This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.
Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of ‘Synaptic Tagging and Capture’ (STC), where the PRPs interact with recently active, ‘tagged’ synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated ‘tagged’ synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate ‘tags’18 and ‘PRPs’19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for ‘tag’ and ‘PRP’ respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD – the “synaptic cross-tagging”22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22.
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
Corte de hipocampo aguda es un excelente sistema modelo para el estudio de LTP y otros procesos de plasticidad funcionales tales como STC y transversal de captura. Se conserva gran parte de la red estructural laminar de los circuitos del hipocampo, permite localizaciones de los electrodos precisos y ofrece al lado, una plataforma abierta para la rápida manipulación neurofarmacológico sin una barrera sangre-cerebro.
En este artículo se describe la metodología para la preparación de cortes de hipocampo agudas viables de ratas adultas jóvenes y utilizarlos para investigar STC y cross-tagging. Investigaciones anteriores han hecho hincapié en que el género y la edad de los animales son factores importantes a considerar para su uso en estudios de electrofisiología. Se utilizan 27,28 animales adultos tanto jóvenes con las funciones de los receptores adultos plenamente expresadas (ratas Wistar machos de entre 5-7 semanas). 23 Asimetrías en las conexiones entre el hipocampo izquierdo y derecho se han observado en los roedores y 29principales diferencias en la expresión del receptor de NMDA han sido reportados como bien 34. Hemos utilizado el hipocampo derecho con el fin de ser coherente con nuestros estudios anteriores LTP. 23,32 Sin embargo, ninguno de los hipocampos se puede utilizar siempre y cuando se mantenga la coherencia.
Como en cualquier protocolo, es muy importante para llevar a cabo el aislamiento y cortar procedimientos rápidamente, pero teniendo cuidado de que el tejido no se estira, dañado, rindió seco o hipóxica. Las variaciones en el pH, la temperatura y la composición iónica de las soluciones pueden tener un efecto profundo sobre la viabilidad de las rebanadas y los resultados. Por lo tanto tales variaciones deben ser evitados. Se ha observado que la liberación de calcio dependiente del receptor de glutamato que ocurren durante las etapas de preparación puede afectar irreversiblemente la síntesis de proteínas en el tejido nervioso 35,36, 37. El uso de máquinas de cortar tejidos manuales puede ayudar a minimizar este al permitir que el proceso se complete muy rápidamente en comparación con vibraslicers. Sin embargo, muchos laboratorios también utilizan efectivamente vibraslicers con las precauciones necesarias para preservar la viabilidad de la rebanada. Otro factor importante a considerar es el largo período de incubación antes de comenzar los experimentos. Esto se ha observado que es realmente crucial para lograr la estabilidad en los niveles estatales y activación quinasa metabólicos en las rebanadas después de la perturbación causada durante la preparación 23. Dicha estabilidad es necesaria para mantener la coherencia en las grabaciones de larga duración. Nos re-enfatizar en esta observación y sugerimos las largas horas de incubación de alrededor de 3 horas.
Una variedad de parámetros de estimulación son conocidos para inducir LTP, pero los mecanismos moleculares provocados en cada caso puede no ser el mismo (para revisión ver 38). Esto puede influir en la durabilidad y otras características de la LTP, que, a su vez, pueden afectar los resultados de marcado y captura experimentos sinápticas. Por lo tanto es importante validar los paradigmas y las características de estimulacióndel suscitó LTP en las condiciones del laboratorio que realice y mantener la consistencia.
Por lo general, no consideramos experimentos con grandes salvas de fibras presinápticas y con fEPSPs máximas de menos de 0,5 mV y los experimentos que implican cambios sustanciales en la volea de fibra durante las grabaciones también se rechazan. Además, aunque la realización de la vía de dos o tres experimentos de la vía, es importante para garantizar la independencia vía. Esto puede llevarse a cabo con un protocolo de facilitación dos pulsos 28.
Una desventaja de los sistemas de grabación de interfaz es la formación de gotas de condensación en los electrodos durante las horas de grabación largos debido a las diferencias de temperatura y humedad entre la cámara y los alrededores. Estas gotitas deben ser cuidadosamente borrado de vez en cuando. De lo contrario, las gotitas pueden gotear sobre las rebanadas y causar perturbación o incluso la pérdida de señales. Por lo general, abordamos este by secante hábilmente las gotitas guiadas bajo el microscopio utilizando una delgada mecha de papel de filtro, sin tocar los electrodos. Sin embargo, la mejor solución sería utilizar un sistema de calefacción centralizada, tal como el sistema ETC desarrollado por la Universidad de Edimburgo investigadores.
En una nota final, existe una variedad de metodologías en los laboratorios de todo el mundo que se utilizan para la preparación de cortes de hipocampo para diferentes propósitos experimentales. Cada uno de los procedimiento ofrece algunas ventajas sobre el otro. Uno tiene que optimizar cuidadosamente los detalles minuciosos de el protocolo para adaptarse a la finalidad del experimento. Esperamos que este artículo le ayuda en la mejora de algunos aspectos de la metodología para el estudio de los procesos asociativos tardías como STC y transversal de captura.
The authors have nothing to disclose.
This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 – T1-2012 Oct -02).
I. Dissection Tools | |||
1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
BC100R | |||
3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
B-Braun/Aesculap, Germany | |||
BB73 | |||
5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
II. ACSF component chemicals | |||
1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
III. Electrophysiology Instruments | |||
1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
00-42-102-0000 (MM-32) | |||
12. Electrodes | AM Systems, USA | 571000 (Stainless steel; 0.010, 5MΩ, 8 degree) |