Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.
Flera metoder har använts för att dokumentera och utvärdera gastrointestinal motilitet inklusive: inspelning förändringar i muskelspänningar, intraluminal tryck och membranpotential. Alla dessa metoder är beroende av mätning av aktivitet vid en eller flera platser längs tarmen samtidigt som sedan tolkas för att ge en känsla av övergripande motilitet mönster. På senare tid har utvecklingen av videoinspelningar och spatiotemporal kartläggning (stmap) teknik gjort det möjligt att observera och analysera komplexa mönster i ex vivo hela segment av kolon och tarm. Efter avslutad inspelning och digitaliseras, kan videoinspelningar omvandlas till STmaps där luminala diametern omvandlas till gråskala eller [kartor diameter kallas (Dmaps)] färg. STmaps kan lämna uppgifter om rörlighet riktning (dvs, stillastående, peristaltiska, antiperistaltic), hastighet, varaktighet, frekvens och styrka sammandragande motilitet mönster. Fördelarna med denna metod är: analysis av interaktion eller samtidig utveckling av olika motilitet mönster i olika regioner i samma segment, visualisering av motilitet mönster förändras över tiden, och analys av hur verksamheten i en region påverkar verksamhet i en annan region. Videoinspelningar kan spelas upp med olika tidsramar och analysparametrar så att separata STmaps och motilitet mönster kan analyseras mer i detalj. Detta protokoll specifikt detaljer effekterna av intraluminala vätska utspändhet och intraluminala stimuli som påverkar rörlighet generation. Användningen av luminala receptoragonister och antagonister ger mekanistisk information om hur specifika mönster initieras och hur ett mönster kan omvandlas till ett annat mönster. Tekniken är begränsad av förmågan att endast mäta motilitet som orsakar förändringar i luminala diametern, utan att tillhandahålla data om intraluminala tryckförändringar eller muskelspänningar, och genom alstring av artefakter baserade på experimentuppställning; även om, analysis metoder kan redogöra för dessa frågor. Vid en jämförelse med tidigare tekniker videoinspelning och stmap metod ger en mer övergripande förståelse av gastrointestinal motilitet.
Olika metoder för registrering och analys av tarmmotiliteten har utvecklats under de senaste 150 åren 1. Dessa har varierat från den inledande in vivo-observationer och beskrivningar av William Beaumont och av Walter Cannon till de nyare metoder för mätning och tolkning av multiort registrering av muskelspänningar, intraluminala tryck och / eller membranpotential (dvs. Junktional potentialer) 2 – 6. Dessa sistnämnda tillvägagångssätt ger en ögonblicksbild av de totala motilitet mönster, men begränsas av antalet platser för inspelning och giltigheten av interpolering av data till områden mellan inspelningsplatser.
Den senaste tidens utveckling av videoinspelningar och spatiotemporal kartläggning (stmap) tekniker har gjort det möjligt att observera och analysera komplexa motilitet mönster i ex vivo hela segment av kolon och tarm. Initiala tillvägagångssätt, som först beskrevs för INTEStinal segment i slutet av 1990-talet 7,8, berodde på forskar utvecklad programvara för att analysera videoinspelning; flera grupper har nu skapat eller modifierad mjukvara för detta ändamål 2,8 – 12. Även om många grupper har genererat egna programvarupaket eller plugins, de alla analyserar diameter av mjukpapper och konvertera dessa olika diametrar till gråskala representation. Ett kommersiellt tillgängligt system registrering och analys kallas gastrointestinal motilitet Övervakningssystem (Gimm) ger en nyckelfärdig strategi som möjliggör analys av både framåtdrivande motilitet via fekal pellet hastighetsbestämning i marsvin distala kolon 13 samt analys av framdrivande och blandnings motilitet mönster med en vätska stimulans i intakta tarm segment 4,5,14 – 19. Detta senare tillvägagångssätt beror på generering och analys av STmaps och beskrivs i detta dokument. Målet med denna metod är att öka tHan förmåga att kvalitativt och kvantitativt analysera olika motilitet mönster som finns i tarmen. Medan andra grupper har använt stmap för motilitet analys med hjälp av sin egen programvara, är detta den första beskrivningen av hur man använder Gimm att analysera motilitet mönster genom generering av STmaps. I det aktuella papper, vi ger detaljerade steg-för-steg instruktioner om: framställning av tarmvävnad för videoinspelning, korrekt inställning av videoinspelning parametrar för att maximera möjligheten att upptäcka förändringar i vävnads diameter, skapandet av STmaps, samt tolkning och analys av de STmaps använder Gimm systemet och ImageJ programvara.
Den här beskrivna metoden är specifik för analys av den luminala perfusion av fluider eller halvfasta ämnen innehållande föreningar som påverkar intestinal motilitet mönster. Ett förfarande för analys av fekal pellet framdrivnings beskrives i en artikel av Mawe och kollegor 13. Den allmänna metod som beskrivs här kan varatillämpas på andra rörformiga glatt muskulatur organ såsom: tunntarmen, blodkärl, urinrör, urinledare, etc. Även om denna metod på egen hand inte lämna uppgifter om förändringar i tryck eller muskelspänning, kan det kopplas med användning av tryck omvandlare, kraftomvandlare eller elektrofysiologiska mätningar för att ge en mer fullständig bild av motilitet mönster som vissa andra grupper har visat 2,15,20,21.
Intestinal motilitet har visats och beskrivits från ett antal synvinklar baserat på karaktären av de parametrar som spelas in. Videoinspelning och spatiotemporal kartläggning har visat sig vara ett värdefullt verktyg som gör analys av den totala rörelse och / eller framdrivning under långa delar av tarmen samt analys av verksamheten vid specifika punkter längs segmentet. Tillvägagångssättet för videoinspelning och spatiotemporal kartläggning kan vara dubbel och är reflekterande av det undersökta området och vilken typ av luminala innehållet. I tarm segment där luminala innehållet är mer flytande och i proximala kolon där innehållet är mer halvfasta, är framkallad av intraluminal införsel av vätskan genom bolus eller infusion. Spatiotemporal kartor gjorda av dessa videoinspelningar är utformade för att representera rörelsen hos hela segmentet såsom beskrivits ovan. I motsats, i mitten till distala kolon där innehållet är mer solid, är aktiviteten initieras genom införande av en fekal pellet (epoximålat naturlig pellet eller artificiell pellet) och Spatiotemporal kartor är utformade för att reflektera rörelsen av pelleten genom tjocktarmen, såsom visas i den JOVE artikel av Hoffman et al., 13. Sålunda installationen av experimentet och analys är avgörande och beror på typen av stimulans och regionen som studeras. Därför de kritiska stegen för generering och analys av Spatiotemporal kartor vätska-inducerad intestinal motilitet är: 1) korrekt avlägsnande av tarmkäxet från dissekerade vävnad; 2) korrekt bild kalibrering innan inspelningen; 3) korrekt avlägsnande av artefakter under stmap generering och analys; 4) korrekt inställning av analyssystemet; och 5) vinna fingerfärdighet att ANVÄNDA KATETER och sy segmenten utan att skada dem.
Medan användningen av STmaps av luminala diametern har förbättrat förmågan att visualisera och analysera fullständiga motilitet mönster över en region av tarmen, är tekniken bäst när den kombineras medfunktionella mätningar av tryck eller muskelsammandragning 2,15,20. Till exempel, medan vissa muskelsammandragningar kan ändras luminala diameter något och vara synliga på vissa STmaps (dvs myogena skvalpar) kan de faktiskt inte orsaka någon framdrivning eller blandning av tarminnehåll 25. Detta kan inte vara känd utan koppling av denna teknik på andra funktionella mått. Dessutom leder arten av många vävnadsberedningar i denna typ av system (dvs., ett slutet luminal system eller konstant luminala perfusion av ett pumpsystem) till artefakter inom STmaps. Således måste användaren vara medveten om hur deras specifika organ förberedelse och experiment kan leda till artefakter i data och sätt att undvika eller utesluta dessa artefakter i dataanalys (t.ex. mesenterium-inducerad vertikala linjer eller mörk pixelering på grund av vävnaden oförmåga att utvisa vätska från systemet i en sluten beredning luminal). Det finns flera metoder för luminala perfusion av en itakt intestinal segment förutom ett slutet system. En metod är att istället använda ett öppet system som bibehåller en konstant intraluminal / mottryck genom användning av en upphöjd rör och / eller en backventil på den anala slutet av beredningen 8-10,30. Detta gör att vätskan att flytta ut ur preparatet under drivande sammandragningar.
Eftersom systemet är inställt främst att upptäcka förändringar i luminala diameter, dessa sammandragningar eller motilitet mönster som inte avsevärt påverkar luminala diameter är ofta svårt att visualisera av detta protokoll. Eftersom förändringar i pixel shading inom stmap baseras på förändringar i luminala diameter, kommer motilitet mönster som inte orsakar stora förändringar i diameter visualiseras bra i denna metod om starka sammandragningar är också närvarande i samma inspelning. Som beskrivits för visualisering och analys av rippel-typ kontraktion (Figur 3), inställning av analyslinjerna i videoinspelning närmare to vävnadsväggen kan undvika det här problemet. Denna metod minskar den maximala diametern som visas i stmap, så sammandragningar som endast minimalt ändra vävnads diameter kan visualiseras. Ett annat alternativ för att lösa denna fråga ändra längden på videosegmentet analyseras, för att utesluta sammandragningar som i hög grad påverkar luminala diameter, så att mindre sammandragningar är lättare visualiseras. Detta leder till det potentiella problemet med motilitet som minimalt förändras luminala diametern ser liknar en separat stmap där sammandragningar förändrats kraftigt luminala diametern. Detta beror på att fastställandet av vita pixlar på kartan är baserad på den minsta diametern i en given video. Om det inte finns mycket variation i diameter inom video (liten eller ingen minskning av den cirkulära muskeln) mycket små sammandragningar som inte ändrar diametern av preparatet i hög grad kan likna peristaltiska sammandragningar från en annan video. Därför är det viktigt att tänka på figurenlegend i det övre högra hörnet på kartan. Om skillnaden mellan de högsta och minsta diameter är liten är det viktigt att jämföra stmap till videon det genererades från att avgöra giltigheten av pixelnyansförändring som representerade i stmap. Således är prövningen av skalan bar i samband med den faktiska inspelningen avgörande för korrekt tolkning av kartan.
Videoinspelning och Spatiotemporal kartläggning av intestinala och kolon segment har tillämpats på en mängd olika arter, inklusive zebrafisk 26, mus 25,27 – 30, råtta 7,9,30 – 33, marsvin 5,6,8,13 – 19, 24,30,32,34,35, Brushtail pungråtta 12,36, kanin 2,30,37,38, kyckling 39, gris 40,41 och humant 42. De mest studerade arterna är marsvin. Detta är inte förvånande eftersom marsvin enteriska nervsystemet hsom varit mest fullständigt karaktäriserats och historiskt sett har varit djuret mest studeras in vitro med avseende på framåtdrivande motilitet i tarmen 43. Spatiotemporal kartläggning har huvudsakligen tillämpas på rörformiga segment av tarmen från små djur; Men studier i kanin och gris med hjälp av modifierade system visar tillämpningen av denna metod för att större djur. I fallet av kaninen, är den metod identisk med den för mindre djur, utom att större segment och organbad användes 30. Den metod som används i grisen var att använda en exterioriserad slinga av tarmen från en sövd gris i stället för nedsänkning av en dissekerade vävnad segment i ett organbad. Dessutom var STmaps genereras av korskorrelation i stället för genomlysning metod som används i de flesta studier 40. Den isolerade, vascularly perfusion sling förberedelse för videoinspelning och spatiotemporal kartläggning har också tillämpats på mindre arter såsom råtta <sup> 33. En färsk studie från Kuizenga et al. är den första användningen av STmaps video inspelad motilitet mönster i ex vivo segment av människans tarmar 42; även om STmapping metoder har använts för att analysera manometriska (tryck) inspelningar hos människor in vivo 3,44. De inspelade motilitet mönster i mänsklig vävnad liknar dem som redan registrerats i djurmodeller med hjälp av liknande tekniker och validera en utvidgning av detta synsätt på mänskliga vävnader. Det är anmärkningsvärt att denna studie kombinerade STmaps härrör från videoinspelningar med mätning av muskelsammandragning registreras av kraftgivare. Mätning av intraluminala tryck genom en fiberoptisk manometrisk kateter insatt i ex vivo-segmentet också omvandlas till en stmap, som visar mångsidigheten hos stmap att visualisera mer än förändringar i luminala diameter. Detta kombinerade tillvägagångssättet korrelera muskelspänningar, medger intraluminal tryck och väggrörelseför en mer djupgående funktionell analys av STmaps genereras från videoinspelning.
Studier av STmaps genereras från vägg rörelser och förändringar i luminala diameter (även kallad Dmaps) har tillåtit detaljerade beskrivningar av motilitet mönster som framdrivande peristaltiska vågor och lokala segment sammandragningar. Även om dessa mönster identifierades av tidigare experimentella metoder, kan den nuvarande strategin en mer förfinad definition av lokala kontraktila rörelser som krusningar och nya anti-peristaltiska sammandragningar 9,24,25,30,31,42. Byggandet av STmaps och analys av förändringar i motilitet mönster har tillämpats på nyckelfrågor i gastrointestinal motilitet av tarmen och kolon. Dessa inkluderar: differentiering av neurogena och myogena sammandragningar och definiera rollen av interstitiella celler i Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 – 31,33,37 – 40,42, förstå komplexainteraktioner mellan de cirkulära och longitudinella muskelskikt 2,7,8,11,12,32,39,40, undersöker effekterna av intraluminala näringsämnen 10,18,19, mikrobstammar 34, och viskositeter 12,36 på olika motilitet mönster, och förstå betydelsen av olika endogena neurohormonala medel och exogena farmakologiska medel 2,4 – 7,9,10,13 – 17,28,35,40 i generering och modifiering av rörlighet. Framtiden för denna teknik innebär koppling med andra mätningar, inklusive tryck, elektrofysiologi och spänning / kontraktilitet. Nyligen genomförda studier har ofta införlivat ett eller flera av dessa mätningar i samband med videoinspelning och spatiotemporal kartläggning att tillhandahålla ytterligare korrelat detaljer 2,42. Vidare kan systemet användas för att mäta motilitet i andra rörformiga och icke-rörformiga organ. Exempelvis har försök gjorts till att mäta gastrisk motilitet med hjälp avett sådant system, men tekniken och mjukvara behöver förfining för att bättre kvantifiera rörlighet i en sådan icke-rörformat organ 45. Det råder ingen tvekan om att användningen av ensamma och i kombination med mer traditionella metoder för analys Spatiotemporal kartläggningstekniker kommer att leda till en mer djupgående och omfattande förståelse av gastrointestinal motilitet i framtiden.
The authors have nothing to disclose.
DMK stöddes av ett IRACDA bidrag från NIGMS (K12GM093857) till Virginia Commonwealth University. Detta arbete stöddes av NIDDKD bidrag DK34153 till John R. Grider.
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | For Krebs buffer. |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher | BP366 | For Krebs buffer. |
Potassium Phosphate (KH2PO4) | Fisher | P285 | For Krebs buffer. |
Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | For Krebs buffer. |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C7902 | For Krebs buffer. |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328 | For Krebs buffer. |
Glucose | Sigma | G7021 | For Krebs buffer. |
Carboxygen (95%O2/5%CO2) | |||
Dissecting pins | |||
Dissecting trays/dishes | |||
Dunkin Hartley Guinea Pigs | Charles River | Strain 051 | |
ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | Freely available online. | |
GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM) | Catamount Inc., St. Albans, Vermont | Includes parts listed below. | |
Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
Bath Cameras | Included with GIMM. | ||
Bath TransIllumination Backlights | Included with GIMM. | ||
Organ Baths | Included with GIMM. | ||
Backlight Intensity Controls | Included with GIMM. | ||
GIMM Processor ImageJ Plugin | Included with GIMM. | ||
Polyethylene Tubing | Included with GIMM. | ||
Tubing Connectors | Included with GIMM. | ||
Masterflex tubing for Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
Heating Bath/Water Circulator | Included with GIMM. |