Abstract
병원성 르시 니아 종을 포함한 많은 그람 음성균이. 진핵 표적 세포에 효과기 단백질을 이동시키다하기에게 유형 III 분비 시스템을 사용한다. 숙주 세포 내부에 효과기 단백질은 박테리아의 수혜 세포 기능을 조작. 더 나은 전위를 측정하는 숙주 세포의 상호 작용, 민감하고 정확한 분석하는 동안 유형 III 분비의 조절을 이해하기 위해 필요합니다. 우리는 여기 르시 니아 enterocolitica 효과기 단백질 단편의 융합에 기초한 어 세이 (예 르시 니아 외 단백질; YopE)의 응용 기술한다. 전좌의 정량 분석을위한 TEM-1 베타 - 락타 마제와이 분석은 세포의 분열에 의존 투과 FRET 염료 전좌 베타 - 락타 마제 융합에 의해 (CCF4 / AM). 형광이 중단 및 쿠마린 부분의 여기 파란색 형광 방출로 연결되어있는 베타 - 락타 마제에 의해 CCF4의 세 팔로 스포린 코어의 절단 후, 쿠마린에서 FRET.이 방법의 다른 어플리케이션의 다양성을 부각 문헌에 기재되어있다. 방법은 마우스 모델에서 생체 외 분석을위한 전위도 생체 예에서 허용한다. 형광 신호의 검출은 플레이트 판독기, FACS 분석 또는 형광 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 다른 예 르시 니아 돌연변이가 HeLa 세포에 이펙터 융합체의 생체 전위에서, 여기에 설명 된 설정에서 레이저 스캐닝 현미경에 의해 모니터링된다. 실시간으로 베타 - 락타 마제 이펙터 융합하여 FRET 기자의 세포 내 변환을 기록하는 강력한 정량적 인 결과를 제공합니다. 우리는 여기서 Y로 증가 전위를 보여주는 대표적인 데이터를 표시 야생형 균주에 비해 enterocolitica YopE 변이체.
Introduction
타입 III 분비 시스템은 직접 진핵 표적 세포 내로 세균 부호화 이펙터 단백질을 제공하는 그람 음성 박테리아에 의해 이용되는 다른 장군 특수한 단백질 수출 기계이다. 분비 기계 자체가 고도로 보존되는 동안 효과기 단백질의 특별한 세트는 셀룰러 신호 경로를 조작하고 특정 박테리아 병원성 1 전략을 용이하게하기 위해 다양한 세균 종에 진화 해왔다. 르시 니아 경우, 일곱 이펙터 단백질, 소위 Yops (르시 니아 외 단백질)까지, 숙주 세포 접촉에 전좌 및 즉 식세포 및 사이토 카인 생산과 같은 면역 세포 반응을 파괴하기 위해 함께 작동되어, 세균의 세포 생존을 허용 2-4. 전위의 프로세스 밀접 다른 단계 5에서 제어된다. 그것은 T3SS의 기본 활성화가 목표 CE에의 접촉에 의해 유발되는 것을 설립LL 6. 그러나,이 개시의 정확한 메카니즘은 아직 밝혀지지된다. 예 르시 니아에서 전위의 소위 미세 조정의 두 번째 수준은 상향 또는 하향 조절 세포의 Rho GTP 결합 단백질 RAC1 또는에서 RhoA의 활성을 얻을 수있다. invasin 또는 세포 독성 괴사 인자 Y (CNF-Y)에 의해 예를 들면 RAC1의 활성화는 차이가 전좌 YopE의 기능을 (는 GTPase 단백질을 활성화) 동안 RAC1 활동을 하향 조절하고 그에 따라 음의 피드백 유형에 따라 전위를 감소, 증가 전위 7-9 리드 기구 10, 11의.
유효하고 정확한 방법 르시 니아 전좌가 숙주 세포의 상호 작용 동안에 어떻게 조절되는지를 조사하기위한 전제 조건이다. 다양한 시스템들은 특정한 장점과 단점이 각각, 이러한 목적을 위해 사용되어왔다. 일부 방법은 웨스턴 블롯 분석 한 다음 다른 세제에 의해 감염된 세포의 용해가 아닌 박테리아에 의존하고있다. 목이러한 방법의 전자 일반적인 단점은 사소한하지만 피할 수없는 박테리아 용해 잠재적 박테리아 관련 이펙터 단백질과 세포 용 해물을 오염이다. 그러나, 세포 외 이펙터 단백질과 진핵 세포의 선택적 용해에 대한 디기 토닌의 후속 사용을 분해하는 단백질 분해 효소의 K와 세포의 치료는이 문제 (12)을 최소화하기 위해 제안되었다. 중요한 것은, 이러한 분석은 결정적으로 대부분 상업적으로 사용할 수없는 높은 품질의 안티 이펙터 항체에 따라 달라집니다. 시도 형광 단백질의 구형 차 구조 및 분비 13 전에 펼치는 분비 장치의 무능력으로 인해 아마 성공하지 않았다 전좌를 모니터링 GFP 같은 효과기 단백질의 번역 융합체 및 형광 단백질을 사용한다. (14) 또는 플래시 cyclolysin 보르 데 텔라 백일해 독소 그러나 CYA 등 여러 가지 리포터 태그 (칼 모듈 린 - 의존적 아데 닐 레이트 사이 클라) 도메인태그가 성공적으로 전좌를 분석하는데 사용 하였다. 플래시 태그, 매우 짧은 tetracysteine (4Cys) 모티브 태그, 분비 과정을 방해하지 않고 biarsenical 염료 플래시와 라벨을 허용하면서 전 분석에서 CYA의 효소 활성은 세포 융합 단백질의 신호를 증폭하는 데 사용 15.
여기인가 접근하여 CHARPENTIER 외. 처음보고되었고 전좌 이펙터 TEM-1 베타 - 락타 마제 융합체 (16) (도 1a)에 의해 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 염료 CCF4의 세포 변환에 기초한다. CCF4 / AM는 쿠마린 유도체 (도너) 및 형광 부분 (수용체)은 세 팔로 스포린 코어에 의해 연결되는 셀 투과 화합물이다. 진핵 세포로의 수동 입력에 따라, CCF4 / AM 에스테르 화합물은 비 형광 형광 충 CCF4 셀룰러 에스 테라 제에 의해 처리함으로써 갇혀세포 내에서. 530 nm에서 녹색 형광 신호를 방출 형광 잔기에 FRET에서 405 nm의 결과에서 쿠마린 잔기의 여기. 베타 - 락타 마제에 의해 FRET 스포린 코어의 분열 후 중단되고, 쿠마린 잔기의 여진은 at460 nm의 청색 형광 방출에 이르게. 이 방법의 다른 어플리케이션의 다양성을 부각 문헌에 기재되어있다. 상기 방법은 시험관 내에서 전위의 분석을 가능하게하고 또한 생체 예에서, 기술은 생체 내에서 17-19 전좌 대상 백혈구 집단을 식별하는 마우스 감염 모델을 사용 하였다. 신호의 판독은 플레이트 판독기, FACS 분석 또는 형광 현미경을 이용하여 수행 될 수있다. 참고로,이 방법은 또한 감염 프로세스 (20, 21) 중 살아있는 세포 현미경으로 실시간 전좌를 모니터링 할 수있는 가능성을 제공한다. 여기 레이저 스캐닝 형광 현미경 readou 도포 했더니형광 신호 t 그것은 높은 감도와 정확성을 제공하기 때문에. 특히, 성능은 고감도의 검출기와 함께 나노 미터 정밀도로 발광 창 형광 검출을 최적화 및 크로스 토크를 최소화하는 것을 용이를 조정한다. 또한이 현미경 설치 전좌 실시간으로 모니터링하도록 구성 될 수 있고, 잠재적으로 세포 수준에서 호스트 병원체 상호 작용의 동시 분석을 허용한다.
(Y)의 연구 전위 요금에 enterocolitica 야생형 균주와 hypertranslocator 표현형을 나타내는 10,11 YopE 결실 변이체는 예시 적으로 분석 하였다.
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Protocol
1. 피크 방출 및 크로스 토크 결정 (또한 그림 2 참조)
- , 발광 피크와 도너 사이의 크로스 토크 (쿠마린 유도체의 V450) 및 억 셉터 (형광) 염료의 양을 결정 405㎚, 여기에서 개별 형광 표지 된 세포 모두의 스펙트럼 스캔을 수행하기 위해.
- 기증자 및 수용체 채널 (여기 455-465 nm의 525-535 ㎚)에 사용되는 각 염료의 피크 내에서 10 nm의 대역폭을 결정합니다. 파장 통해 규격화 강도를 플롯 및 수용체 채널 반대 (도 2)에 도너 염료의 크로스 토크 (cross-talk)의 평균 백분율을 계산한다.
(Y) 2. 준비 세포 배양 감염 enterocolitica 균주
- 다음 균주를 사용 WA-314 PMK-난자가와 (WA-314 17 PMK-즐와 PMK-OVA (17), 각각 플라스미드로 형질 전환) WA-314ΔYopE PMK-즐 (가 물에) 17 314ΔYopE는 플라스미드로 형질 전환 된 PMK-즐
- 감염 행진 Y. 전에 적어도 이일 enterocolitica 균주 WA-314 PMK-OVA, WA-314 PMK-즐와 WA-314ΔE WA-314 PMK-즐 및 WA-314 PMK-난자에 대한 (카나마이신 필요한 항생제를 포함하는 LB 한천 플레이트에 주식을 알아내는로부터 PMK는-BLA , 카나마이신 및 WA-314ΔE PMK-즐위한 테트라 사이클린), 27 ℃에서 O / N 성장. 이후 일주까지 4 ℃에서 대한 번호판을 유지.
- 감염 전 어느 날 각각의 균주 중 하나를 식민지로 필요한 항생제를 포함하는 LB-매체의 3 ㎖를 접종하고 180 rpm으로 진탕 기에서 27 ℃에서 O / N을 품어.
- 감염 일에 항생제없이 신선한 LB-배지 40 ㎖ 중에 O / N 배양 2 ㎖를 접종 및 유형 III 분비 시스템의 발현을 유도하기 위해 180 rpm의 진탕 기에서 37 ℃에서 90 분 동안 배양한다.
- 적절한 튜브에 문화를 전송하고 C 얼음 또는 4 °에서 문화를 유지지금부터. 5,000 XG, 4 ° C에서 10 분 동안 문화를 원심 분리기.
- 얼음의 2-3 ml의 차가운 PBS의 세균 펠렛을 재현 탁. 분광 광도계를 사용하여 8 × 108 CFU / ml의 농도에 세균 현탁액을 희석. 개별적으로 대응하는 광학 밀도를 결정한다. 헬라 세포를 감염 때까지 얼음이 현탁액을 유지합니다.
3. 도금 HeLa 세포
- 96 웰 플레이트의 웰에 10 % 열 비활성화 우태 혈청 (FCS)을 함유하고, 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 배양을 200㎕ DMEM에 하루 감염 종자 전에 1.5 × 104 세포 HeLa 세포. 각 변형 (세 가지 다른 배양 시간) 세 우물을 시드.
4. 헬라 세포의 감염 및 CCF4에 넣기
- 배지에 세균 현탁액의 3.5 μl를 첨가하여 HeLa 세포를 감염 부드럽게 매체 회 피펫 팅하여 혼합한다. 박테리아가 침전 허용세포 당 약 100 박테리아의 MOI (감염의 부위)에 세포. 시간 코스 -90 분, -60 분, -30 분에서 감염을 시작하고 공통 종료점을 달성하기 위해 0 분까지 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다.
- 배양이 완료되면, 신중 HeLa 세포를 제거하지 않고 매체 대기음 CCF4 수출 감소 이펙터 2.5 밀리미터 베네 시드의 발현을 20 μg의 정지 / ㎖의 클로람페니콜을 함유하는 PBS의 50 μL를 추가한다.
- 이 시점에서 현미경 단계로 96 웰 플레이트를 전송하고 잘 각각 나중에 분석을 위해 적합한 장소를 정의합니다. 10 분 이내에이 단계를 완료 (취득 자세한 내용은 5.1 절 참조).
- 당이 아니라, 20을 포함 CCF4 / AM 로딩 용액 (0.24 ㎕의 용액 1.2 μL 용액 B 70 μL, 18.56 μL 용액 C (용액 A, B 및 C는 CCF4 / AM 로딩 키트 내에 제공) 50 μL PBS를 (ADD 다중 페이지를 사용하여 ㎍ / ml 클로르 암 페니 콜 및 2.5 MM의 프로 베네 시드)ipette 실온에서 5 분 동안 품어합니다. 지금 일에 중단없이부터.
- 로딩 솔루션을 기음과 멀티 피펫을 사용하여 20 ㎍ / ml 클로르 암 페니 콜 및 2.5 MM의 프로 베네 시드를 포함하는 PBS 100 μL를 추가합니다. 그리고 빠르게 현미경 단계로 96 웰 플레이트를 전송 및 로딩 솔루션의 열망에서 10 분 이내에 수집을 시작합니다.
5. 레이저 스캐닝 현미경 및 데이터 분석
- 이미지 획득
- 광독성, photobleaching에 크로스 여진을 전체 광자 수를 최대화하고 최소화하기위한 방법으로 촬상 조건을 설정한다.
- 현대 공 초점 레이저 주사 현미경에서 동시에 활성화 기증자 및 수용체 채널, 8 비트 깊이와 높은 감도 하나로 이루어질 수 탐지기를 선택, 2.5 에어리 단위 (즉, 넓은 광학 절편)에 검출기 핀홀을 열고, 20 배 높은 개구 침지 목표를 사용 ~ 750 나노 미터 픽셀 크기, 3 배의 프레임 평균과 excit405 nm의 레이저 다이오드의 10 % E.
- 정확한 정량화는 동일한 값으로 두 채널의 검출기 이득 설정을 보장하고, 모든 픽셀의 포화를 방지하기 위해.
참고 : 여기에, 이익은 150 %로 설정했다.
- 1 mL의 시린지로, 예를 들어, 웰의 바닥에 침적 매개물을 확산하여 담궜을 보장하고, 기포의 포착을 방지.
- 투과광을 활성화하고 모든 웰에보기의 대표 필드를 찾을 수 있습니다. 제대로 보정 자동 단계를 사용하여 소프트웨어의 위치를 표시합니다.
- 염색에 대한 판의 제거 후, (4.3 절 참조) 판을 다시 삽입 초점 드리프트를 방지하기 위해 상단에 무게를 추가 할 수 있습니다. 레이저 스캐닝 모드와 저장 위치를 검토하고 적절하게 초점과 수평 위치를 조정합니다.
- 2 시간에 2 분에 시간을 시간 경과를 설정하고 획득을 시작합니다.
- 광독성, photobleaching에 크로스 여진을 전체 광자 수를 최대화하고 최소화하기위한 방법으로 촬상 조건을 설정한다.
- 이미지 정량 (예를 들면 비트 평면 소프트웨어에 대해 설명한다) 같은 Imaris과 같습니다
- 픽셀 매트릭스의 산술 계산을 수있는 소프트웨어로 데이터 세트를 가져옵니다. 드래그 기증자 및 소프트웨어 아이콘 수용체 채널 모두를 포함하는 소스 파일을 드롭하여이 작업을 수행합니다.
- 같은 오프셋을 사용하여 두 채널에서 배경을 뺍니다. 이렇게하려면 메뉴를 클릭 한 다음 이미지를 클릭> 가공> 기준 빼기. 각 채널을 선택하고 기본 값을 입력합니다.
- 새로운 채널을 생성, 사전 결정된 보정 계수 F (1.1 참조) 셉터 채널 (CH2) 내로 도너 채널 (채널 1)의 블리드 - 스루를 정정 :
채널 2 '= 채널 2 - 채널 1 * F
참고 : 기증자 채널에 수용체의 블리드를 통해 소음의 수준 이상 검출되지 않았습니다.- 메뉴> 영상 처리> 채널를 arithmetics을 클릭하고 입력 복근 (CH2- (CH1 * 0.33)). 그 후 메뉴> 편집> 채널 삭제를 클릭하여 채널 2를 삭제합니다. 있는지 확인블리드를 통해 수정 수용체 채널로 남아있는 새로운 채널 2. 선택 : 메뉴> 편집> 이미지 속성으로 이동하여 원래 색상에 회색의 채널 색상을 변경합니다. 채널 4> 매핑 된 색상> 기본 색상을 선택하고 녹색, 예를 들면로 변경.
- 상대 FRET 계수를 결정하기 위해 다음 조작으로 새 채널을 만듭니다
CH3 = 채널 2 '/ (채널 1 + 채널 2')- 메뉴> 영상 처리> 채널를 arithmetics로 이동 ./ (CH1 + CH2)을 CH2를 입력
- 8 비트 이미지 FRET 채널의 적절한 시각화, 네 번째 채널을 생성 :
4 장 = 255 * CH3- 메뉴> 영상 처리> 채널를 arithmetics로 이동 255 *의 CH3를 입력합니다. 메뉴> 편집> 이미지 속성으로 이동하여 채널의 색상을 변경합니다. 채널 4> 매핑 된 색상> 색상 표 파일> 제트을 선택합니다.
- 채널 CH3 및 메탄 그쪽에 3 × 3 중간 필터를 적용T는 이미지의 노이즈를 줄일 수 있습니다. 이렇게하려면 메뉴> 이미지 처리> 스무딩> 중간 필터를 클릭합니다. 두 채널을 선택하고 필터 크기 "3x3x1"을 적용한다.
- 세포 신호 정량, 제대로 오프셋 설정하여 4 장에서 세포를 감지하고 너무 작은 구조를 제외 크기 구조를 필터링 할 수 있습니다.
- 선택보기를 능가하고 아이콘 "새로운 표면 추가"를 클릭합니다. 표면 창 검출 알고리즘 파라미터를 정의한다. 빠른 처리를 들어, 두 개의 체크 박스 "세그먼트 관심의 영역"과 "마지막으로 프로세스 전체 이미지"를 활성화합니다. 그 치수를 편집하여 관심 영역을 정의합니다.
- 소스 채널로 채널 4를 선택하고 임계 화> 배경 빼기 (로컬 대비)에 의해 임계 값을 설정하고 10 μm의 직경을 설정합니다. 최대 intensi 수동으로 0으로 최소 강도 임계 값과 최대 임계 값을 설정타이. 면적으로 구조를 필터와 예를 들어, 187 μm²에 최소 값을 설정합니다. 표면 감지를 마칩니다.
- 기증자 형광 강도 (채널 1) 및 상대 FRET 계수 (CH3) 셀룰러 기업에서의 표준 편차에 대한 평균 값을 추출합니다. 이렇게하려면 표면 특성으로 이동합니다. 표면 스타일 / 품질> 표면을 선택하여 구조의 모양을 변경합니다. 필터 탭을 클릭하여 모든 구조를 선택합니다. 선택> 통일을 처리하기 위해 이동하여 검출 된 구조를 통일한다. 통계 탭을 클릭하여 MS Excel로 표면 통계를 내보내기> 내보내기 모든 통계는 파일입니다.
- 시간이 지남에 따라이 값을 플롯. 전좌 이펙터의 양을 나타내는 적절한 매개 변수로 각 조건에 대한 기증자 채널 형광 증가의 최대 기울기의 10 분의 간격을 확인합니다. M = Δ 기증자 형광 강도 / Δ 시간 (분)으로 기울기를 계산합니다.
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Representative Results
정량적 표적 세포 내로 이펙터 전위를 분석 한 방법의 성능을 입증하기 위해, 서로 다른 전위 속도론 두 르시 니아 균주가 연구되었다 : Y. 및 그 유도체 WA-314ΔYopE (pYVO8ΔYopE 23 숨겨 WA-314) (독성 플라스미드 pYVO8 (22)을 품고 혈청군 O8) enterocolitica 야생형 균주 WA-314. 이전 연구는 것을 보여 주었다 (Y) 기능 YopE 전시에게 상당히 높은 YOP 전위 율 (10)이 부족 enterocolitica 돌연변이. 두 균주 YopE 및 TEM-1 베타 - 락타 마제 (PMK-즐) (17)의 N 말단 분비 신호의 융합체를위한 벡터로 형질 전환 부호화 하였다. WA-314은 추가로 음성 대조군 역할을 각각 YopE의 난백 알부민 융합 (PMK-난자 17)에 대한 벡터 인코딩으로 변형되었다. 30, 60 및 90 분의 배양 시간은 더 method`s 유효 범위를 평가하기 위해 적용된정량 차 적합성. 두 개의 서로 다른 판독은 데이터 분석에 사용 하였다 : 도너 형광 (채널 1)과 상대 FRET 계수 (도 1B 및 1C) (CH3 CH2의 '/ (채널 1 + 채널 2') =).
시간이 지남에 따라 음성 대조군 균주 (채널 1) 기증자 채널 강도의 WA-314-PMK-난자 플로팅에 관계없이 배양 시간 (그림 1B)의 형광 방출의 더 상승을 보여줍니다. 대조적으로, WA-314-PMK-즐 감염된 세포의 경시 형광 강도의 증가는 표적 세포의 세포질에서 YopE 베타 - 락타 마제 융합체의 존재를 나타내는 검출되었다. 예상대로 형광 강도의 최대 경사 적극적 감염 (: 0.10 / 분, 60 분 감염 : 0.33 / 분, 90 분 감염 : 감염 30 분 0.76 / 분)의 길이와 상관 관계를 나타내는 것을 전좌 베타 상이한 농도 락타 마제는 구별 될 수있다. 이전 연구 WA-31에 따라(: 1.28 / 분, 60 분 감염 : 1.53 / 분, 90 분 감염 : 1.41 / 분 감염 후 30 분) 4ΔYopE - PMK-즐 감염된 세포는 더 빠른 야생형 균주와 비교하여 형광 강도의 증가를 나타낸다. 흥미롭게도, 90 분에 감염을 확대하는 것은 더 감염의 60 분 (그림 1B)에 비해 기증자 형광의 상승을 가속하지 않았다. 이러한 발견은 아마도 인해 세포막의 무결성을 파괴로 감염의 60 분을 넘어 효율적인 전좌를 억제하거나 형광 염료의 손실을 초래할 수있는 하나 WA-314ΔYopE - PMK-즐 의해 가해 프로그레시브 세포 독성 효과에 의해 설명 될 수있다. 분석 FRET 상대 계수 (CH3)을 사용하여 제공된 결과는 단독 도너 채널에 의해 얻어진 결과에 따라 좋은있다. 그러나, 베타 - 락타 마제 전좌 융합 매우 많은 양을 나타내는 일부 조건 (WA-314ΔYopE - PMK-즐, 60 및 90 분의 감염)에 분명히 CCF4 기판이었다영상이 시작되기 전에 계속 열려 처리. 이러한 조건은 곡선의 관련 부분이 데이터의 표현 (도 1C)에서 누락되기 때문에 합리적인 최대 음의 기울기를 산출 할 수 없다. 상대 FRET 계수 채널의 이미지는 각각의 세포 (도 1d) 사이의 차이를 비교하기위한 가능성을 제공한다.
(Y)의 TEM-1 YopE 융합에 의한 이펙터 전위 그림 1. 정량 분석 enterocolitica. 전좌 TEM-1 베타 - 락타 마제에 의해 CCF4 기판 (A) 가수 분해는 레이저 스캐닝 현미경에 의해 모니터링 하였다. 그대로 기판의 녹색 형광 발광 (530 ㎚) 및 절단 된 가수 분해 (PR)의 청색 형광 발광 (460 ㎚)의 결과 405 nm의 여기oduct (쿠마린). (B는 C) 현미경 데이터 정량적 상대 FRET 계수 도너 채널 강도 (채널 1) 또는 계산 및 플로팅 (CH3은 채널 2 '/ (채널 1 + 채널 2'=)) 플롯 팅하여 분석 하였다. 데이터는 세개의 독립된 실험의 대표 값이다. (D) 묘사 현미경 사진 (채널 FRET) 지시 된 시점에서 대표 동영상에서 촬영 하였다. WA-314ΔE - PMK-즐 감염된 세포는 야생형 WA-314-PMK-즐 (60 분 감염)에 비해 상대적 FRET 계수들의보다 급속한 감소를 나타낸다. 스케일 바, 20 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
형광의 V450과 FITC 그림 2. 크로스 토크 결정.두 개별 형광체의 스펙트럼 공 초점 현미경으로 측정 하였다. 블리드 - 스루 도너의 V450을 525-535 nm의 검출 범위 내에서 수용체 채널에 선형 회귀 (인서트)로부터 계산 하였다. 두 측정에서 계산 된 크로스 토크의 평균 비율은 0.33 같습니다. 블리드을 통해 수용체 FITC의를 기증자 채널 (455-465 ㎚)에 소음의 수준 이상 검출되지 않았습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 여기에 성공적으로 Y로 이펙터 전위의 정량 분석을위한 TEM-1 베타 - 락타 마제 기자 기반 분석을 적용 enterocolitica. 이 민감한 특정하고 비교적 간단한 기술의 많은 다른 변형이 문헌에 기재되어있다. 본 연구에서는 레이저 주사 현미경은 형광 신호의 가장 민감하고 정확한 검출을 수행 하였다. 특히 도너와 억 셉터 염료 및 개별적 조절 검출 대역폭 사이의 크로스 토크에 대한 보정 방법의 다른 변형에 비해 우수한 측정 정확도를 위해 허용한다. 결과는 분명히 방법은 정량적으로 전좌를 분석 할 수 있음을 보여준다. 세포 내 베타 - 락타 마제의 상이한 농도를 나타내는 다른 배양 시간은 긍정적 도너 형광 세기의 기울기와 상관 관계가 있었다. 또한 WA-314ΔYopE의 상당히 높은 전위 속도 비교야생형 균주 WA-314 입증 될 수있다.
데이터 분석을위한 두 가지 대안이 적용되었다 : 기증자 채널 강도와 상대 무서워 계수를. 도너 채널 사용의 장점은 직접 CCF -4- 가수 분해 생성물 (쿠마린)의 축적을 나타내는 것이다. / 셉터 필요 도너의 비율을 이용하여 세포 밀도의 차이를 플레이트 판독기 보정 이외되지 않기 때문에이 방법은, 현미경에 설치 가능하다. 그러나, CCF4 염료 또는 가수 분해 제품의 수출은 여전히이 방식에서 가능한 교란 요인이다. 이러한 단점은 상대적 FRET 계수를 계산함으로써 극복 될 수있다.
설명 설치 실험에서 96 웰 플레이트에서 수행 하였다. 이 형식은 하나의 실험에서 여러 조건의 시험이 가능하며 고가의 화학 물질 (특히 CCF4 / AM로드 키트)를 저장하는 데 도움이됩니다. 설명 워크 플로우에서는 메신저를 시작하는 것이 중요합니다곧 전좌 베타 - 락타 마제에 의해 CCF4의 가수 분해 때문에 CCF4 / 오전 로딩 용액을 첨가 한 후 정의 된 시점에서 연령 인수 즉시 시작됩니다. 한 번에 여러 조건을 처리 할 경우, 초점 및 측면 위치 (단계 5.1.4)의 조정이 너무 오래 걸릴 및 이미지 수집의 적기 시작을 방해 할 수 있습니다. 따라서, 평행 한 샘플의 최대 수는 개별적으로 결정될 필요가있다.
이 방법을 사용하여 발생하는 주요 문제점 중 하나는 37 ℃에서 HeLa 세포에 의한 CCF4 기판의 상당한 수출이었다. 이 현상은 충분히 베네 시드로 처리하여 세포를 상쇄 할 수 없었다. 우리는 전술 한 바와 같이, 따라서 최초의 완전한 감염, 지속적인 감염시 대신 모니터링 전위의, 결정 이후 CCF4 / AM 염료와 세포를로드합니다. 이 방법으로는 RT에서 CCF4 기판의 프로세싱을 모니터링하는 것이 가능했다. 이러한 조건의 redu에서CCF4의 CED 수출이 관찰되었다. CCF4 기판 반출의 양은 특정 세포주 것으로 보인다; 여기에 설명 된 설정이 강하게 37 ° C에서 CCF4을 수출 세포주에서 또한 전위의 신뢰성 분석, 수 있습니다.
CCF4의 수출이 실시간으로 동시에 감염 전좌의 프로세스를 모니터링하기위한 현미경 설정을 채택 할 수 있도록 다른 세포주에서 문제가되지 않는다. 이것은 개개의 세포로의 전위를 분석 할 수있는 가능성을 제공하고, 접착 성 또는 세균성 마이크로 콜로니 (20)의 형성과 같은 숙주 세포의 상호 작용의 특정 이벤트와 전좌를 상관하는데 사용될 수있다. 따라서, 이러한 분석은 더 전좌 박테리아 및 숙주 세포의 상호 작용 동안에 어떻게 조절되는지 메커니즘을 해명하기위한 유용한 도구이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
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