This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.
Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
The encoding and storage of information in the brain still remains the most significant and keenly pursued challenge in neuroscience. Over the years, long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) have emerged as the leading cellular correlates of memory1,2. These activity dependent changes, which exhibit input specificity and associativity, result in the stabilization of memory traces in the neuronal networks 1,3,4. The maintenance of the two forms of synaptic plasticity requires the synthesis of plasticity-related products (PRPs)5-10. Synapse specificity that involves the interaction of newly synthesized protein only with specific activated synapses expressing LTP or LTD, is critical to memory. This specificity is explained by the concept of ‘Synaptic Tagging and Capture’ (STC), where the PRPs interact with recently active, ‘tagged’ synapses11,12. The STC process offers a framework for associative properties of memories at the cellular level. It provides us with a conceptual basis of how short-term forms of plasticity are transformed into long-lasting forms of plasticity in an associative and time-dependent manner13.
During the process of STC, a strong tetanization in one input that leads to protein synthesis dependent late-LTP, results in the reinforcement of a protein synthesis independent early-LTP induced in another independent input on to the same population of neurons into a persistent one13. The setting of a local synaptic tag by a transient neural activity and the synthesis of the diffusible PRPs by the strong neural activity are the two key events during STC13,14. The capture of the PRPs by the recently potentiated ‘tagged’ synapses is fundamental to the maintenance of long-term potentiation. Many studies have been done to confirm the existence of STC phenomenon15-17 and identify the candidate ‘tags’18 and ‘PRPs’19. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2); CaMKIV, Protein Kinase M (PKM) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are some of the candidate molecules for ‘tag’ and ‘PRP’ respectively19-21. The synaptic tagging model has further been expanded to include the positive associative interactions between LTP and LTD – the “synaptic cross-tagging”22. In synaptic cross-tagging, a late LTP/ LTD in one synaptic input transforms the opposite protein synthesis-independent early-LTD/LTP in an independent input into its long-lasting form or vice versa22.
The hippocampal slice preparation is the most widely used model in the studies of long-term synaptic plasticity23,24. Much of the understanding about the concepts of synaptic tagging and cross- tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the labs are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of rat hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD for extended hours are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging23,25,26. This article describes the detailed experimental procedures for studying long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.
Akut hippocampus skiva är ett utmärkt modellsystem för studier av LTP och andra funktionella plasticitet processer såsom STC och tvär capture. Det bevarar mycket av den laminära strukturella nätverk av hippocampus kretsar, ger en exakt elektrodplaceringar och erbjuder vid sidan, en öppen plattform för snabb neurofarmakologisk manipulering utan blod-hjärnbarriären.
I den här artikeln beskrivs metoden för framställning av livskraftiga akut hippocampus skivor från unga vuxna råttor och använda dem för att undersöka STC och kors märkning. Tidigare forskning har betonat att kön och ålder av djuren är viktiga faktorer att tänka på för användning i elektrofysiologiska studier. 27,28 Därför unga vuxna djur med fullt uttryckt vuxna receptorfunktioner (Wistar råttor åldern 5-7 veckor) används. 23 Vissa asymmetrier i anslutningarna mellan vänster och höger hippocampus har noterats hos gnagare 29 ochstora skillnader i NMDA-receptorexpression har rapporterats såväl 34. Vi har använt rätt hippocampus för att stämma överens med våra tidigare LTP studier. 23,32 emellertid något av hippocampi kan användas så länge som konsekvens upprätthålls.
Som i alla protokoll, är det mycket viktigt att utföra isolering och skivning förfaranden snabbt men noga med att vävnaden inte sträcks, skadad, gjorde torr eller hypoxisk. Variationerna i pH, temperatur och joniska sammansättningen av lösningarna kan ha djupgående effekt på livskraften hos skivorna och resultaten. Därför sådana variationer bör undvikas. Det har visat sig att glutamatreceptorberoende kalciumfrisättning inträffar under framställningsstegen irreversibelt kan påverka proteinsyntesen i nervvävnad 35,36, 37. Använda manuella vävnadsskärmaskiner kan hjälpa till att minimera detta genom att låta processen vara klar mycket snabbt jämfört med vibraslicers. Men många laboratorier också effektivt använda vibraslicers med nödvändiga försiktighetsåtgärder för att bevara slice livskraft. En annan viktig faktor att beakta är den långa inkubationstiden innan experimenten. Detta har uppmärksammats för att vara riktigt avgörande för att uppnå stabilitet i metabola statliga och kinasaktiveringsnivåerna i skivor efter störningen orsakade under beredning 23. Sådan stabilitet är nödvändig för konsekvens i långsiktiga inspelningar. Vi åter betona på denna observation och föreslå de långa inkubationstid timmar ca 3 tim.
En mängd olika stimuleringsparametrar är kända för att inducera LTP, men de molekylära mekanismerna framkallade i varje fall får inte vara samma (för översikt se 38). Detta kan påverka hållbarheten och andra egenskaper hos LTP som i sin tur kan påverka resultaten av synaptiska taggning och infångningsexperiment. Därför är det viktigt att validera stimulerings paradigm och egenskaperav den framkallade LTP enligt villkoren i den utförande laboratoriet och upprätthålla konsekvens.
Vi generellt inte anser experiment med mycket stora presynaptiska fiber volleys och med maximal fEPSPs mindre än 0,5 mV och experiment med stora förändringar i fiber volley under inspelningarna också avvisas. Vidare, när de utför två-pathway eller tre-pathway experiment, är det viktigt att se vägen oberoende. Detta kan utföras med en parade puls underlättande protokoll 28.
En nackdel av gränssnittsregistreringssystem är bildandet av kondenseringsdroppar på elektroderna under de långa inspelnings timmar på grund av temperaturskillnader och luftfuktighet mellan kammaren och omgivningen. Dessa droppar måste noga blottades då och då. Annars dropparna kan droppa på skivorna och orsaka störningar eller förlust av signaler. Vi tacklar brukar detta by skickligt läsk dropparna guidade under mikroskop med hjälp av en smal filterpapper veke, utan att vidröra elektroderna. Men skulle den bästa lösningen vara att använda ett centraliserat värmesystem, såsom ETC system utvecklat av University of Edinburgh forskare.
På en avslutande anmärkning, existerar en mängd olika metoder i laboratorier världen över, som används för framställning av hippocampus skivor för olika experimentella ändamål. Vart och ett av det förfarande erbjuder vissa fördelar över den andra. Man måste noggrant optimera små detaljer i protokollet för att passa syftet med försöket. Vi hoppas att denna artikel bidrar till att förbättra vissa aspekter av den metod för att studera sent associativa processer som STC och tvär capture.
The authors have nothing to disclose.
This video article is sponsored by Cerebos Pacific Limited. This work is supported by National Medical Research Council Collaborative Research Grant (NMRC-CBRG-0041/2013) and Ministry of Education Academic Research Funding (MOE AcRF- Tier 1 – T1-2012 Oct -02).
I. Dissection Tools | |||
1. Bandage scissors | KLS Martin, Germany | 21-195-23-07 | |
B-Braun/Aesculap, Germany | LX553R | ||
2. Iris scissors | B-Braun/Aesculap, Germany | BC140R, | |
BC100R | |||
3. Bone rongeur | World Precision Instruments (WPI), Germany | 14089-G | |
4. Scalpel | World Precision Instruments (WPI), Germany; | 500236-G | |
B-Braun/Aesculap, Germany | |||
BB73 | |||
5. Scalpel blade#11 | B-Braun/Aesculap, Germany | BB511 | |
6. Sickle scaler | KLS Martin, Germany | 38-685-00 | |
7. Angled forceps | B-Braun/Aesculap, Germany | BD321R | |
8. Anesthetizing/Induction chamber | MIP Anesthesia Technologies (Now, Patterson Scientific), Oregon | AS-01-0530-LG | |
II. ACSF component chemicals | |||
1. Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
2. Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
3. Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4.7H20) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
4. Calcium chloride dihydrate (CaCl2.2H2O) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
5. Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
6. Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
7. D-Glucose anhydrous (C6H12O6) | Sigma-Aldrich | G7021 | |
III. Electrophysiology Instruments | |||
1. Microscope | Olympus, Japan | Model SZ61 | |
2. Temperature Controller | Scientific Systems Design Inc. Canada | PTC03 | |
3. Differential AC Amplifier | AM Systems, USA | Model 1700 | |
4. Isolated Pulse Stimulator | AM Systems, USA | Model 2100 | |
5. Oscilloscope | Rhode & Schwarz | HM0722 | |
6. Digital-Analog Converter | Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, UK | CED-Power 1401-3 | |
7. Interface Brain Slice Chamber | Scientific Systems Design Inc. Canada | BSC01 | |
8. Tubing Pump | Ismatec, Idex Health & Science, Germany | REGLO-Analog | |
9. Carbogen Flowmeter | Cole-Parmer | 03220-44 | |
10. Fiber Light Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Fiber Lite MI-150 | |
11. Micromanipulators | Marzhauser Wetzlar, Germany | 00-42-101-0000 (MM-33) | |
00-42-102-0000 (MM-32) | |||
12. Electrodes | AM Systems, USA | 571000 (Stainless steel; 0.010, 5MΩ, 8 degree) |