This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.
Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of ‘Synaptic Tagging and Capture’ (STC), where the PRPs interact with recently active, ‘tagged’ synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated ‘tagged’ synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate ‘tags’18 and ‘PRPs’19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for ‘tag’ and ‘PRP’ respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD – the “synaptic cross-tagging”22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22.
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
Tranche de l'hippocampe aiguë est un excellent modèle pour l'étude de la LTP et d'autres processus de plasticité fonctionnels tels que STC et de contre-capture. Elle conserve une grande partie du réseau structurel laminaire des circuits de l'hippocampe, permet emplacements des électrodes précis et offre à côté, une plate-forme ouverte pour la manipulation neuropharmacologique rapide sans barrière hémato-encéphalique.
Cet article décrit la méthodologie pour la préparation des tranches d'hippocampe aigus viables à partir de jeunes rats adultes et de les utiliser pour enquêter STC et croix-tagging. Une recherche antérieure a souligné que le sexe et l'âge des animaux sont des facteurs importants à considérer pour une utilisation dans les études d'électrophysiologie. 27,28 conséquent animaux adultes, jeunes avec des fonctions de récepteurs adultes pleinement exprimées (rats Wistar mâles âgés de 5-7 semaines) sont utilisés. 23 asymétries dans les connexions entre l'hippocampe gauche et droite ont été notés chez les rongeurs 29 etde grandes différences dans l'expression des récepteurs NMDA ont été rapportés ainsi 34. Nous avons utilisé l'hippocampe droit afin d'être compatible avec nos études précédentes LTP. 23,32 Cependant, que ce soit des hippocampes peut être utilisé aussi longtemps que la cohérence est maintenue.
Comme dans tout protocole, il est très important d'effectuer l'isolement et trancher rapidement les procédures mais en prenant soin que le tissu est pas étiré, endommagé, rendu sec ou hypoxique. Les variations de pH, la température et la composition ionique des solutions peuvent avoir effet profond sur la viabilité des tranches et les résultats. D'où de telles variations doivent être évités. Il a été observé que la libération de glutamate de calcium dépendant du récepteur se produisant au cours des étapes de préparation de façon irréversible peut affecter la synthèse des protéines dans les tissus nerveux 35,36, 37. Utilisation de trancheuses manuelles de tissu peut aider à minimiser ce en permettant au processus soit terminé très rapidement par rapport à vibraslicers. Cependant, de nombreux laboratoires utilisent aussi efficacement vibraslicers avec les précautions nécessaires pour préserver la viabilité tranche. Un autre facteur important à considérer est la longue période d'incubation avant de commencer les expériences. Cela a été noté pour être vraiment crucial pour parvenir à la stabilité des taux métaboliques de l'Etat et d'activation de la kinase dans les tranches après la perturbation provoquée lors de la préparation 23. Une telle stabilité est nécessaire pour la cohérence des enregistrements de longue durée. Nous soulignons de nouveau sur cette observation et suggérons les heures d'environ 3 heures d'incubation longues.
Une variété de paramètres de stimulation sont connus pour induire la LTP, mais les mécanismes moléculaires induits dans chaque cas peut ne pas être le même (pour revue, voir 38). Cela peut influer sur la durabilité et d'autres caractéristiques de la LTP, qui, à leur tour, peuvent affecter les résultats des expériences de marquage et de capture synaptiques. Par conséquent, il est important de valider les paradigmes de stimulation et caractéristiquesde la LTP obtenue dans des conditions de laboratoire performant et maintenir la cohérence.
En général, nous ne considérons pas les expériences avec de très grandes volées de fibres présynaptiques et fEPSPs maximale inférieure à 0,5 mV et les expériences impliquant des changements substantiels dans la reprise de volée de fibre pendant les enregistrements sont également rejetées. En outre, tout en réalisant des expériences de deux ou trois voie-voie, il est important de veiller à l'indépendance de la voie. Ceci peut être réalisé avec une double choc protocole de facilitation 28.
Un inconvénient des systèmes d'enregistrement de l'interface est la formation de gouttelettes de condensation sur les électrodes pendant les heures d'enregistrements de longue durée en raison des différences de température et d'humidité entre la chambre et les environs. Ces gouttelettes doivent être soigneusement effacé de temps à autre. Sinon, les gouttelettes peuvent couler sur les tranches et provoquer des perturbations ou même la perte de signaux. Nous abordons habituellement ce by buvard habilement les gouttelettes guidées sous le microscope en utilisant un mince papier filtre mèche, sans toucher les électrodes. Cependant, la meilleure solution serait d'utiliser un système de chauffage centralisé, tels que le système de télépéage mis au point par des chercheurs de l'Université d'Edimbourg.
Sur une note finale, une variété de méthodologies existent dans les laboratoires du monde entier qui sont utilisés pour la préparation des tranches d'hippocampe pour différentes fins expérimentales. Chaque procédure de l'offre certains avantages sur l'autre. Il faut optimiser attentivement les moindres détails du protocole pour répondre à l'objectif de l'expérience. Nous espérons que cet article contribue à améliorer certains aspects de la méthodologie pour étudier les processus fin associatif tels que STC et de contre-capture.
The authors have nothing to disclose.
This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 – T1-2012 Oct -02).
I. Dissection Tools | |||
1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
BC100R | |||
3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
B-Braun/Aesculap, Germany | |||
BB73 | |||
5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
II. ACSF component chemicals | |||
1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
III. Electrophysiology Instruments | |||
1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
00-42-102-0000 (MM-32) | |||
12. Electrodes | AM Systems, USA | 571000 (Stainless steel; 0.010, 5MΩ, 8 degree) |