We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.
En av kardinal prosesser av betennelse er infiltrasjon av immunceller fra hulrommet i blodkaret til det omgivende vev. Dette skjer når endotelceller, hvilken linje blodkar, blir limet til sirkulerende immunceller slik som monocytter. In vitro måling av denne klebeevne har frem til nå blitt gjort ved å kvantifisere det totale antall monocytter som fester seg til en endotelial sjiktet enten som en direkte telling eller ved indirekte måling av fluorescensen av adherente monocytter. Selv om slike målinger, indikerer at den gjennomsnittlige klebrighet endotelial cellepopulasjon, er de skamme av en rekke faktorer, så som celleantall, og avslører ikke andelen av endotelceller som faktisk er limet. Her beskriver vi og vise en metode som gjør det mulig opptellingen av selvklebende celler i en testet befolkning på endothelial enkeltlag. Endoteliale celler blir dyrket på dekkglass, og følgende ønskedebehandling blir utfordret med monocytter (som kan være fluorescensmerket). Etter inkubasjon en skylling prosedyre som involverer flere runder med nedsenking og drenering, blir cellene fiksert. Selvklebende endotelceller, som er omgitt av monocytter blir lett identifiseres og nummerert, noe som gir en adhesjon indeks som viser den faktiske andel av endoteliale celler i populasjonen som er limet.
Infiltrasjon av immunceller som monocytter over endotelceller lag som linje blodkar er et viktig skritt i prosessen med betennelse 1. Dette gjør at homing av immunceller (immunocytter) til et skadested. I andre tilfeller og steder som kransarterien og halspulsåren, kan infiltrering av monocytter gjennom endoteliale sjikt føre til uønsket lang sikt oppholdstid av disse cellene i veggen av arterien, som kan føre til dannelsen av plakk 2. I alle tilfeller av immunocytt infiltrering, innebærer det første trinnet aktivering av endotelcellene i et lokalisert område i blodkaret. Endotelceller aktiveres av pro-inflammatoriske cytokiner som TNF-α og IL-6 for å øke ekspresjonen av celleoverflateproteiner som for eksempel VCAM, ICAM og E-selektin som letter rekruttering og feste av immunocytter på endotelcelleoverflaten, hvorved 3- 6.
<p class = "jove_content"> å begynne med måling av endotelial celleadhesjon ble utført ved telling av monocytter som klebet til endotele monolag 7. Begrensningene ved denne metoden når det gjelder presisjon ført til bruk av radiomerket lymfocytt eller monocytt, etterfulgt av kvantifisering av radioaktivt materiale som tilsvarer lymfocytter eller monocytter adhesjon 4. Denne metoden ble etter hvert erstattet av en fluorescens-basert metode, hvorved immunocytter av interesse ble merket med fluorescens fargestoff og utsatt for den samme prosedyren som ovenfor med den forskjell at i stedet for fluorescens radioaktiviteten måles 8. Tiden denne metoden har dukket opp som den mest praktiske og selges som byggesett av flere kommersielle leverandører. Selv om denne assay kan måle relative nivåer av klebrig mellom kontroller og eksperimentelle eksempler, vil det ikke avsløre om en endring i fluorescens er på grunn av en jevn endring i klebeevnen på tvers av hele endothelial cellepopulasjon, eller hvis endringen skyldes en forskjell på klebrighet i løpet av en sub-populasjon av celler. Det er også tydelig at stringens vaske utøver en dyp effekt på resultatet, og enda viktigere, vil enhetlig skylling av ubundne monocytter mellom ulike endothelial cellemonolag påvirke sterkt på nærhet av resultater fra replikater og reproduserbarhet av resultatene mellom prøvene . Mer nylig ble flere systemer som pumper monocytter i media over en endotelial celle monolag brukt for å løse dette problemet 9. I tillegg er disse strømningssystemer også rekapitulere virkningen av skjærkraft på endotelceller. Mens fordelene ved slike systemer er klar og meget tiltalende, er det også viktig å innse at selv kan endotelcelle klebrighet bli sterkt utvidet, slik tilfellet er i akutt inflammasjon, av faktorer slik som TNFa, noen andre aktivatorer, slik som ioniserende stråling 10 Elicit endrer that er ikke lett oppdages innen in vitro eksperimentelle tidsrammer av disse svært strenge systemer. Selv om slike små endringer av endotelial celle klebrighet er lett tapt eller avvist in vitro, er det ikke nødvendigvis godartet in vivo, hvor slike små endringer innenfor en levetid, som er karakteristisk for kronisk betennelse, kan utøve meget betydelige resultater. Derav en robust, men likevel følsom og spesifikk metode for å detektere og måle endotelcelletype klebeevnen er nødvendig.Her rapporterer vi en metode for å måle klebeevnen av endotelceller direkte. Denne metoden ikke er avhengig av måling av fluorescens som en indirekte surrogat indikator på endotelceller klebrighet. Det avslører om endringer i klebrighet skyldes uniform endring på tvers av alle celler eller begrenset til en sub-populasjon. Videre gir det co-farging av endotelceller med markører som senescens-assosiert beta-galaktosidase, celleviabilitet Marker, Calcien AM og antistoffer mot celleoverflate og intracellulære proteiner, slik at foreningen av de enkelte klebe endotelceller til visse celle tilstander eller ekspresjonen av spesifikke proteiner.
The monocyte adhesion assay described above was used successfully in experiments designed to study the biological effects of ionizing radiation on endothelial monolayers10. Although this is not the only method available to assess the adhesiveness of an endothelial monolayer, it is the only method that allows the quantification of the proportion or percentage of endothelial cells within a monolayer that is adhesive. This is an important distinction as a global quantitative change in adhesion of monocytes, as measured by other methods can be attributed either to a general rise in adhesiveness of all cells of the endothelial monolayer or to the increase adhesiveness of a sub-population of endothelial cells within the monolayer, as shown in the example above. The value of having this information is exemplified by the fact that the ability to quantify the percentage of endothelial cells that exhibited enhanced adhesiveness after irradiation led to the inescapable conclusion that this effect is not due to genetic mutation of a particular gene as the percentage of cells that were adhesive were greatly above (over 1,000 times more) that which would be expected from random mutation of a gene by X-radiation at that dose.
The factor that allows good reproducibility of the results is the washing regime. As the washing procedure involves the immersion of the glass coverslip into the wash buffer followed by dabbing on a tissue, variability in the buffer turbulence which inevitably arises from the old method of pipetting of the wash buffer into a well is avoided. Indeed it was the observation of excessive variability between replicates obtained using the pipetting method that compelled us to devise a washing procedure that removed the variability element from the washing step.
Admittedly, the limitations of this assay lie in the need to carry out manual count of monocyte clusters, which do not allow it to be adapted for high throughput analyses. Secondly, the decision on how many monocytes constitute a cluster has to be determined semi-arbitrarily and the level may be set too high and result in the exclusion of some genuine clusters. The lack of shear force in this method can also be viewed as a limitation in experiments in which grossly enhanced adhesiveness of endothelial cells is induced (e.g., +TNFα). In other situations however, the lack of shear force is an advantage as it allows the detection of less exaggerated augmentation of adhesiveness. Modest increase in monocyte adhesiveness can be particularly important and relevant. In vivo, monocytes would not (in a typical experimental time) be expected to attach in great numbers to endothelial cells with modest increase in adhesiveness, largely due to shear force. In time however, some monocytes probably would, and this is more likely to represent the environment of chronic inflammation. As such, the absence of shear force can be an advantage as it provides the opportunity for small increases in endothelial cell adhesiveness to be revealed in experimental time frames which are typically short and possibly too fleeting to allow modest increase in adhesiveness to be observed under shear stress.
The ability to subject the cells after this assay to other analyses such as senescence assay and immunofluorescence staining increases the usefulness of this method as it allows the association of adhesiveness of specific endothelial cells to particular cellular proteins or cellular states as demonstrated above, a feature that is not available with the older adhesion assays.
This method has been used with est2-immortalised human coronary endothelial cells and similar results were also obtained with primary human coronary endothelial cells10, demonstrating that it is not specific to just a particular cell line. Also, the adoption of this method of assaying adhesiveness of endothelial cells do not preclude subjecting the same cells to the standard adhesion assay that measures fluorescence of labeled immunocytes. Together, this report demonstrates that this method is versatile, inclusive and provides much more information than the standard adhesion assay.
The authors have nothing to disclose.
We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Hepes Buffered Saline Solution (HBSS) | Sigma | H6648 | |
Glass coverslips Round 12mm Diameter | Menzel-Glaser | CB00120RA1 | |
24-well cluster plate | Costar | 3526 | |
Meso-Endo Cell media | Cell Applications | 212-500 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
Soybean trypsin inhibitor | Life Technologies | 17075-029 | |
Cell Tracker Green | Life Technologies | C7025 | |
RPMI | Sigma | R8758 | |
Foetal Calf Serum | Life Technologies | 10500064 | |
Beta glasctosidase Assay kit | CellSignaling | 9860 | |
Fibronectin | Sigma | F0895 |