This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en kompleks meshwork av tverrbundet proteiner som gir biofysiske og biokjemiske signaler som er viktige regulatorer av celleproliferasjon, overlevelse, migrasjon, etc. ECM spiller viktige roller i utvikling og i ulike patologier inkludert kardiovaskulære og muskel- og skjelettsykdommer, fibrose og kreft. Således karakteriserer sammensetningen av ECM'er fra normale og syke vev vil kunne føre til identifisering av nye diagnostiske og prognostiske biomarkører og potensielle nye terapeutiske mål. Imidlertid har selve innholdet av ECM proteiner (store i størrelse, tverrbundet og kovalent bundet, tungt glykosylert) gjengis biokjemiske analyser av ECM'er utfordrende. For å overvinne denne utfordringen, har vi utviklet en metode for å berike ECM'er fra ferske eller frosne vev og svulster som utnyttet uoppløseligheten av ECM proteiner. Vi beskriver her i detalj decellularization prosedyre som består av sekvensiell jegncubations i buffere med forskjellig pH og saltkonsentrasjoner og vaskemiddel og som resulterer i 1) utvinning av intracellulært (cytosolisk, nukleær, membran og cytoskeletal) proteiner og 2) anriking av ECM-proteiner. Vi beskriver deretter hvordan du deglycosylate og fordøye ECM-beriket proteinpreparater inn peptider for senere analyse av massespektrometri.
Den ekstracellulære matrix (ECM) er en kompleks meshwork av krysskoblet, og glykosylert proteiner som gir arkitektonisk støtte og forankring for celler og definerer, delvis, vev 'biomekaniske egenskaper 1,2. ECM-proteiner også signal til cellene enten direkte gjennom deres reseptorer (f.eks griner, syndecans, etc.) eller ved å modulere vekstfaktor signale 3. ECM gir dermed biofysiske og biokjemiske signaler som er viktige regulatorer av cellulære prosesser som spredning, overlevelse, polarisering, differensiering, migrasjon, etc.
ECM spiller sentrale roller i fysiologi, utvikling og aldring fire. Dessuten er flere sykdommer, for eksempel hjerte-karsykdommer, fibrose, muskel- og skjelettsykdommer, kreft, forårsaket av, eller føre til, ECM endringer. Videre bidrar ECM til opprettholdelse av stamcelle nisjer og identifisere viktige ECM-molekyler thpå støtte stemness vil ha direkte anvendelse i tissue engineering og regenerativ medisin 5. Men til tross for sin betydning, har ECM forble, inntil nylig, underexplored 6.
In silico-analyse har vist at matrisome, definert som ensemble av ECM og ECM-assosierte proteiner, omfatter produkter av flere hundre gener i både humane og muse genomer 1,7,8. Imidlertid har uoppløseligheten av ECM-proteiner hindret systematisk karakterisering av sammensetningen av in vivo ekstracellulære matriser av normale og patologiske prøver. Vi har nylig vist at dette insolubility kunne vendes til fordel og brukes til å berike ECM proteiner 8-10. Vi og andre ytterligere demonstrert at massespektrometri var en metode for valg å karakterisere sammensetningen av ECM'er 8 – 10, 13.
Vibeskriver her et decellularization prosedyre som består av sekvensielle inkubasjonene i buffere av ulik pH og salt og vaskemiddel konsentrasjoner. Denne prosedyren resulterer i utvinning (eller uttømming) av cytosoliske, kjernefysiske, membran og cytoskeletal proteiner og anriking av ECM proteiner. Vi beskriver deretter hvordan å fordøye ECM-beriket proteinpreparater inn peptider for senere analyse av massespektrometri.
Ved hjelp av prosedyrene detaljert og illustrert her, har vi lykkes beriket og preget av massespektrometri de ekstracellulære matriser fra ti forskjellige vev og krefttyper: normal murine lunge 8, menneskelige og murine tykktarm 8,9, human lever 9, menneskelige kolorektal tumorer og avledet levermetastaser 9, melanom xenografts 8 melke tumorxenografter 10, murine bukspyttkjertelen holmer og murine insulinomer (Naba et al., upubliserte). Sammenligning av de forskjellige matrisomes avslørt vevs- og tumorspesifikke ECM signaturer som kan videre brukes som potensielle diagnostiske eller prognostiske biomarkører.
Vi tror at denne fremgangsmåten kan anvendes for andre prøver med ingen eller forholdsvis mindre modifikasjoner.
Modifikasjoner
Selv om vi ansatt denne nøyaktige fremgangsmåten for å berike ECM fra ti vev og krefttyper 8 – 10, bør vurderes endringer i protokollen i følgende tilfeller:
1) Påvisning av ECM-proteiner i de mellomliggende fraksjoner.
Ekstracellulære matriser fra forskjellige vev eller tumortyper kan variere i deres extractability / uløselighet, som diskutert ovenfor for fibronectin og laminins. For eksempel, er det tenkt at ECM av fibrotiske vev eller ombygging vev svinger over svært dynamisk og dermed kan man observere en høyere andel av ECM proteiner i disse vev for å være lettere utvinnbar 12. Avhengig av den fraksjon som ECM-proteiner påvises, foreslår vi å redusere inkubasjonstiden av trinnet forårsaker utvinning av ECM-proteiner eller utelate dette trinnet.
2) Detection av en betydelig andel av intracellulære komponenter i ECM-anrikede pellet. I enkelte vev eller tumortyper, de forholds celler: ECM er særlig høy (for eksempel lever, milt, ikke-desmoplastic tumorer). I dette tilfelle kan en betydelig forurensning av ECM-anriket fraksjon av intracellulære proteiner (spesielt cytoskeletal proteiner og / eller histoner) observeres. Å utarme intracellulære proteiner effektivt, foreslår vi gjentatte ganger inkubasjonstiden i buffer M og / eller buffer CS (begge inneholder vaskemidler, dette tapper vanligvis rikelig intracellulære proteiner). Et annet alternativ vil være å bruke alternative buffere med høyere konsentrasjoner vaskemiddel, med det forbeholdet at dette kan føre til utarming av relativt mer løselig ECM proteiner i tillegg (se neste avsnitt).
3) alternativ til å bruke et kommersielt kit.
Vi var i stand til, for farmasøytiske grunner, for å oppnå den nøyaktige sammensetningen av bufferne from leverandøren av compartment Protein Extraction kit. Men vi har tatt med i tabell 1 notater basert på vår egen erfaring med hjemmelaget buffere med definert vaskemiddel (NP-40, natriumdeoksycholat og SDS) konsentrasjoner å gjennomføre tilsvarende utdrag. En fersk studie har også understreket betydningen av pH decellularization buffere for å beholde ECM proteiner 13.
Begrensninger av teknikken
Metoden som presenteres her bygger på det faktum at ECM-proteiner er egentlig mer uoppløselige enn de fleste intracellulære proteiner. Men den decellularization metoden beskrevet her sikkert trekker løselige komponenter til stede i ECM som noen vekstfaktorer eller ECM-ombygging enzymer. Selv om ECM-assosierte proteiner tett bundet til ECM proteiner ble oppdaget av proteomikk i prøver fremstilt som beskrevet, kan denne metoden være for strengt å fullt profilere sammensetningen av matrisome-forbundetproteiner.
Betydningen av teknikken med hensyn til andre fremgangsmåter
Fordelen med fremgangsmåten som presenteres her i forhold til andre metoder, er at det kan tilpasses til arten av ECM av interesse: mellomliggende trinn kan utelates eller gjentatt for å hindre tap av ECM-proteiner eller øke uttømming av forurensende intracellulære proteiner respektivt. Denne metoden har også bare benytter minimale mengder av vaskemidler som skylles av for å hindre deres interferens med påfølgende peptidpreparat og massespektrometri. Endelig har metoden beskrevet her for å fordøye ECM-rike proteinpreparater i peptider også den fordel at det ikke krever proteiner å være løselige og kan bli gjennomført på "rå" ECM-anrikede fraksjoner.
Alternative fremgangsmåter som benytter decellularization kaotroper (slik som guanidinhydroklorid) å undersøke sammensetningen av ECM'er ved massespektrometri har been rapportert i litteraturen (oversikt i 14), og er blitt brukt i kombinasjon med massespektrometri for å karakterisere ECM sammensetningen av brusk 15,16, 17 hjerte, brystkjertel 18 og vaskulær 19 og 20 glomerulær basalmembraner.
Anbefalinger
Decellularization fremgangsmåter som anvender trypsin å fordøye ut cellene bør ikke brukes dersom ECM'er er anriket for påfølgende proteomforskning analyser, som trypsinering vil resultere i delvis ECM fordøyelse og tap av ECM-proteiner og peptider. Tilsvarende, hvis kollagenase fordøyelse skulle brukes til å hjelpe vev avbrudd, ville det må overvåkes nøye, da det fører til ECM fordøyelse og tap av ECM-proteiner og peptider.
In-løsning vs. in-gel fordøyelsen? ECM-proteiner er fornettet og meget uoppløselig, og selv når resuspendert i 3 x Laemmli-buffer (inneholdende 6% SDS) og 100 mM DTT, separat poorly på SDS geler. Således in-gel fordøyelse er ikke en foretrukket metode.
Fremtidige søknader
Det er verdt å merke seg at selv ikke diskutert her, sammensetningen av hver av de mellomliggende fraksjoner oppsamlet under decellularization kan også analyseres ved massespektrometri. Dette kan være spesielt verdifullt når man studerer meget små prøver (dvs. humane biopsier) eller når informasjonen er ønsket på andre cellulære fraksjoner.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Drs. Amanda Del Rosario and Guillaume Carmona for critical reading of the manuscript. This work was supported by grants from the Department of Defense DOD Innovator Award (W81XWH-14-1-0240 to ROH); the National Cancer Institute (U54 CA126515/CA163109); the Broad Institute of MIT and Harvard; the Howard Hughes Medical Institute, of which ROH is an Investigator; and in part by the Support Grant from the National Cancer Institute to the Koch Institute for Integrative Cancer Research at MIT (P30-CA14051). AN received postdoctoral fellowships from the Howard Hughes Medical Institute and the Ludwig Center for Cancer Research at MIT.
Section 1 | |||
Tissue homogenizer: Bullet blender + beads | Next Advance | BB24-AU | http://www.nextadvance.com/api/index.cfm/products.info/c/421/Bullet-Blender |
Compartmental Extraction kit | Millipore | 2145 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Compartment-Protein-Extraction-Kit,MM_NF-2145 |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN25 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/dn25?lang=en®ion=US |
Ribonuclease A | Qiagen | 19101 | http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/plasmid-dna/rnase-a/ |
Section 3 | |||
HPLC-grade water | Sigma-Aldrich | 34877 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/34877?lang=en®ion=US |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/u4883?lang=en®ion=US |
Dithiotreitol (DTT) | Thermo Scientific | 20291 | http://www.piercenet.com/product/dithiothreitol-dtt |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | 9830 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/09830?lang=en®ion=US |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3221?lang=en®ion=US |
Peptide -N-Glycosidase F (PNGaseF) | New England Biolabs | P0704S | https://www.neb.com/products/p0704-pngase-f |
Endoproteinase LysC, mass spectrometry-grade | Wako | 125-05061 | http://www.wako-chem.co.jp/english/labchem/product/life/Lys-C/index.htm |
Trypsin, mass spectrometry-grade | Promega | V5111 | https://www.promega.com/products/mass-spectrometry/proteases-and-surfactants/sequencing-grade-modified-trypsin/ |
Trifluoro-acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6508 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/t6508?lang=en®ion=US |
Acetonitrile, mass spectrometry-grade | Thermo Scientific | 51101 | http://www.piercenet.com/product/acetonitrile-acn-lc-ms-grade |
Desalting columns: Oasis HLB 1 cc, 10 mg Sorbent per Cartridge | Waters | 186000383 | http://www.waters.com/waters/partDetail.htm?partNumber=186000383 |