This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
细胞外基质(ECM)是交联的蛋白质的复合小梁,提供生物物理和生物化学线索是细胞增殖,存活,迁移等主要调节ECM的在发展和多样化的病理学的重要作用,包括心血管和肌肉骨骼疾病,纤维化和癌症。因此,表征的正常和患病组织的ECM的组合物可能导致新的预后和诊断标志物和潜在的新的治疗目标的识别。然而,ECM蛋白的性质(尺寸大,交联和共价结合,高度糖基化)已经呈现的ECM有挑战性的生化分析。为了克服这个难题,我们开发了一种方法,从新鲜或冷冻的组织和肿瘤发生ECM蛋白的不溶性的优点丰富的ECM。我们在这里描述的细节,包括顺序I脱细胞过程在不同的pH值和盐和洗涤剂浓度的缓冲剂ncubations和的结果在1)的细胞内(细胞质,核,膜和细胞骨架)蛋白和ECM蛋白质的2)的富集的提取。然后,我们描述了如何和去糖基化ECM消化富含蛋白制剂成肽进行后续分析通过质谱分析。
细胞外基质(ECM)是交联的和糖基化的蛋白质,提供了体系结构支持和锚固细胞和定义,部分,组织“生物力学特性1,2的复合小梁。 ECM蛋白还发信号给细胞直接通过它们的受体( 例如,整联,syndecans 等 )或通过调节生长因子信号3。将ECM因此提供生物物理和生物化学线索是细胞过程如增殖,存活,分化,分 化,迁移等的主要调节
该ECM起着生理,发育和衰老4关键作用。此外,一些病症,如心血管疾病,纤维化,肌肉骨骼疾病,癌症,是由引起的,或导致,ECM的改变。此外,ECM有助于干细胞小生境的维护和确定关键ECM分子次在支持干性将在组织工程和再生医学5直接应用。然而,尽管它的重要性,ECM一直保持,直到最近,未勘探6。
在硅片分析表明,该matrisome,定义为ECM和ECM相关蛋白的合奏,包括几百种基因同时在人类和小鼠基因组1,7,8的产品。然而,ECM蛋白的不溶性阻碍体内外的正常和病理标本基质的组合物的系统的特性。我们最近表明,这种不溶性可以变成优势,并用来丰富ECM蛋白8 – 10。我们和其他人进一步证实,质谱是选择的方法的ECM 8的组合物的特征– 10,13。
我们这里描述了由连续孵育在不同pH值和盐和洗涤剂浓度的一个缓冲的过程脱细胞。这个过程的结果在细胞质,核,膜和细胞骨架蛋白的提取(或消耗)和ECM蛋白的富集。然后,我们将介绍如何消化ECM-富含蛋白制剂成肽进行后续分析通过质谱分析。
使用的程序的详细和在这里示出,我们已经成功地富集和特征通过质谱法从十个不同组织和肿瘤类型的细胞外基质:正常鼠肺8,人和鼠结肠8,9,人肝脏9,人结肠直肠肿瘤和衍生肝转移9,黑素瘤异种移植物8,乳腺肿瘤异种移植物10,鼠胰岛和胰岛素瘤鼠(纳巴等人 ,未发表)。不同matrisom的比较西文透露,可以进一步用作潜在的诊断或预后标志物组织 – 和肿瘤特异性的ECM签名。
我们认为,此过程可以应用到其他标本没有或相对较小的修改。
修改
虽然我们采用这个确切的过程,从十组织和肿瘤类型8充实ECM – 10,协议的修改应在下列情况下可以考虑:
1)检测中间馏分ECM的蛋白质。
从不同的组织或肿瘤类型的细胞外基质可能会有不同的萃取性/不溶性,如以上所讨论为纤连蛋白和层粘连蛋白。例如,它被认为是纤维化组织或重塑的组织的细胞外基质翻转非常动态,因而人们可以观察到这些组织的比例较高的ECM蛋白的更容易萃取的12。这取决于ECM蛋白被检测到的级分,我们建议减少步骤的孵育时间导致ECM蛋白的提取或省略该步骤。
2)Detection的细胞内成分的在ECM富集粒料一个显著比例。在一些组织或肿瘤类型的比例的细胞:细胞外基质是特别高( 例如,肝,脾,非纤维组织增生性肿瘤)。在这种情况下,通过细胞内蛋白的ECM的富集级分的显著污染(特别是细胞骨架蛋白和/或组蛋白)可以观察到。耗尽细胞内蛋白质有效地,我们建议重复两次在缓冲液M和/或缓冲液的CS(均包含洗涤剂,这通常耗尽丰富细胞内蛋白)温育。另一种替代方法是使用另一种缓冲器,具有较高的洗涤剂浓度,需要提醒的是,这可能导致相对更可溶ECM蛋白的耗尽以及(见下段)。
3)替代使用商业试剂盒。
我们无法,专有的原因,得到的缓冲器的精确组成来回m为房室蛋白提取试剂盒的供应商。不过,我们已在使用表自制的缓冲器,确定洗涤剂(NP-40,脱氧胆酸钠和SDS)的浓度进行类似拔牙根据我们自己的经验1注。最近的一项研究也强调脱细胞缓冲剂的pH保持ECM蛋白13的重要性。
该技术的局限性
这里提出的方法依赖于以下事实ECM蛋白本质上比大多数胞内蛋白质更不溶性的。然而,脱细胞的方法在这里所描述肯定提取ECM中存在的可溶性组分,如某些生长因子或细胞外基质重塑酶。虽然ECM相关蛋白紧密结合的ECM蛋白通过在制备的样品的蛋白质组学所述检测,这种方法可能过于严格,充分轮廓的组合物matrisome相关蛋白质。
该技术相对于其它方法的意义
这里介绍过的其它方法的方法的优点是,它可以根据所关注的ECM的性质:可以省略中间步骤或重复以防止ECM蛋白的损失或增加分别污染细胞内蛋白质的耗尽。这种方法也只使用被冲洗掉,以防止它们与随后的肽制剂和质谱干扰清净剂的最小量。最后,这里描述的消化ECM的富含蛋白质制剂成肽的方法还具有不需要的蛋白是可溶的,并且可以在“粗”的ECM富氧馏份进行的优点。
利用离液剂(如盐酸胍)替代脱细胞的方法 研究的ECM通过质谱法的组合物已bEEN文献报道(在14中综述),并已用于结合质谱软骨15,16,心脏17,乳腺18和血管19和肾小球20基底膜的ECM组合物的特征。
建议
采用胰蛋白酶消化进出细胞脱细胞的方法不应该被使用,如果ECM被富集用于随后蛋白质组学分析,如胰蛋白酶消化将导致局部细胞外基质的消化和ECM蛋白质和肽的损失。同样,如果胶原酶消化要用于帮助组织破坏,这将需要仔细监测,因为它会导致ECM的消化和ECM蛋白质和肽的损失。
在溶液主场迎战凝胶消化? ECM蛋白是交联的和高度不溶,并且即使当在3×Laemmli缓冲液再悬浮(含有6%SDS)和100mM的DTT,独立婆奥利在SDS凝胶上。因此,在凝胶内消化的是不是一个优选的方法。
未来的应用
值得注意的是,虽然没有在这里讨论的,每个所述脱细胞过程中收集的中间馏分的组成也可以通过质谱法进行分析。研究非常小的样品( 即,人活检)或时,这可能是特别有价值的信息时所需的其他细胞组分。
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
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Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
Section 3 | |||
HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |