This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.
Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of ‘Synaptic Tagging and Capture’ (STC), where the PRPs interact with recently active, ‘tagged’ synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated ‘tagged’ synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate ‘tags’18 and ‘PRPs’19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for ‘tag’ and ‘PRP’ respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD – the “synaptic cross-tagging”22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22.
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
急性海馬スライスは、LTPや、STC、クロスキャプチャなどの他の機能的可塑性のプロセスの研究のための優れたモデル系です。それは、海馬の回路の層構造のネットワークの多くを保存し、正確な電極位置を可能にし、血液脳関門なし、と並んで迅速な神経薬理学的操作のためのオープンプラットフォームを提供しています。
この記事では、若い成体ラットから実行可能な急性海馬スライスの調製のための方法論を説明し、STCとクロスタグ付けを調査するためにそれらを使用。これまでの研究は、性別や動物の年齢は電気生理学的研究で使用するために考慮すべき重要な因子であることを強調している。完全に表現成人受容体の機能(5-7週齢のWistar系雄性ラット)で27,28したがって、若い成体動物が使用されている。23非対称性左右の海馬との間の接続にげっ歯類29で指摘されており、NMDA受容体の発現に大きな違いがよく34として報告されています。私たちは以前のLTPの研究と一致するために、右海馬を使用している。23,32しかしながら、海馬のいずれかがあれば、整合性が維持されているとして使用することができます。
任意のプロトコルのように、それは、単離および組織が、伸び損傷し、乾燥または低酸素レンダリングされませんすぐに手続きをスライスするが世話を行うことが非常に重要です。 pH、温度および溶液のイオン組成の変化はスライスし、結果の実行可能性に大きな影響を持つことができます。したがって、このような変動は、避けるべきです。これは、製造工程中に発生するグルタミン酸受容体依存性カルシウム放出の不可逆的神経組織35,36、37でタンパク質合成に影響を与えることができることが観察されました。マニュアル組織スライサーを使用すると、VIと比較して非常に迅速に完了するためのプロセスを可能にすることにより、これを最小化するのを助けることができますbraslicers。しかし、多くの研究室にも効果的にスライスの生存率を維持するために必要な予防措置をvibraslicersを使用しています。考慮すべきもう一つの重要な要因は、実験を開始する前に、長い潜伏期間です。これは準備23時に発生する擾乱後のスライスにおける代謝状態およびキナーゼ活性化レベルの安定性を達成するために本当に重要であることが指摘されています。このような安定性は、長期的な録音の一貫性のために必要です。私たちは、この観察に再強調し、約3時間の長いインキュベーション時間を示唆しています。
刺激パラメータの様々なLTPを誘導することが知られているが、それぞれの場合に誘発される分子機構は(総説については38を参照)と同じでなくてもよいです。これは、順番に、シナプスタグおよび捕捉の実験の結果に影響を与えることができ、耐久性およびLTPの他の特性に影響を与えることができます。したがって、それは、刺激パラダイムと特性を検証することが重要です行う実験室の条件の下で誘発LTPのと一貫性を維持します。
我々は一般的に非常に大きなシナプス前繊維ボレーであり、最大0.5 mVの未満fEPSPsと録音も拒否されている間に繊維ボレーの大幅な変更を伴う実験で実験を考慮していません。さらに、二経路または三経路実験を実行しながら、その経路の独立性を確保することが重要です。これは、対のパルスの円滑プロトコル28を用いて行うことができます。
インターフェイス記録システムの一つの欠点は、チャンバーと周囲との温度と湿度の違いによる長時間録画時間中に電極上に凝縮液滴の形成です。これらの液滴は、慎重に時間から時間にブロットする必要があります。そうしないと液滴はスライス上に滴下し、乱れや信号のさえ喪失を引き起こす可能性があります。我々は通常、このBに取り組みますyが巧み電極に触れることなく、細い濾紙芯を用いて顕微鏡下で導かれた液滴をブロッティング。しかし、最善の解決策は、エジンバラ大学の研究者によって開発されたETCシステムとして、集中型の加熱システムを使用することです。
結びのノートでは、様々な方法論は、異なる実験の目的のために海馬スライスの調製のために使用され、世界中の研究室に存在します。手順のそれぞれは、他の上にいくつかの利点を提供しています。一つ注意深く実験の目的に適合するように、プロトコルの微細な詳細を最適化する必要があります。この記事は、STCやクロスキャプチャなど後期連想プロセスを研究するための方法論のいくつかの側面を改善するのに役立つことを願っています。
The authors have nothing to disclose.
This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 – T1-2012 Oct -02).
I. Dissection Tools | |||
1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
BC100R | |||
3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
B-Braun/Aesculap, Germany | |||
BB73 | |||
5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
II. ACSF component chemicals | |||
1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
III. Electrophysiology Instruments | |||
1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
00-42-102-0000 (MM-32) | |||
12. Electrodes | AM Systems, USA | 571000 (Stainless steel; 0.010, 5MΩ, 8 degree) |