivelano la proporzione di cellule endoteliali che sono effettivamente adesivo. Qui si descrive e dimostrare un metodo che consente l'enumerazione delle cellule adesive all'interno di una popolazione testata di monostrato endoteliale. Le cellule endoteliali sono coltivate su vetrini e seguendo desideratotrattamento sono sfidati con monociti (che può essere fluorescente). Dopo l'incubazione, una procedura di risciacquo, che coinvolge vari cicli di immersione e scarico, le cellule vengono fissate. Cellule endoteliali adesivi, che sono circondate da monociti sono facilmente identificabili e enumerati, dando un indice di adesione che rivela la percentuale effettiva di cellule endoteliali all'interno della popolazione che sono adesivi.
Infiltrazione di cellule immunitarie quali monociti attraverso lo strato di cellule endoteliali che rivestono i vasi sanguigni è un passo importante nel processo di infiammazione 1. In questo modo il homing delle cellule immunitarie (immunociti) a un sito di lesione. In altri casi e luoghi come l'arteria coronarica e carotidea, infiltrazione di monociti attraverso lo strato endoteliale può portare alla residenza indesiderabile lungo termine di queste cellule nella parete dell'arteria, potrebbe condurre alla formazione di placche 2. In tutti i casi di immunocyte infiltrazione, la prima fase prevede l'attivazione delle cellule endoteliali in una regione localizzata del vaso sanguigno. Le cellule endoteliali sono attivati da citochine pro-infiammatorie come TNF-α e IL-6 per aumentare l'espressione di proteine di superficie cellulare come VCAM, ICAM ed E-selectina che facilitano il reclutamento e il fissaggio dei immunociti sulla superficie delle cellule endoteliali 3- 6.
<p class = "jove_content"> Inizialmente, la misura di adesione delle cellule endoteliali è stata effettuata contando monociti che hanno aderito al endoteliale monostrato 7. Le limitazioni di questo metodo in termini di precisione condotto all'uso di linfociti radio-marcato o monociti, seguita dalla quantificazione del materiale radioattivo corrispondente al linfociti o monociti adesione 4. Questo metodo è stato poi sostituito con un metodo basato sulla fluorescenza, per cui immunociti di interesse sono state marcate con fluorescenza colorante e sottoposti alla stessa procedura come sopra, con la differenza che invece di fluorescenza della radioattività viene misurata 8. Attualmente questo metodo è emerso come il più conveniente ed è venduta in kit da diversi fornitori commerciali. Mentre questo test può misurare i livelli relativi di adesività tra controlli e campioni sperimentali, non rivela se un cambiamento della fluorescenza è causa di un cambiamento uniforme adesività sull'intera epopolazione cellulare ndothelial o se la modifica è dovuta a una differenza di adesività di un sub-popolazione di cellule. E 'evidente, inoltre, che il rigore di lavaggio esercita un profondo effetto sul risultato, e, soprattutto, l'uniformità di risciacquo monociti non legate tra diverse monostrati di cellule endoteliali inciderà notevolmente sulla vicinanza dei risultati di repliche e la riproducibilità dei risultati tra i campioni . Più di recente, diversi sistemi che pompano monociti in media attraverso un monostrato di cellule endoteliali sono stati usati per affrontare questo problema 9. Inoltre, questi sistemi di flusso anche ricapitolano l'effetto della forza di taglio sulle cellule endoteliali. Mentre i vantaggi di tali sistemi sono chiare e molto attraente, è anche importante rendersi conto che mentre adesività cellule endoteliali può essere notevolmente aumentata, come nel caso in infiammazione acuta, da fattori come TNFa, alcuni altri attivatori, come le radiazioni ionizzanti 10 suscitare cambia tcappello non sono prontamente rilevate in tempi sperimentali in vitro da questi sistemi molto rigorosi. Mentre tali modifiche minime di adesività delle cellule endoteliali sono facilmente perso o revocati in vitro, non è necessariamente benigna in vivo, in cui tali piccoli cambiamenti in un tempo di vita, che è caratteristico di infiammazione cronica, possono esercitare risultati molto significativi. Quindi un metodo robusto, ma sensibile e specifico per rilevare e misurare è necessaria l'adesività delle cellule endoteliali.Qui riportiamo un metodo per misurare l'adesività delle cellule endoteliali direttamente. Questo metodo non si basa sulla misura della fluorescenza come indicatore indiretto di surrogata adesività cellule endoteliali. Esso rivela se i cambiamenti in adesività sono dovuti al cambiamento uniforme in tutte le cellule o confinato in una sotto-popolazione. Inoltre, esso permette co-colorazione di cellule endoteliali con marcatori come senescenza associata beta-galattosidasi, vitalità cellulare marker, Calcien AM e anticorpi contro superficie delle cellule e proteine intracellulari, permettendo l'associazione di singole cellule endoteliali adesivi per certi stati cellulari o espressione di proteine specifiche.
Il dosaggio monociti sopra descritta è stata utilizzata con successo in esperimenti volti a studiare gli effetti biologici delle radiazioni ionizzanti su monostrati endoteliali 10. Anche se questo non è l'unico metodo disponibile per valutare l'adesività di un monostrato endoteliale, è l'unico metodo che consente la quantificazione della proporzione o percentuale di cellule endoteliali in un monostrato che è adesivo. Questa è una distinzione importante come cambiamento quantitativo globale nell'adesione dei monociti, come misurato mediante altri metodi può essere attribuito sia a un aumento generale adesività di tutte le cellule del monostrato endoteliale o all'aumento adesività di un sub-popolazione di cellule endoteliali all'interno del monostrato, come mostrato nell'esempio precedente. Il valore di avere queste informazioni è esemplificato dal fatto che la capacità di quantificare la percentuale di cellule endoteliali che mostravano una maggiore adesività dopo irradiazione portato ai inesconclusione capace che questo effetto non è dovuta a mutazione genetica di un particolare gene come la percentuale di cellule che erano adesivo erano notevolmente sopra (oltre 1.000 volte di più) quella che ci si aspetterebbe da mutazione casuale di un gene da X-radiazione a tale dose .
Il fattore che consente una buona riproducibilità dei risultati è il regime di lavaggio. Poiché la procedura di lavaggio prevede l'immersione del vetrino di vetro nel tampone di lavaggio seguito da tamponando su un tessuto, la variabilità nella turbolenza tampone che deriva inevitabilmente dal vecchio metodo di pipettamento del tampone di lavaggio in un pozzo è evitata. Infatti è stato l'osservazione di una eccessiva variabilità tra le repliche ottenuti con il metodo di pipettaggio che ci costretto ad ideare un procedimento di lavaggio che ha rimosso l'elemento di variabilità della fase di lavaggio.
Certo, i limiti di questo saggio si trovano nella necessità di effettuare conteggio manuale dei grappoli monociti, che fanno not permettono di essere adattato per analisi ad alta produttività. In secondo luogo, la decisione su quanti monociti costituiscono un cluster deve essere determinato semi-arbitrariamente e il livello può essere troppo elevata e provocare l'esclusione di alcuni cluster veri. La mancanza di forza di taglio in questo metodo può anche essere visto come una limitazione in esperimenti in cui grossolanamente maggiore adesività delle cellule endoteliali è indotta (ad esempio, + TNFa). In altre situazioni, tuttavia, la mancanza di forza di taglio è un vantaggio in quanto permette di rilevare meno esagerato aumento della adesività. Modesto aumento dei monociti adesività può essere particolarmente importante e rilevante. In vivo, monociti non sarebbero (in un tipico tempo sperimentale) può aspettare per fissare in gran numero alle cellule endoteliali con modesto aumento della adesività, in gran parte dovuto al taglio forza. Nel tempo, tuttavia, alcuni monociti probabilmente sarebbe, e questo è più probabile per rappresentare l'ambiente di infiammazione cronica. Come tale,l'assenza di forza di taglio può essere un vantaggio in quanto offre l'opportunità per i piccoli aumenti di adesività delle cellule endoteliali per essere rivelato in tempi sperimentali, che sono in genere di breve e forse troppo fugace per consentire modesto aumento della adesività da osservare sotto sforzo di taglio.
La possibilità di sottoporre le cellule dopo questo saggio ad altre analisi come senescenza dosaggio e immunofluorescenza aumenta l'utilità di questo metodo in quanto consente l'associazione di adesività di specifiche cellule endoteliali a particolari proteine cellulari o stati cellulari come dimostrato sopra, una caratteristica che non è disponibile con i saggi di adesione più anziani.
Questo metodo è stato utilizzato con celle coronariche umane immortalizzate est2 endoteliali e risultati simili sono stati ottenuti anche con cellule primarie umane endoteliali coronariche 10, dimostrando che non è specifico per un solo particolare linea cellulare. Inoltre, il rumoreption di questo metodo di saggiare adesività delle cellule endoteliali non preclude sottoporre le stesse cellule per saggio di adesione standard che misura la fluorescenza di immunociti etichettati. Insieme, questo rapporto dimostra che questo metodo è versatile, inclusiva e fornisce molte più informazioni di quanto il test di adesione standard.
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |