This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.
Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of ‘Synaptic Tagging and Capture’ (STC), where the PRPs interact with recently active, ‘tagged’ synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated ‘tagged’ synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate ‘tags’18 and ‘PRPs’19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for ‘tag’ and ‘PRP’ respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD – the “synaptic cross-tagging”22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22.
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
급성 해마 슬라이스 LTP 및 STC 크로스 포착과 같은 다른 기능성 소성 과정의 연구에 훌륭한 모델 시스템이다. 그것은 해마 회로의 판상 구조 네트워크의 대부분, 정확한 전극 위치를 허용하고 혈액 – 뇌 장벽없이 함께 빠른 neuropharmacological 조작을위한 개방형 플랫폼을 제공하고 유지합니다.
이 문서에서는 젊은 성인 쥐에서 가능한 급성 해마 조각의 제조 방법을 설명하고 STC 크로스 태그를 조사하기 위해 그들을 사용. 이전 연구는 동물의 성별과 나이는 전기 생리학 연구에 사용하기 위해 고려해야 할 중요한 요소임을 강조했다. 완벽하게 표현 성인 수용체 기능 (5-7주 세 남성의 Wistar 쥐)와 27, 28 따라서 젊은 성인 동물이 사용된다. (23) 비대칭을 좌우 해마 간의 연결에서 설치류 (29)에 기록되어 있고NMDA 수용체 발현의 주요 차이점은도 34과 같이보고되었다. 그러나 우리는. LTP 이전 연구와 일치하도록하기 위해 23,32을 오른쪽 해마를 사용한 해마 중 하나는 한 일관성이 유지되는 한 사용될 수있다.
모든 프로토콜에서, 그것은 고립과 조직이 뻗어 손상, 건조 또는 저산소 렌더링되지 않습니다 신속하게 절차를 얇게하지만 돌보는을 수행하는 것이 매우 중요하다. 산도, 온도, 이온 성 용액의 조성에 변화가 슬라이스와 결과의 생존에 지대한 영향을 미칠 수있다. 그러므로 그러한 변형은 피해야한다. 이는 제조 공정 중에 발생하는 글루타메이트 수용체 – 의존성 칼슘 방출이 비가 역적으로 신경 조직 (35, 36), (37)에서 단백질 합성에 영향을 미칠 수 있음이 관찰되었다. 수동 티슈 슬라이서를 사용하여 VI에 비하여 매우 신속하게 완료 할 수 있도록하여 공정이 최소화 할 수있다braslicers. 그러나 많은 실험실 효과적으로 슬라이스 생존을 유지하기 위해 필요한 예방 조치와 vibraslicers를 사용합니다. 고려해야 할 또 다른 중요한 요소는 실험을 시작하기 전에 긴 잠복 기간이다. 이것은 방해가 준비 23시 발생 후 조각의 대사 상태와 키나아제 활성 수준의 안정성을 달성하기 위해 정말 중요한 것으로 지적되고있다. 이러한 안정성은 장기 녹음에 일관성이 필요하다. 우리는이 관찰을 다시 강조하고 약 3 시간의 긴 배양 시간을 제안한다.
자극 파라미터는 다양한 LTP를 유도하는 것으로 알려져있다, 그러나 각각의 경우에 유발 분자 메커니즘 (검토를 위해 38 참조) 동일하지 않을 수있다. 이것은 내구성, 차례로, 시냅스 태깅 및 캡처 실험의 결과에 영향을 미칠 수 있으며, LTP의 다른 특성에 영향을 미칠 수있다. 그러므로 그것은 자극 패러다임과 특성을 확인하는 것이 중요유발 된 LTP의 수행 실험실의 조건과 일관성을 유지한다.
우리는 일반적으로 매우 큰 시냅스 섬유 발리와 최대 0.5 MV 이하 fEPSPs과 녹음도 거부하는 동안 섬유 발리에서 상당한 변화를 포함하는 실험에 실험을 고려하지 않는다. 또한, 두 개의 경로 또는 3 통로 실험을 수행하는 반면, 경로의 독립성을 보장하는 것이 중요하다. 이것은 한 쌍의 펄스 촉진 프로토콜 (28)을 행할 수있다.
기록 인터페이스 시스템의 일 단점은 챔버와 주위 사이의 온도 및 습도 차이에 의해 긴 시간 동안의 기록 전극 결로 물방울의 형성이다. 이 물방울 신중 수시로 도말해야합니다. 그렇지 않으면 방울 조각에 물방울과 방해 또는 신호도 손실이 발생할 수 있습니다. 우리는 일반적으로이 B 태클Y는 능숙 전극을 건드리지 않고, 슬림 여과지 심지를 사용하여 현미경으로 유도 적을 블 롯팅. 그러나, 최상의 해결책은 에든버러 대학 연구자에 의해 개발 된 ETC 시스템으로 중앙 가열 시스템을 사용하는 것이다.
결론 메모에서 다양한 방법론은 다른 실험 목적 해마 슬라이스의 제조에 사용되는 세계적인 실험실에서 존재한다. 절차의 각 일부 위에 다른 장점을 제공한다. 하나주의 깊게 실험의 목적에 적합하도록 프로토콜의 분 정보를 최적화 할 필요가있다. 우리는이 문서는 STC 크로스 캡처 늦게 연관 프로세스를 공부 방법론의 일부 측면을 개선하는 데 도움이되기를 바랍니다.
The authors have nothing to disclose.
This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 – T1-2012 Oct -02).
I. Dissection Tools | |||
1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
BC100R | |||
3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
B-Braun/Aesculap, Germany | |||
BB73 | |||
5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
II. ACSF component chemicals | |||
1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
III. Electrophysiology Instruments | |||
1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
00-42-102-0000 (MM-32) | |||
12. Electrodes | AM Systems, USA | 571000 (Stainless steel; 0.010, 5MΩ, 8 degree) |