This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.
Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of ‘Synaptic Tagging and Capture’ (STC), where the PRPs interact with recently active, ‘tagged’ synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated ‘tagged’ synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate ‘tags’18 and ‘PRPs’19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for ‘tag’ and ‘PRP’ respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD – the “synaptic cross-tagging”22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22.
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
Akutt hippokampalt snitt er et utmerket modellsystem for studier av LTP og andre funksjonelle plastisitet prosesser som STC og kryss-fangst. Det bevarer mye av den laminære strukturelle nettverket av de hippocampale kretser, tillater presis plassering av elektroder og gir sammen med, en åpen plattform for hurtig nevrofarmakologiske manipulering uten blod-hjerne-barrieren.
Denne artikkelen beskriver metodikk for utarbeidelse av levedyktige akutte hippocampus skiver fra unge voksne rotter og bruke dem til å undersøke STC og cross-tagging. Tidligere forskning har lagt vekt på at kjønn og alder av dyrene er viktige faktorer å vurdere for bruk i elektrofysiologiske studier. 27,28 Derfor unge voksne dyr med fullt uttrykt voksne reseptorfunksjoner (Wistar hannrotter i alderen 5-7 uker) brukes. 23 Asymmetri i forbindelsene mellom venstre og høyre hippocampus har vært registrert hos gnagere 29 ogstore forskjeller i NMDA reseptor uttrykk har blitt rapportert i tillegg 34. Vi har brukt høyre hippocampus for å være i samsvar med våre tidligere LTP studier. 23,32 Imidlertid kan hver av hippocampi kan brukes så lenge konsistens opprettholdes.
Som i enhver protokoll, er det meget viktig å utføre isolasjon og kutting prosedyrer raskt, men tar seg at vevet ikke er strukket, er skadet, gjengitt tørr eller hypoksiske. Variasjonene i pH, temperatur og ionisk sammensetning av oppløsningene kan ha stor effekt på levedyktigheten av de skiver og resultatet. Derfor slike variasjoner bør unngås. Det har blitt observert at glutamat-reseptor-avhengig kalsium-frigivningen som foregår i løpet av fremstillingsfremgangsmåten kan irreversibelt påvirke proteinsyntese i nervevev 35,36, 37. Ved hjelp av manuelle vev høvler kan bidra til å minimere dette ved at prosessen kan fullføres meget raskt sammenlignet med vibraslicers. Men mange laboratorier også effektivt bruke vibraslicers med nødvendige forholdsregler for å bevare skive levedyktighet. En annen viktig faktor å vurdere er den lange inkubasjonstiden før forsøkene. Dette har vært kjent for å være veldig avgjørende for å oppnå stabilitet i metabolske statlige og kinase aktivering nivåer i skiver etter forstyrrelse forårsaket under forberedelse 23. Slik stabilitet er nødvendig for konsistens i langsiktige innspillinger. Vi re-vekt på denne observasjonen og foreslå de lange ruge timer med ca 3 timer.
En rekke stimuleringsparametere er kjent for å indusere LTP, men de molekylære mekanismene som utløses i hvert tilfelle ikke kan være det samme (for oversikt se 38). Dette kan påvirke holdbarhet og andre egenskaper av LTP som i sin tur kan påvirke resultatene av synaptiske tagging og fange eksperimenter. Derfor er det viktig å validere stimulerings paradigmer og egenskaperav fremkalte LTP under betingelsene for laboratoriet utfører og vedlikeholde konsistens.
Vi vanligvis ikke vurdere eksperimenter med svært store presynaptiske fiber salver og med maksimal fEPSPs mindre enn 0,5 mV og eksperimenter med betydelige endringer i fiber volley under opptakene blir også avvist. Videre, mens de utfører eksperimenter to sti-eller tre-sti, er det viktig å sikre veien uavhengighet. Dette kan utføres med en sammenkoblet-puls tilrettelegging protokoll 28.
En ulempe med de grensesnitt opptakssystemer er dannelsen av kondensdråper på elektrodene under den lange innspillings timer på grunn av temperatur og luftfuktighet forskjeller mellom kammeret og omgivelsene. Disse dråpene må nøye utslettet fra tid til annen. Ellers dråpene kan dryppe på skivene og forårsake forstyrrelser eller til og med tap av signaler. Vi pleier å takle dette by dyktig blotting dråpene guidede under mikroskopet med en slank filter papir veke, uten å berøre elektrodene. Imidlertid vil den beste løsningen være å bruke en sentralisert varmesystem, som for eksempel ETC-system utviklet av University of Edinburgh forskere.
På en avsluttende notat, en rekke metoder eksisterer i laboratoriene i verden som brukes til fremstilling av hippocampus skiver for ulike eksperimentelle formål. Hver av fremgangsmåten byr på noen fordeler i forhold til den andre. Man trenger å optimalisere nøye minutt detaljer om protokollen som passer formålet med forsøket. Vi håper at denne artikkelen hjelper i å forbedre noen aspekter av metodikk for å studere sene-assosiative prosesser som STC og cross-fangst.
The authors have nothing to disclose.
This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 – T1-2012 Oct -02).
I. Dissection Tools | |||
1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
BC100R | |||
3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
B-Braun/Aesculap, Germany | |||
BB73 | |||
5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
II. ACSF component chemicals | |||
1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
III. Electrophysiology Instruments | |||
1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
00-42-102-0000 (MM-32) | |||
12. Electrodes | AM Systems, USA | 571000 (Stainless steel; 0.010, 5MΩ, 8 degree) |