This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.
Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of ‘Synaptic Tagging and Capture’ (STC), where the PRPs interact with recently active, ‘tagged’ synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated ‘tagged’ synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate ‘tags’18 and ‘PRPs’19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for ‘tag’ and ‘PRP’ respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD – the “synaptic cross-tagging”22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22.
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
شريحة الحصين الحادة هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة LTP والعمليات اللدونة الفنية الأخرى مثل STC وعبر الالتقاط. أنه يحفظ الكثير من الشبكة الهيكلية الصفحي من الدوائر الحصين، يسمح المواقع القطب دقيقة وتقدم إلى جانب، منصة مفتوحة للتلاعب neuropharmacological السريع دون حاجز الدم في الدماغ.
توضح هذه المقالة منهجية لإعداد شرائح الحصين الحادة قابلة للحياة من الفئران الشباب البالغين واستخدامها لتحقيق STC وعبر العنونة. وقد أكدت الأبحاث السابقة أن نوع الجنس والعمر للحيوانات من العوامل الهامة التي يجب مراعاتها لاستخدامها في الدراسات الكهربية. وتستخدم 27،28 الحيوانات الكبار لذلك الشباب مع وظائف مستقبلات الكبار أعرب بالكامل (فئران ويستار الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 5-7 أسابيع). 23 عدم التماثل في الاتصالات بين الحصين اليسار واليمين وقد لوحظ في القوارض و29تم الإبلاغ عن اختلافات كبيرة في NMDA مستقبلات التعبير وكذلك 34. وقد استخدمنا الحصين الأيمن من أجل أن تكون متسقة مع دراساتنا LTP السابقة. 23،32 ومع ذلك، أي من الحصين يمكن استخدامها طالما يتم الحفاظ على الاتساق.
كما هو الحال في أي بروتوكول، فمن المهم جدا لأداء العزل وتقطيع الإجراءات بسرعة ولكن مع الحرص على أن لا تمدد الأنسجة التالفة، وأصدرت جافة أو ميتة. الاختلافات في درجة الحموضة ودرجة الحرارة والتركيب الايوني من الحلول يمكن أن يكون لها تأثير عميق على الجدوى من شرائح والنتائج. وبالتالي ينبغي تجنب مثل هذه الاختلافات. وقد لوحظ أن الغلوتامات إطلاق الكالسيوم التي تعتمد على مستقبلات التي تحدث خلال خطوات إعداد يمكن أن تؤثر بشكل لا رجعة فيه تخليق البروتين في الأنسجة العصبية 35،36، 37. ويمكن استخدام ماكينات تقطيع النسيج اليدوي تساعد على تقليل ذلك عن طريق السماح للعملية أن يتم الانتهاء بسرعة جدا بالمقارنة مع السادسbraslicers. ومع ذلك، العديد من المختبرات أيضا تستخدم على نحو فعال vibraslicers مع الاحتياطات اللازمة للحفاظ على سلامة شريحة. ثمة عامل آخر مهم هو أن تنظر إلى فترة حضانة طويلة قبل بدء التجارب. وقد لوحظ أن يكون حاسما حقا لتحقيق الاستقرار في مستويات الدولة وتفعيل كيناز التمثيل الغذائي في شرائح بعد أن تسبب الاضطرابات أثناء إعداد 23. هذا الاستقرار ضروري من أجل التناسق في التسجيلات على المدى الطويل. نعيد التأكيد على هذه الملاحظة واقتراح الساعات حضانة طويلة حوالي 3 ساعات.
ومن المعروف أن العديد من المعلمات التحفيز للحث على LTP، ولكن الآليات الجزيئية أثارت في كل حالة قد لا تكون هي نفسها (للمراجعة نرى 38). هذا يمكن أن تؤثر على متانة وغيرها من خصائص LTP التي، بدورها، يمكن أن تؤثر على نتائج متشابك علامات والقبض على التجارب. وبالتالي فمن المهم للتحقق من صحة نماذج التحفيز وخصائصمن LTP المنتزعة تحت ظروف المختبر الأداء والحفاظ على الاتساق.
ونحن عموما لا تعتبر التجارب مع كبير جدا وابلا من الألياف قبل المشبكي ومع fEPSPs القصوى أقل من 0.5 فولت والتجارب التي تنطوي على تغييرات كبيرة في كرة الألياف أثناء يتم رفض أيضا التسجيلات. وعلاوة على ذلك، في حين أن أداء مسار اثنين أو ثلاثة مسار-التجارب، فمن المهم لضمان استقلال الطريق. هذا يمكن القيام بها مع إقران النبض بروتوكول التيسير 28.
واحد السلبي للنظم تسجيل واجهة هو تشكيل قطرات التكثيف على الأقطاب خلال ساعات تسجيل طويلة بسبب الاختلافات في درجات الحرارة والرطوبة بين الغرفة والمناطق المحيطة بها. تحتاج هذه القطرات إلى أن نشف بعناية من وقت لآخر. وإلا فإن قطرات يمكن أن يتقطر على شرائح وتؤدي إلى اضطراب أو حتى فقدان الإشارات. نعالج هذه عادة بذ النشاف بمهارة قطرات تسترشد تحت المجهر باستخدام ورق الترشيح مرهف الفتيل، دون لمس الأقطاب الكهربائية. ومع ذلك، فإن أفضل حل هو استخدام نظام التدفئة المركزية، مثل نظام ETC التي وضعها الباحثون في جامعة أدنبرة.
وعلى صعيد الختامية، ومجموعة متنوعة من المنهجيات موجودة في المختبرات في جميع أنحاء العالم التي تستخدم لإعداد شرائح الحصين لأغراض تجريبية مختلفة. كل من الإجراء يقدم بعض المزايا على الآخر. واحد يحتاج إلى تحسين بعناية التفاصيل الدقيقة للبروتوكول لتتناسب مع الغرض من التجربة. نأمل أن هذه المادة تساعد في تحسين بعض جوانب المنهجية لدراسة العمليات في وقت متأخر من النقابي مثل STC وعبر الالتقاط.
The authors have nothing to disclose.
This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 – T1-2012 Oct -02).
I. Dissection Tools | |||
1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
BC100R | |||
3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
B-Braun/Aesculap, Germany | |||
BB73 | |||
5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
II. ACSF component chemicals | |||
1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
III. Electrophysiology Instruments | |||
1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
00-42-102-0000 (MM-32) | |||
12. Electrodes | AM Systems, USA | 571000 (Stainless steel; 0.010, 5MΩ, 8 degree) |