This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.
Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of ‘Synaptic Tagging and Capture’ (STC), where the PRPs interact with recently active, ‘tagged’ synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated ‘tagged’ synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate ‘tags’18 and ‘PRPs’19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for ‘tag’ and ‘PRP’ respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD – the “synaptic cross-tagging”22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22.
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
Fatia hipocampal aguda é um excelente sistema modelo para o estudo da LTP e outros processos de plasticidade funcionais, tais como STC e captura-cruzada. Ela conserva grande parte da rede estrutural laminar dos circuitos do hipocampo, permite que os locais precisos de eléctrodos e oferece ao lado, uma plataforma aberta para manipulação neurofarmacológica rápida sem a barreira sangue-cérebro.
Este artigo descreve a metodologia para a preparação de fatias do hipocampo agudas viáveis de ratos adultos jovens e usá-los para investigar STC e cross-tagging. Pesquisas anteriores já haviam enfatizado que o sexo ea idade dos animais são factores importantes a considerar para uso em estudos de eletrofisiologia. 27,28 Portanto animais jovens adultos com funções de receptores adultos plenamente expressos (ratos Wistar machos com idade entre 5-7 semanas) são utilizados. 23 Assimetrias nas ligações entre o hipocampo esquerdo e direito foram observados em roedores e 29grandes diferenças na expressão do receptor de NMDA têm sido relatados como bem 34. Usámos o hipocampo direito, a fim de ser compatível com os nossos estudos anteriores LTP. 23,32 No entanto, qualquer um dos hipocampos pode ser usado contanto que a consistência é mantida.
Como em qualquer protocolo, é muito crucial para realizar o isolamento e corte de procedimentos rapidamente, mas tomando cuidado para que o tecido não é esticado, danificado, seja seco ou hipóxica. As variações do pH, da temperatura e da composição iónica das soluções podem ter um efeito profundo sobre a viabilidade das fatias e os resultados. Assim tais variações devem ser evitados. Tem sido observado que a libertação de glutamato dependente do receptor de cálcio que ocorre durante as etapas de preparação pode afectar irreversivelmente a síntese de proteína no tecido nervoso 35,36, 37. Usando máquinas de corte de tecido manuais pode ajudar a minimizar este, permitindo que o processo esteja concluído muito rapidamente em comparação com VIbraslicers. No entanto, muitos laboratórios também utilizam efetivamente vibraslicers com as precauções necessárias para preservar a viabilidade fatia. Outro fator importante a considerar é o longo período de incubação antes do início dos experimentos. Isto foi anotado para ser realmente crucial para alcançar a estabilidade em níveis estadual e ativação da quinase metabólicas em fatias após a perturbação causada durante a preparação 23. Essa estabilidade é necessária para a consistência em gravações a longo prazo. Nós re-enfatizar nesta observação e sugerir as horas de incubação longo de cerca de 3 horas.
Uma variedade de parâmetros de estimulação são conhecidos por induzir LTP, mas os mecanismos moleculares induzidos em cada caso pode não ser o mesmo (para revisão ver 38). Este pode influenciar a durabilidade e outras características da LTP, que, por sua vez, pode afectar os resultados de experiências de marcação e de captura sinápticos. Por isso, é importante validar os paradigmas de estimulação e característicasda LTP evocados sob as condições do laboratório que realiza e manter a consistência.
Nós geralmente não consideram experiências com grandes rajadas de fibra pré-sinápticos e com fEPSPs máximos inferiores a 0,5 mV e as experiências que envolvem mudanças substanciais no vôlei de fibra durante as gravações também são rejeitadas. Além disso, durante a realização de duas ou três vias vias experiências, é importante para assegurar a independência via. Esta pode ser levada a cabo com um protocolo de facilitação de pulso emparelhado-28.
Uma desvantagem dos sistemas de registro de interface é a formação de gotículas de condensação sobre os eletrodos durante as horas de gravações longas, devido às diferenças de temperatura e umidade entre a câmara e os arredores. Estas gotículas devem ser cuidadosamente transferidas ao longo do tempo. Caso contrário, as gotículas podem escorrer para as fatias e causar perturbação ou mesmo perda de sinais. Costumamos fazer face a este by habilmente secar as gotículas guiadas sob o microscópio usando um pavio papel de filtro fino, sem tocar os eletrodos. No entanto, a melhor solução seria a utilização de um sistema de aquecimento centralizado, tais como o sistema de ETC desenvolvido por investigadores da Universidade de Edimburgo.
Em uma nota final, uma variedade de metodologias existem nos laboratórios de todo o mundo que são utilizados para a preparação de fatias do hipocampo para diferentes fins experimentais. Cada um dos procedimento oferece algumas vantagens sobre o outro. Uma das necessidades para otimizar cuidadosamente os detalhes minuciosos de o protocolo de acordo com o objectivo da experiência. Esperamos que este artigo ajuda a melhorar alguns aspectos da metodologia para o estudo de processos atrasados associativa como STC e-captura cruz.
The authors have nothing to disclose.
This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 – T1-2012 Oct -02).
I. Dissection Tools | |||
1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
BC100R | |||
3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
B-Braun/Aesculap, Germany | |||
BB73 | |||
5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
II. ACSF component chemicals | |||
1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
III. Electrophysiology Instruments | |||
1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
00-42-102-0000 (MM-32) | |||
12. Electrodes | AM Systems, USA | 571000 (Stainless steel; 0.010, 5MΩ, 8 degree) |