This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.
DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.
Forutsigbarheten Watson-Crick baseparing har tillatt dynamisk DNA nanoteknologi til å fremstå som en programmerbar måte å designe molekylære enheter med dynamiske egenskaper 1,2. Spesielt DNA tråd forskyvning – en programmerbar, konkurranse hybridisering reaksjon – har vist seg å være en effektiv mekanisme for å konstruere dynamiske DNA-systemer. I en DNA tråd forskyvning reaksjon, fortrenger en innkommende oligonukleotid en tidligere bundet "output" tråd fra en utfyllende bindende partner. Flere slike reaksjoner kan være lenket sammen i flere trinn reaksjons kaskader med en høy grad av kontroll over rekkefølgen og tidspunktet for individuell reaksjon trinn 3. DNA-tråd fortrengning kaskader har blitt brukt til å lage digitale og analoge molekylære kretser 4-7, valgbar nanostrukturer 8-10, autonome molekylære motorer 11-15, og ikke-kovalente katalytiske forsterkere 13,16-21. Videre DNA enheter ved hjelp av trådfortrengningsreaksjoner kan simuleres og designet for ulike applikasjoner ved hjelp av dataassistert design software 22-24.
Foreløpig kjemisk syntetiserte DNA fungerer som det viktigste materialet for DNA nanoteknologi. Imidlertid feil i DNA-synteseprosessen, og de resulterende imperfect oligonukleotider, antas å begrense ytelsen av dynamiske DNA-enheter ved å forårsake feilaktige bireaksjoner. For eksempel "lekkasje" reaksjoner kan resultere i frigjøring av en utgang oligonukleotid selv i fravær av en reaksjon utløser. Slike effekter er mest åpenbare i autokatalytiske reaksjon kaskader, hvor til og med en minimal mengde av initial lekkasje vil til slutt resultere i full aktivering av kaskaden 19,20. Omvendt, reaksjoner ofte mislykkes i å nå forventet nivå på aktiverings fordi enkelte komponenter ikke utløser selv i nærvær av den tiltenkte inngangs 7,25. For å gjøre resultatene av DNA-basertenanodevices sammenlignbare med deres biologiske proteinbaserte motstykker, slike feilmodi må bli dramatisk redusert.
Bakterielle plasmider eller annet biologisk DNA kan tjene som en forholdsvis billig kilde til høyrent DNA for nanoteknologi. Store mengder DNA kan genereres ved replikasjonen i bakterier, og de iboende korrektur evnene til levende systemer sikrer renheten av det resulterende DNA. Faktisk har flere nyere papirer anerkjent potensialet nytten av biologisk DNA for nanoteknologi programmer 21,26-28. Imidlertid har det fullstendig dobbelt-trådet plasmid DNA natur hittil forbudt å bruke som materiale for fremstilling av dynamiske DNA-enheter, som vanligvis består av flere oligonukleotider og inneholder både dobbelt-trådet og enkelt-trådede domener. I en nyere artikkel 29 dette problemet ble adressert og en ny DNA gate arkitektur som består i hovedsak av bretter dobbelttrådet DNA (ndsDNA) var introdusered.
Viktigere, kan systemer av ndsDNA porter være utformet som skjønner dynamikken spesifisert av noen formell kjemisk reaksjon nettverk (CRN) 29. ndsDNA porter kan således anvendes, i prinsippet, å skape dynamiske systemer som utviser svingninger og kaos, bistabilitet og hukommelse, boolsk logikk eller algoritmiske atferd 30-38. For eksempel, Ref. 29 vist en tre-reaksjon CRN som ga en molekyl gjennomføring av en "konsensus" protokoll, en type distribuert beregningsalgoritme 29,39,40. Dette arbeidet først demonstrert en ny bruk for CRN formalisme som en "programmeringsspråk" for raskt å syntetisere funksjonelle molekylære systemer (figur 1A).
Her er en detaljert protokoll for å utlede ndsDNA porter fra plasmid DNA tilgjengelig. Først er en gjennomgang av sekvensen designprosessen. Deretter følger en forklaring på hvordan syntetiske oligonukleotider som inneholderport sekvensene er klonet inn plasmider og sekvens verifisert og forsterkes via bakteriekultur. Deretter blir det vist hvordan ndsDNA porter kan være avledet fra plasmidene ved enzymatisk behandling (se figur 2). Til slutt blir en fremgangsmåte for testing av porten ved hjelp av fluorescens-kinetiske oppførsel assays skissert.
Reaksjonsmekanisme
Som et eksempel, fokuserer protokollen på den katalytiske kjemiske reaksjonen A + B-> B + C. Arten A, B og C ("signaler", figur 1B) alle svarer til en annen enkeltkjedet DNA-molekyl. Sekvensene til disse molekylene er fullstendig uavhengige og trådene ikke reagerer med hverandre direkte. Sekvensene av alle signaler har to forskjellige funksjonelle domener, dvs. subsekvenser som fungerer sammen i tråd fortrengningsreaksjoner: 1) en kort toehold domene (etiketter ta, tb, tc) som brukes for oppstart av strand forskyvning reaction, og 2) en lang domene (etiketter a, b, c) som bestemmer signal identitet.
Interaksjoner mellom signal tilnærmingene er mediert av bretter doble DNA (ndsDNA) gate komplekser (kalt Delta AB og Fork BC) og hjelpe enkelttrådete arter (<tr r>, <b tr>, <c tb> og <i tc >). Den formelle Reaksjonen A + B-> B + C blir kjørt gjennom en serie av trådforskyvningsreaksjonstrinn, hvor hvert reaksjonstrinn utsetter fotfeste for en etterfølgende reaksjon (figur 1B). I dette eksempelet er signalene A og B er i utgangspunktet er fritt i løsning, mens signalet C er bundet til gaffelen porten. Ved slutten av reaksjonen B og C er i løsning. Mer generelt signaler som er bundet til en gate er inaktive, mens signaler som er fri i løsning er aktive, det vil si, de kan delta i en trådforskyvningsreaksjon somen inngang. Tidsforløpet av reaksjonen blir fulgt ved hjelp av en fluorescerende reporter strategi (figur 1C). I tidligere arbeid 29, ble det vist at denne reaksjonsmekanisme ikke bare realiserer den korrekte støkiometri, men også kinetikken til target-reaksjonen.
Dette notatet beskriver en metode for å utlede ndsDNA porter fra høyren plasmid DNA. Videre er en protokoll presenteres for karakterisering gate ytelse ved anvendelse av en fluorescens-kinetikk assay. Eksperimentelle data viser at plasmid-derived system gir bedre resultater enn dens syntetiske motpart selv om det syntetiske systemet er sammensatt av tråder renset ved anvendelse av polyakrylamid-gel-elektroforese (PAGE). Sannsynlig, er den forbedrede ytelsen til plasmid-avledet porter primært på grunn av svært høy renhet av den biologiske DNA. Syntetisk DNA inneholder en rekke feil, særlig delesjoner som resulterer i oligonukleotider med lengde n-1, og slike biprodukter er vanligvis ikke fullstendig fjernet i PAGE eller væskekromatografi (HPLC) renseprosedyrer. Lignende forbedringer til de som presenteres her, ble også observert i en tidligere studie av en katalysert hårnål forsterker som brukes DNA stammer fra biologiske kilder 21.
<p class = "jove_content"> Men selv ved bruk av plasmid-avledet porter kan ikke fullstendig eliminere feil i porten ytelse, der det er minst to grunner: for det første over-fordøyelse eller mangel på snitt presisjon kan føre til porter med for mange hakk eller kutt i feil posisjoner. I begge tilfeller portene er større sannsynlighet for å ta del i uønskede reaksjoner. Slike problemer kan bli lettet ved å optimalisere mengden av enzym som brukes (se figur 4). For det andre, i disse forsøk, de fleste innganger og hjelpetråder var syntetisk DNA, og således inneholdt delesjoner og mutasjoner. I prinsippet kan alle enkelt-trådet inngang og tilleggs tråder også fås fra fagmid DNA gjennom en sammenpressing enzymoppløsning av pre-kodede m13 virale genom 26. Kanskje kretsen ytelse kan forbedres ytterligere ved hjelp av ssDNA avledet fra det bakterielle genomet.Mens bruken av plasmid-avledet portene ble funnet å forbedre kretsytelse, en analyseav kostnads og behandlingstiden viste at mens produksjonen av plasmid-avledet portene er litt billigere (tabell 15), tar det 2-3 ganger lengre saksbehandlingstid i forhold til montering og rensing av porter fra kommersielt syntetiserte oligos (Tabell 16). Den primære kostnadene for plasmid-avledet portene er gen-syntese og anvendelse av restriksjonsenzymer. For 300 pmol av porter (nok for 15 reaksjoner på 30 nM), er den estimerte kostnaden for Delta porter ca $ 170 og $ 200 for Fork porter, kostnaden forskjellen er på grunn av bruk av ulike knekk enzymer. I kontrast, kjemisk syntese av trådene for de samme gate koster rundt $ 260 inkludert en PAGE rensing avgift. Den primære tid kostnaden for plasmid-avledet porter er i kloning prosedyre, som, akkurat som DNA-syntese, kan settes ut til et gen syntese selskap. Imidlertid, når montert, plasmid-avledet portene har den fordelen at verts plasmider kan lett bli replikert ennd kan lagres i form av bakterie glyserol aksjer. Dette gjør det mulig å gjenbruke portene mange ganger over.
Ser frem, kan den forbedrede ytelsen til plasmid-avledet porter aktivere et mye større spekter av dynamikk atferd enn det har vist eksperimentelt så langt med DNA CRNs. For eksempel foreslo nylig teoretisk arbeid 47,48 at selvorganisert romlige mønstre på makro-skala kan realiseres med DNA CRNs gjennom en reaksjon diffusjon mekanisme. Metoden som presenteres her gir en levedyktig bane for å konstruere de underliggende molekylære komponenter for slike selv mønstring DNA materialer. Selv utfordrende, ville utvikle makro-skala morfologi i en programmerbar måte har betydelige implikasjoner i områder som spenner fra biomaterialer forskning for å regenerativ medisin.
The authors have nothing to disclose.
Tallene 1, 2, 3, 4, 6, 8 og Bord 2, 3, 10, 15, 16 er endret fra Ref 29. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (gi NSF-CCF 1.117.143 og NSF-CCF 1.162.141 til GS). Y.-JC ble støttet av taiwanske regjeringen Fellowships. SDR ble støttet av National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP).
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | NEB | M0531S | |
PvuII-HF | NEB | R3151L | |
PstI-HF | NEB | R3140S | |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
Terrific Broth, Modified | SIGMA-ALDRICH | T0918-250G | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
QIAGEN Hispeed Maxi-prep Kit | QIAGEN | 12662 | |
Nb.BsrDI | NEB | R0648L | |
Nt.BstNBI | NEB | R0607L | |
NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | ||
Double-stranded Genomic Blocks | IDT | ||
Horiba Jobin-Yvon Spex Fluorolog-3 Fluorimeter | Horiba/Jobin Yvon | ||
Synthetic Quartz Cells | Starna | 23-5.45-S0G-5 | |
QIAGEN Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | |
Plasmid Backbones | BioBrick | E0240-pSB1A2 | High copy number plasmid with Ampicillin resistance. Sequence can be found from http://parts.igem.org |