इंटर सेलुलर संचार के भीतर और सेल के बाहर विभिन्न शारीरिक गतिविधियों को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पत्र एकल कक्ष स्राव के spatio- लौकिक प्रकृति को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, एक दृष्टिकोण जीना सेल इमेजिंग के साथ संवेदन लेबल मुक्त nanoplasmonic जो एकीकृत प्रयोग किया जाता है।
Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.
इंटर सेलुलर संचार के अंदर और सेल के बाहर दोनों कई शारीरिक गतिविधियों के नियमन के लिए महत्वपूर्ण है। प्रोटीन और पुटिकाओं की एक किस्म बाद में इस तरह के भेदभाव, घाव भरने, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, प्रवास, और प्रसार के रूप में जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं है कि ट्रिगर स्रावित जा सकता है। अंतर-सेलुलर संकेत रास्ते में से 1-5 खराबी कैंसर, atherosclerosis सहित कई विकारों में फंसाया गया है और मधुमेह, कुछ नाम हैं।
इष्टतम सेल स्राव परख spatially और अस्थायी प्रासंगिक संकेत दे रास्ते में बाधा पहुँचा के बिना ब्याज के स्रावी प्रोटीन मानचित्रण के लिए सक्षम होना चाहिए। इस रास्ते में एकाग्रता प्रोफाइल और प्राप्त कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के बीच अनौपचारिक सम्बन्ध अनुमान लगाया जा सकता है। दुर्भाग्य से, सबसे अधिक इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट आधारित तकनीक के कई इन मानदंडों को पूरा नहीं करते। फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन डब्ल्यू विश्लेष्य टैग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकतासेल Ithin लेकिन स्रावी मार्ग को बाधित कर सकते हैं, या स्रावित करता है, तो, अंदाजा लगाना मुश्किल है जो सेल के बाहर एक फैलाना चमक में परिणाम है। फ्लोरोसेंट immunosandwich आधारित assays सेलुलर स्राव का पता लगाने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया तकनीकों हैं, लेकिन आम तौर पर व्यक्ति की कोशिकाओं के अलगाव की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, संवेदन एंटीबॉडी की शुरूआत आम तौर पर रुकती है या प्रयोग और एंटीबॉडी लेबल के आकार समाप्त होता है 6-11, 150 केडीए आईजीजी के लिए, बहाव के संकेत के लिए एक बाधा है।
इन बाधाओं का यह एक लेबल मुक्त तकनीक, छवि प्रोटीन स्राव करने और मौजूदा लेबल मुक्त प्रौद्योगिकियों के बीच उपयोग किया plasmon अनुनाद (एसपीआर) सतह और स्थानीय सतह plasmon अनुनाद (LSPR) सेंसर उत्कृष्ट उम्मीदवार हैं हो कि बेहतर है क्योंकि। 12-17 इन सेंसर व्यापक रूप से प्रोटीन, exosomes और अन्य बायोमार्कर की विश्लेष्य बाध्यकारी अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। 18-24 LSPR, plasmonic nanostr के मामले मेंuctures कांच coverslips पर पत्थर के छापे से छापने से नमूनों और मानक व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी विन्यास के माध्यम से दृश्य प्रकाश का उपयोग कर उत्साहित किया जा सकता। कारण उनके nanoscale के पदचिह्न के लिए, कांच के अध के बहुमत 25-28। ऐसे रहते सेल माइक्रोस्कोपी के साथ एकीकरण के लिए अनुकूल उज्ज्वल क्षेत्र और अच्छी तरह से इन जांच कर रही है प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में आम इमेजिंग तकनीक के लिए उपलब्ध है हम वास्तविक समय माप का प्रदर्शन किया है क्रमश: 225 मिसे और 10 माइक्रोन के स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ क्रियाशील सोने plasmonic nanostructures का उपयोग कर हाइब्रिडोमा कोशिकाओं से एंटीबॉडी स्राव की। बुनियादी चिप विन्यास चित्रा 1 में सचित्र है। 28 माइक्रोस्कोप के उत्पादन में प्रकाश पथ चित्रण के लिए इस्तेमाल एक सीसीडी कैमरा और nanostructures की दी गई सरणी का आंशिक अधिभोग (चित्रा 2 की मात्रात्मक निर्धारण के लिए एक फाइबर ऑप्टिकली युग्मित स्पेक्ट्रोमीटर के बीच विभाजित है )।
protocएक साथ मानक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की निगरानी करते हुए इस पत्र में प्रस्तुत राजभाषा एकल कक्ष स्राव का वास्तविक समय माप के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन का वर्णन है। इन दोनों क्षेत्रों की दृष्टिकोण सेल लाइनों की nanostructures की निर्माण, analytes की बाध्यकारी उच्च आत्मीयता के लिए nanostructures की functionalization, दोनों गैर विशिष्ट बंधन को कम करने और एक वाणिज्यिक सतह plasmon अनुनाद का उपयोग कर गतिज दर स्थिरांक निस्र्पक (एसपीआर) उपकरण के लिए सतह अनुकूलन, एकीकरण भी शामिल सब्सट्रेट, और कल्पना और वर्णक्रम आंकड़ों के विश्लेषण पर। हम सेल स्राव और प्राप्त कोशिकाओं के साथ उनके कारण रिश्तों की spatio- लौकिक मानचित्रण के लिए एक सक्षम प्रौद्योगिकी होने के लिए इस तकनीक की आशा।
The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.
There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines.
The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.33 Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
25mm diameter glass coverslips | Bioscience Tools | CSHP-No1.5-25 | 170±5 µm is optimal |
Poly-methyl methacrylate | Microchem | PMMA 950 A4 | |
Ethyl lactate methyl metacrylate | Microchem | MMA EL6 | |
Electron beam evaporator | Temescal | FC-2000 | |
Electron beam lithography | Raith | Series 150 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 320110 | |
CR-7 chromium etchant | Cyantek | CR-7 | |
Scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 55 | |
Atomic force microscope | Veeco | Nanoscope III | |
Plasma ashing system | Technics | Series 85 RIE | |
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO) | Prochimia | TH 001-m8.n3-0.2 | |
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC) | Prochimia | TH 003m11n3-0.1 | |
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN) | Prochimia | TH 002-m11.n3-0.2 | |
Surface plasmon resonance system | Biorad | XPR36 | |
Bare gold chip | Biorad | GLC chip | Plasma ashed to remove the monolayer |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo | 22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo | 24510 | |
Pentylamine-Biotin | Thermo | 21345 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
Neutraavidin | Thermo | 31000 | |
Phosphate buffered saline | Thermo | 28374 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axio Observer | Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH |
CCD camera | Hamamatsu | Orca R2 | Thermoelectrically cooled (16 bit) |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65Pro | |
Spectrasuite | Ocean Optics | version1.4 | |
c-myc peptide HyNic Tag | Solulink | SP-E003 | |
monoclonal anti-c-myc antibody | Sigma-Aldrich | M4439 | |
Hybridoma cell line | ATCC | CRL-1729 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Serum free media RPMI 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
Rhodamine DHPE | Life Technologies | L-1392 |