Abstract
Múltiples enfoques se han utilizado para registrar y evaluar la motilidad gastrointestinal, incluyendo: cambios de grabación en la tensión muscular, presión intraluminal, y el potencial de membrana. Todos estos enfoques dependen de la medición de la actividad en uno o varios lugares a lo largo del intestino simultáneamente que luego son interpretadas para proporcionar un sentido de los patrones generales de la motilidad. Recientemente, el desarrollo de la grabación de vídeo y mapeo espacio-temporal (stmap) técnicas han hecho posible observar y analizar los patrones complejos en segmentos ex vivo enteras de colon y el intestino. Una vez registrado y digitalizado, grabaciones de vídeo pueden ser convertidos a STmaps en el que el diámetro luminal se convierte a escala de grises o [mapas llamado diámetro (DMAPS)] de color. STmaps pueden proporcionar datos sobre la dirección de la motilidad (es decir, inmóvil, peristáltica, antiperistáltico), velocidad, duración, frecuencia y fuerza de los patrones de motilidad contráctil. Las ventajas de este enfoque son: analysis de interacción o desarrollo simultáneo de diferentes patrones de motilidad en diferentes regiones del mismo segmento, la visualización del patrón de la motilidad cambia con el tiempo, y el análisis de cómo la actividad en una región actividad influencias en otra región. Las grabaciones de vídeo se pueden reproducir con diferentes plazos y parámetros de análisis para que STmaps separadas y los patrones de motilidad pueden ser analizados con más detalle. Este protocolo detalla específicamente los efectos de distensión líquidos y intraluminales estímulos intraluminales que afectan a la generación de la motilidad. El uso de agonistas de los receptores luminales y antagonistas proporciona información mecanicista sobre la forma específica los patrones se inician y cómo un patrón se puede convertir en otro patrón. La técnica está limitada por la capacidad de medir solamente la motilidad que causa cambios en el diámetro luminal, sin proporcionar datos sobre los cambios de la presión intraluminal o la tensión muscular, y por la generación de artefactos basados en configuración experimental; aunque, analysimétodos s pueden dar cuenta de estas cuestiones. Cuando se compara con las técnicas anteriores, la grabación de vídeo y enfoque stmap proporciona una comprensión más completa de la motilidad gastrointestinal.
Introduction
Varios métodos de registro y análisis de la motilidad intestinal se han desarrollado en los últimos 150 años 1. Estos han oscilado desde la inicial in vivo observaciones y descripciones de William Beaumont y de Walter Cannon a los métodos más recientes de medición e interpretación de la grabación de varios sitios de la tensión muscular, la presión intraluminal, y / o el potencial de membrana (es decir, los potenciales de unión) 2 - 6. Estos últimos enfoques proporcionan una instantánea de los patrones generales de la motilidad, pero están limitadas por el número de sitios de grabación y la validez de la interpolación de los datos a las zonas entre los sitios de grabación.
El reciente desarrollo de la grabación de vídeo y mapeo espacio-temporal (stmap) técnicas han hecho posible observar y analizar los patrones de motilidad complejas en segmentos ex vivo enteras de colon y el intestino. Planteamientos iniciales, primero descritos para INTESsegmentos intes- a finales de 1990, 7,8 dependido de software investigador diseñado para analizar la grabación de vídeo; varios grupos han creado o software modificado para este fin 2,8 - 12. Mientras que muchos grupos han generado sus propios paquetes de software o plugins, todos ellos analizan diámetros de un segmento de tejido y convertir esos diversos diámetros a la representación en escala de grises. Un sistema de registro y análisis comercialmente disponible llamado el sistema de monitoreo motilidad gastrointestinal (GIMM) proporciona un enfoque llave en mano que permite el análisis tanto de la motilidad propulsora a través de determinación de la velocidad pellet fecal en el conejillo de indias colon distal 13 así como el análisis de los patrones de motilidad propulsora y de mezcla con un estímulo de fluido en segmentos intestinales intactas 4,5,14 - 19. Este último enfoque depende de la generación y análisis de STmaps y se describe en este documento. El objetivo de este método es aumentar tque la capacidad para analizar cualitativa y cuantitativamente diferentes patrones de motilidad presentes en el intestino. Mientras que otros grupos han utilizado el análisis de la motilidad stmap para a través de su propio software, esta es la primera descripción de cómo utilizar la GIMM para analizar los patrones de motilidad por generación de STmaps. En el presente trabajo, proporcionamos instrucciones detalladas paso a paso sobre: la preparación de los tejidos intestinales para la grabación de vídeo, ajuste correcto de los parámetros de grabación de vídeo para maximizar la capacidad de detectar cambios en el diámetro del tejido, la creación de STmaps, así como la interpretación y análisis de los STmaps utilizando el sistema de GIMM y el software ImageJ.
El método aquí descrito es específico para el análisis de la perfusión luminal de líquidos o semi-sólidos que contienen compuestos que afectan a los patrones de la motilidad intestinal. Un método para el análisis de la propulsión pellet fecal se describe en un artículo de Mawe y sus colegas 13. El método general que se describe aquí podría seraplicado a otros órganos tubulares musculares lisas, tales como: el intestino delgado, los vasos sanguíneos, la uretra, los uréteres, etc. Si bien este método en su propia no proporciona datos sobre los cambios en la presión o la tensión muscular, podría estar acoplado con el uso de presión transductores, transductores de fuerza o mediciones electrofisiológicas para proporcionar una imagen más completa de los patrones de motilidad como algunos otros grupos han demostrado 2,15,20,21.
Protocol
Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional de la Virginia Commonwealth University (IACUC) aprobó todos los animales y los procedimientos de eutanasia utilizados en este protocolo.
1. Preparación de soluciones
- Preparar 4 l de tampón de Krebs (compuesto por [en mm]: 118 NaCl, KCl 4,75, 1,19 KH 2 PO 4, 1,2 MgSO4, 2,54 CaCl2, 25 NaHCO3, 11 glucosa). Pesar las cantidades apropiadas de cada sustancia química sólida, puesta en el volumen adecuado de agua desionizada y mezclar utilizando un vórtice hasta que la solución es clara.
- Entonces, airear la solución con carboxygen (95% O 2, 5% de CO 2) durante 30 min mientras se calienta a 37 ° C.
- Determinar el pH de la solución, mientras que a 37 ° C (la misma temperatura que en el baño de órganos) y ajustar a pH 7,4 usando HCl si es necesario. Mantenga el tampón de Krebs carboxygenated de forma continua y a 37 ° C durante toda la duración del experimento.
- Ponerlos tubos de entrada y salida de las bombas peristálticas en el depósito de regulación y encender las bombas peristálticas para comenzar la perfusión del tampón de todo el sistema de baño de la tubería y de órganos.
NOTA: Buffer inicialmente puede ser bombeada de nuevo en el recipiente original hasta que la adición de tejido en los baños de órganos o productos químicos en el tampón de perfusión. Esto reduce la cantidad total de almacenamiento intermedio necesario para la experimentación. A continuación, las líneas de perfusión de búfer de salida se deben colocar en un recipiente vacío para que los tampones entrante y saliente no se mezclan. - Calibrar la temperatura del sistema de calefacción en el termostato del baño de manera que el tampón dentro de los baños de órganos se convierte y permanece 37,0 ± 0,5 ° C durante la duración del experimento. Confirmar, y modificar si es necesario, el pH del tampón de Krebs al menos una vez más antes de colocar los segmentos de tejido en el baño en el paso 2.8.
2. Preparación de los tejidos
- La eutanasiaun conejillo de Indias por el uso de dióxido de carbono inhalación / asfixia en una cámara sellada u otro método de eutanasia aprobadas por el comité local de cuidado y uso de animales.
- Después de confirmar la eutanasia del animal, cortar y abrir la pared abdominal longitudinalmente con tijeras de disección y localizar los intestinos. Cortar el mesenterio unido al intestino delgado para ayudar a exponer el ciego.
NOTA: Para confirmar la eutanasia realizar un procedimiento secundario, como toracotomía bilateral aprobado por un comité de cuidado de los animales y el uso. - Ubicar el extremo distal del ciego y el colon proximal seccionar justo distal a su conexión con el ciego. Entonces seccionar el colon proximal de nuevo ~ 8 cm distal a la primera transección.
- Coloque el tejido del colon en una solución de Krebs calentado y carboxygenated (descrito en el apartado 1) para su posterior disección. Pin de los dos puntos en el baño de la disección y el uso de un conjunto más pequeño de la tijera para eliminar la mayor cantidad mesenterio y grasa posible.
- En el hbandeja de disección eated, eliminar todo el contenido intraluminal suavemente la perfusión de tampón de Krebs a través del lumen utilizando una jeringa acoplada a un catéter de extremo romo (para ayudar a prevenir la perforación del tejido). Evitar el exceso de distensión del segmento durante este proceso de perfusión.
- Obtener dos catéteres de tubo de vidrio pulido al fuego (de 3 mm de diámetro) y colocar un pequeño trozo de tubo de polietileno (~ 3 mm de largo y ~ 3 mm de diámetro) alrededor de la parte del tubo de vidrio de entrar en el lumen del tejido.
NOTA: Esto permitirá que la sutura para ser colocado alrededor del tubo de tejido y vidrio para permanecer seguros y no resbala como la preparación se coloca en el baño de órganos y durante cambios en la longitud del tejido. - Inserte un catéter en el extremo oral de la preparación del tejido y atar una sutura alrededor del pequeño trozo de tubo que rodea el catéter usando un nudo de cirujano. Tratar con cuidado para sacar el catéter se retira para asegurar el nudo quede ajustado. A continuación, realice la misma acción en el otro t catéter entrarque aboral final del tejido.
- Una vez que los catéteres están asegurados, mover toda la preparación (tejido más catéteres) de la bandeja de disección en uno de los baños de órganos. Coloque la preparación en el baño con el extremo bucal hacia fuera del usuario.
- Siguiente montar / fijar los catéteres tubo de vidrio al baño de órganos por uno de los dos métodos sugeridos.
NOTA: Asegurar el cristal tubos impiden el segmento de tejido de cambiar la longitud durante el experimento o viene por encima del nivel de la superficie del tampón Krebs en el baño.- Opción A: asegurar la parte superior del tubo de vidrio a la parte superior del lado del baño de órganos plástico a través del uso de la arcilla del moldeador o un clip de plástico.
- Opción B: Asegure los tubos de vidrio a los postes metálicos que sostienen las cámaras encima de la preparación de baño de órganos mediante el uso de clips de plástico.
- Una vez que los catéteres se fijan a la bañera, adjuntar una pieza de 5 cm de tubo en el extremo abierto de cada catéter. Para el gato oralesheter, fije este tubo a una jeringa de 10 ml, que se utiliza para inyectar tampón en el lumen del segmento de colon proximal. Para el catéter aboral, esta pieza de tubo permitirá que el flujo de salida luminal que se dirige hacia un recipiente de recogida (vaso de precipitados de 50 ml, depósito, etc.).
- Uso de la jeringa unida al extremo oral, lentamente ras calentó tampón de Krebs a través del lumen de tejido para asegurar que el líquido puede fluir a través del tejido. Flow es confirmada por la salida de líquido del catéter aboral. Calibrar el sistema de video-grabación (servicio de protocolo 3), mientras que el tejido se equilibra durante 30 minutos.
3. La calibración del sistema de video-grabación
- Calibrar la colocación altura de la cámara, los ajustes de video para el brillo y el contraste, y la distancia horizontal mediante el software.
NOTA: Los mejores ajustes para las configuraciones de perfusión intraluminal son diferentes a los parámetros utilizados para determinar la velocidad de propulsión de pellets 13. - Click en la ficha experimento para la cámara a calibrar. Luego, en el menú "Archivo", haga clic en "Calibrar".
- Una vez que el vídeo aparece en el 'calibrar estación de trabajo "ventana, ajustar la cámara a una altura donde la imagen incluye los extremos de los catéteres insertados en el lumen del colon.
- A continuación, calibrar la distancia horizontal se ve en la imagen con la etiqueta gobernante translúcida adjunta a cada baño.
NOTA: Esta calibración es crucial para los cálculos de software posteriores de diámetro luminal y la velocidad de las ondas contráctiles. - En la misma ventana 'estación de trabajo de calibración ", establezca las directrices verticales rojas para que sean 10 mm de separación de acuerdo con la regla en la imagen de la cámara. A continuación, escriba la distancia adecuada (10 mm) en la ventana de 'cursores distancia' y haga clic en el botón 'CAL'.
- A continuación, ajustar la ganancia, el brillo, y el obturador deslizadores dentro de la ventana 'calibrar estación de trabajo' para modificar la imagen de la cámara de manera queel segmento de tejido aparece como una silueta oscura sobre un fondo claro.
NOTA: La figura 4 muestra buenos y malos ejemplos de este procedimiento de calibración. - Para ajustar correctamente la imagen, también ajustar el enfoque y la apertura perillas en la propia cámara.
- La calibración ha finalizado. Haga clic en "Guardar" y haga clic en "Aceptar" en la ventana emergente, y, finalmente, haga clic en el botón "SALIR".
4. Procedimientos experimentales generales
- Después de los procedimientos de calibración de cámara y 30 min de equilibración tejidos están completos, el nombre de los ensayos en cada protocolo experimental. Nombres de los ensayos pueden basarse en el nombre y la concentración del compuesto y el volumen de líquido que se perfundió intraluminalmente en el segmento de tejido durante esa porción del experimento.
- Entonces, ocluir el tubo que sobresale de la aboral catéter mediante el uso de una abrazadera de tubo.
NOTA: Esto evita que el líquido luminal desde que sale del extremo aboral durante fuexperimentación rther, lo que permite el uso de volúmenes específicos en el lumen para provocar diversos niveles de distensión (Figura 1). - Inyectar aproximadamente 0,7 ml de tampón de Krebs en la luz del colon proximal para proporcionar suficiente distensión para iniciar las contracciones de propulsión en el conejillo de indias preparación ex vivo.
NOTA: Este volumen puede variar ligeramente (0,1 - 0,2 ml) en función de la longitud total del segmento intacto y la cantidad de estiramiento aplicado al segmento en el baño de órganos. - Una vez que el segmento se distiende por el fluido luminal, encienda la cámara y luego grabar la movilidad por un período predeterminado de tiempo (por ejemplo, 10 minutos).
- En concreto, haga doble clic en el juicio apropiado nombre para abrir la vista experimental cámara y luego haga clic en el interruptor en la posición "ON" para ver el campo de la cámara. A continuación, haga clic en el botón de grabación para iniciar la grabación (botón de grabación se mantendrá en rojo mientras la cámara está grabando) unnd haga clic en el botón de grabación de nuevo para detener la grabación.
- Al final de este ensayo distensión control inicial, afloje / eliminar la abrazadera de oclusión del catéter aboral para permitir que el segmento de tejido para impulsar el líquido de distensión fuera del lumen.
- Después de un período de re-equilibración 10 min, repetir este procedimiento con cualquiera de una variedad de nutrientes, agentes bioactivos, fármacos, o agonistas / antagonistas en el fluido luminal para modificar la motilidad propulsora del segmento (por ejemplo, ácidos grasos de cadena corta o decanoico ácido) 10,18.
- Para ayudar a medir cuando el nuevo fluido experimental entra en el segmento de colon, dejar una burbuja de aire cerca del puerto de la jeringa de modo que tras la perfusión de la nueva solución en el colon lumen el progreso de la burbuja permitirá al usuario conocer cuando el fluido experimental ha alcanzado el lumen.
- Continuar la perfusión intraluminal con el catéter aboral abierta hasta que la burbuja ha sido empujado por completo a través de lasistema de perfusión luminal (puede requerir 2-3 ml de líquido de perfusión). Luego, deje que el segmento de tejido para expulsar el fluido a través del catéter aboral abierta para un máximo de 5 min.
NOTA: Después de este procedimiento, el lumen contendrá un volumen insignificante de fluido, lo que permite la perfusión de un volumen conocido de líquido en el lumen.
- Re-ocluir el tubo de catéter luminal aboral usando una abrazadera de tubo (como en el paso 4.3) inyectar el mismo volumen de fluido de distensión como en la condición de control a través de la jeringa. Registrar los patrones de motilidad durante el período experimental para su posterior análisis y la comparación a la condición de Krebs control (como en el paso 4.5).
- Repita las secciones 4.4 - 4.7 del protocolo con diferentes compuestos luminales o diferentes concentraciones del mismo compuesto luminal.
5. Construcción de Spatiotemporal Mapas (STmaps)
- Tras la finalización de la grabación del experimento, haga doble clic en el nombre de una prueba específica para abrir el viento análisisujo para la construcción de un stmap.
- Dentro del área de reproducción de vídeo, ajustar los controles deslizantes de contraste y brillo de la ventana de análisis para que la imagen apropiada para el análisis (silueta tejido negro sobre fondo claro; Figura 4).
NOTA: Si la calibración de la cámara no se realizó adecuadamente antes de comenzar el experimento la imagen sólo puede ser modificada en menor medida en este punto. - Una vez que la imagen se contrasta adecuadamente, establezca las pautas rojas horizontales y verticales dentro de la ventana de la imagen de vídeo para aislar la zona de tejido para el análisis y eliminar áreas que contienen artefactos. Además, seleccionar el segmento de tiempo apropiado de la grabación mediante la determinación del inicio y parada puntos de tiempo para el análisis.
- En concreto, seleccione el puntos inicial y final en el vídeo con el amarillo botones 'B' verde 'A' y en el software de análisis. Ajuste el deslizador de tiempo para el comienzo del segmento de vídeo a analizar y lan haga clic en el 'A' botón verde. A continuación, establezca el control deslizante hasta el final de la serie de sesiones para analizar y haga clic en el botón amarillo 'B'.
- A continuación, haga clic en la pestaña de "análisis del motor 'para abrir la ventana stmap y haga clic en el botón' cronómetro '. Después de hacer clic en el cronómetro, haga clic en el siguiente cursor en cruz en la silueta en negro de tejido dentro de la película grabada para comenzar la generación stmap.
- Después de hacer clic en el punto de mira la silueta del tejido, el software genera y muestra el stmap para esa región del vídeo.
NOTA: Esto puede tardar algunos minutos, dependiendo de la longitud del vídeo seleccionado para su análisis. - Haga clic en 'zoom' para ver una imagen ampliada de la stmap y controles para ajustar la imagen.
- Haga clic en la opción "color" en la ventana de nueva creación para ver el stmap como color en lugar de escala de grises. También, haga clic en la opción "Habilitar" para poder colocar un cursor en píxeles específicos dentro del mapa y vIEW un trazado del cambio en el diámetro luminal para esa región específica de tejido. Haga clic en "Salir" cuando haya terminado.
- Exportar una stmap para su uso en documentos o presentaciones o para analizar más a fondo en ImageJ seleccionando el menú "Archivo", seguido de la selección 'Exportar datos "y luego" Meta File'. Luego nombre el stmap, que se guarda como un archivo .emf y haga clic en el botón "Guardar".
- Alternativamente, guardar las imágenes de la stmap mediante la captura de una captura de pantalla. Esto es necesario para guardar versiones pseudo-color de la stmap.
6. Análisis de la velocidad de la onda contráctil en STmaps
- Para analizar la velocidad de propagación contráctil o duración contracción, primero convertir el archivo de la stmap .emf a .tiff, .gif, .jpg, .bmp o formatos que sean aceptables para ImageJ a través de un programa de conversión de archivos de elección.
NOTA: ImageJ no se abre la salida del formato .emf de los STmaps de software.- Alternatively, el uso de software de captura de pantalla para tomar una imagen de un stmap en la pantalla y guardarla en un formato de archivo adecuado.
- A continuación, abra la stmap re-formateado en ImageJ y abra el plugin GIMMProcessor abriendo el 'menú y seleccionar "Plugins" GIMMProcessor'. Esto abrirá dos 'ventanas GIMMProcessor' y 'Mediciones Tabla.
- Haga clic en la "herramienta de selección rectangular 'dentro de la ventana ImageJ y luego usarlo para delinear haciendo clic y arrastrando a toda la zona de la barra de escala en la esquina superior derecha de la stmap. Después se selecciona esa región, haga clic en el botón 'conjunto de calibración "en el complemento. Por último, inserte la distancia adecuada (mm) y el tiempo (segundos) en el cuadro de calibración de acuerdo con los valores de la barra de escala y haga clic en "Hecho".
- A continuación, haga clic en la herramienta de dibujo lineal en la ventana ImageJ. Dibuje una línea en el stmap por el centro de una contracción que se propaga a lo largo del ángulo de THe inclinación haciendo clic y arrastrando en la imagen stmap. Alternativamente, trace una línea vertical a través de una banda de contracción no se propaga para determinar la duración de contracción.
- Después de la línea se dibuja correctamente (sólo una línea se puede dibujar a la vez), haga clic en el botón de "tomar la medida 'en el plugin para generar una salida de leer de la distancia horizontal, distancia vertical, y la pendiente de la línea; que corresponden a la longitud (mm), el tiempo (sec), y la velocidad (mm / seg), respectivamente. Estos datos se muestran en la ventana 'Mediciones Tabla'.
- Repita el dibujo lineal y el análisis de los pasos varias veces dentro de un stmap dado y guardar los datos como un archivo .gmd. Haga clic en el botón "Guardar" en el plugin y el nombre del archivo. Luego haga clic en "Guardar" de nuevo para completar el proceso. Estos datos luego se pueden comparar con otros datos de los ensayos o se utilizan para volver a dibujar líneas en una stmap.
Representative Results
Entendiendo Spatiotemporal Mapas (STmaps) como Diámetro Maps (DMAPS)
Mientras que los mapas generados por esta técnica son espacio-temporal, cambio en el diámetro luminal del tejido es el parámetro visualizado específicamente en tanto la distancia y el tiempo. El stmap retrata distancia horizontal a lo largo del segmento de tejido en el eje x (en mm) y el tiempo en el eje y (en segundos) con la hora de inicio en el momento que termina la parte superior y en la parte inferior. En la esquina superior derecha hay una leyenda, que muestra los diámetros luminales mínimas y máximas, así como la ampliación, tanto para la x e y ejes (Figuras 1-4). Por lo tanto, diferentes tonos de píxeles dentro de la imagen en escala de grises corresponden a diferentes diámetros luminales. Píxeles más oscuros corresponden a diámetros más amplios y píxeles más claros corresponden a diámetros más pequeños. Por lo tanto, las ondas contráctiles del músculo circular aparecerán como regiones de pixelación más ligero debido a la reducción del diámetro luminal (
Inducidos por distensión luminal Contracciones plantones
En la Figura 1, conejillo de indias colon proximal se distiende con 0,5, 1,0, 1,5, y 2,0 ml de tampón de Krebs durante 5 minutos a cada volumen. Contracciones propagan fueron provocados por todos los volúmenes ≥1.0 ml y aparecen bandas blancas finas en el stmap (Figura 1). Distensión del lumen intestinal provoca el inicio de las contracciones que se propagan. Como se muestra en la Figura 1, el diámetro de la luz aumenta con mayores volúmenes intraluminales y los píxeles de la stmapcorrespondiente a ese diámetro se vuelven más oscuras crear un fondo global más oscuro. En algún nivel de distensión se activa el reflejo peristáltico (1,0 ml; Figura 1), que inicia ondas de propulsión de contracción en el extremo oral que disminuyen el diámetro de la luz y se mueven hacia el extremo anal del segmento (mostrado como una bandas blancas en las Figuras 1 y 4). La contracción representa banda blanca es a menudo precedida por una banda oscura, que representa la relajación aboral por delante de la onda peristáltica (Figura 1C flechas blancas). Estos píxeles blancos y oscuros corresponden a la contracción ascendentes y descendentes componentes de relajación del reflejo peristáltico, respectivamente 22,23. En el stmap en la figura 1 panel A, hay 0 olas de propulsión en 0,0 ml, 0 olas de propulsión en 0,5 ml de distensión, 3 olas de propulsión en 1,0 ml de distensión, 6 olas de propulsión en 1,5 ml de distensión y 5 ondas de propulsión de unt distensión 2,0 ml.
Estacionarios contracciones de nutrientes inducida / Mezcla
Las ondas de propagación de la contracción no son el único patrón de movilidad que puede ser visualizado por STmaps. Patrones de mezcla de la motilidad tales como la segmentación también se pueden ver en STmaps y el correspondiente imagen (Figura 2A). Este patrón es diferente que la propagación de las contracciones. Durante la mezcla patrones muchas contracciones pequeñas, papelería ocurren en diferentes áreas al mismo tiempo (visualizado como varios pequeños cuadrados blancos en la misma línea horizontal, pero no en contacto entre sí). Mientras que cada contracción segmentaria es estacionario y no se mueve en el oral a manera anal como se describe para las contracciones que se propagan, la capacidad de los STmaps para ilustrar los patrones contráctiles complejos durante períodos de tiempo largos permite la visualización de la lenta progresión de las contracciones analmente con el tiempo (Figura 2A flecha negro). La duración decada contracción individuo también puede determinarse trazando una línea vertical a través de la plaza contracción blanco usando ImageJ y el plugin asociado (Figura 2). En este stmap particular, generada a partir de la perfusión intra-colónica de ácidos grasos de cadena corta, la duración media contracción estacionaria es ~ 2 s (rango: 1.9 a 2.1 seg). Mientras mesenterio restante en un segmento de tejido puede causar artefactos en el análisis, los artefactos de línea verticales generadas por mesenterio (Figuras 1B, 2B) pueden ser utilizados para determinar los movimientos musculares longitudinales. En las Figuras 1B y 2B el movimiento horizontal de la línea vertical negro es debido a la contracción y relajación del músculo longitudinal. Este movimiento lateral del músculo longitudinal puede ser visualizado en STmaps como los movimientos horizontales de las bandas verticales generadas por artefactos mesenterio (Figuras 1B, 2B).
ImageJ y Plugin Análisis de STmaps
Tanto la velocidad de una onda que se propaga (Figura 3), así como duración de la contracción (Figura 2) se puede determinar mediante el uso de ImageJ y el plugin GIMMProcessor. En la Figura 3, la velocidad de propagación de ambos ortógrada y retrógrados olas fue de ~ 0,25 mm / seg (rango: 0,21 a 0.35 mm / sec). Como se puede ver en la imagen de vídeo sobre el mapa ST, las líneas de análisis (líneas rojas que forman un cuadro de la imagen de vídeo) se establecieron precisamente en torno a uno de los bordes del segmento de tejido en vez de alrededor de todo el segmento. Este es un uso importante de las directrices contenidas en el software. Ajuste preciso de estas directrices es crucial para el correcto análisis del video analizado con más detalle en la sección de discusión. Esto permite la generación de un stmap que visualiza las contracciones de la ondulación 24 miogénicas. Estas contracciones son miogénico en origen y no cambian diámetro luminal en gran medida. También, diferente dirreflexiones de propagación (ortógrada o retrógrada), que son comunes para ondulaciones, se pueden analizar utilizando esta técnica (Figura 3). Como se muestra en la figura 2 la duración de la contracción puede variar en diferentes regiones del segmento de tejido.
Análisis adecuado de STmaps
Un problema potencial con la creación de STmaps es posible la generación de artefacto debido a la metodología experimental. Por ejemplo, mesenterio a la izquierda en la parte exterior del tejido aumentará el diámetro de lectura para ese segmento del tejido creando una línea vertical en el negro stmap (figuras 1, 2B). La presencia de mesenterio también amplía artificialmente el mapa de escala de grises mediante el aumento de la medición luminal más amplia, lo que resulta en un embotamiento de las mediciones de contraste de la escala. Por esta razón, es mejor para eliminar el mesenterio lo más completamente posible desde el segmento sin perforar el tejido. Un otro artefacto stmap posible es una línea vertical blanca debido a las burbujas dentro del fluido luminal que no se puede contrastar con negro (Figura 4B). Estas burbujas pueden hacer que el diámetro luminal parezca más pequeño que el software de análisis o superponer regiones blanco / luz sobre los patrones de motilidad en el stmap. Por lo tanto, la configuración del segmento de tejido y contraste adecuado de la grabación de vídeo antes de su análisis son absolutamente cruciales para el éxito en la construcción de STmaps (Figura 4). Configuraciones contrastantes correcta e incorrecta se muestran en la Figura 4. Es importante señalar que el ajuste de vídeo, tanto en la calibración de la cámara de pre-experimento y ventana de análisis post-experimento son cruciales para la generación de stmap adecuada y análisis. Calibración imagen inadecuada puede conducir a STmaps con datos inutilizables (Figura 4A).
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Figura 1. ondas que se propagan en el colon proximal. (A) Una curva de distensión-respuesta (realizado en conejillo de indias colon proximal) se utilizó para determinar el volumen de fluido intraluminal apropiada para iniciar la propagación de ondas en este segmento (franjas horizontales blancas). Las flechas negras muestran ejemplos de ondas de propagación de larga duración. Las flechas blancas muestran el artefacto línea causada por la eliminación mesenterio incompleta. (B) Una vista más cercana de la propagación de las contracciones alcanzados por la generación stmap de un experimento similar al Grupo A, pero un video de corta duración. Es fácil observar que las contracciones progresan en lo oral a la dirección anal y para identificar la relajación aboral anterior representa como una zona oscura por delante de la banda blanca en comparación con el panel A. Este mapa también ofrece otra visión de artefactos mesenterio. El cuadro rojo identifica la región de esta stmap ampliado en el panel C. (C) Este panel muestra una vista aún más cerca of el mismo video y mapa de como en el panel B. flechas blancas marcadas punto 'Distensión Fluid' a píxeles oscuros que se deben a la distensión luminal por el líquido aboral a la onda que se propaga. Estas son regiones donde se produce la relajación del músculo circular aboral a la contracción del músculo circular. Tenga en cuenta que las contracciones se propagan ven como líneas completamente horizontales en el panel A debido a la larga escala temporal del mapa. En los paneles B y C el tiempo escalas son progresivamente más corto para que la onda contráctil tiene una pendiente que puede ser medido y reportado como la velocidad del movimiento de las olas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Determinación de la contracción Duración por stmap. (A) de cuy proximal sh de colonujos de un patrón de motilidad de mezcla / segmentaria en respuesta a la perfusión intraluminal de ácidos grasos de cadena corta (butirato). Líneas rojas verticales se han elaborado a través de los períodos de contracción para determinar la duración de contracción utilizando la imagen J y el plugin GIMMProcessor. La flecha negro muestra la dirección aboral de la propagación de las contracciones estacionarias. (B) de multiplicación contracciones en íleon ratón menudo muestran regiones de contracción sostenida. Las flechas verticales dibujadas en este mapa muestran que las regiones más orales permanecieron contratados para una mayor duración. En esta preparación, el extremo anal de la preparación fue cerrado al evitar que el fluido que sale del sistema cerrado durante las contracciones del tejido. La imagen en la parte superior del panel muestra un momento en que todo el extremo oral del tejido se contrae (blanco sobre stmap), mientras que todo el extremo anal se distiende por el fluido (negro en stmap). El movimiento horizontal / lateral del negro vertical en el medio del Panel B muestra stmap movimiento de lacapa muscular longitudinal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Patrones bidireccional Motilidad. Propagar olas pueden moverse tanto en ortógrado (oral anal) y retrógrada (anal orales) direcciones. Flechas negras sólidas muestran propagación ortógrado normal y flechas negras discontinuas muestran la propagación retrógrada. La velocidad de propagación de ambos ortógrada y contracciones retrógradas en este stmap se determinaron mediante análisis ImageJ y eran ~ 0,25 mm / seg. Líneas de análisis de imagen (líneas rojas que forman un cuadro de la imagen de vídeo por encima de la stmap) se establecieron cerca de uno de los bordes del tejido para visualizar contracciones miogénicos dominó que son de baja amplitud, contracciones poco profundas a menudo orientadas en ortógrado, retrograde, o ambas direcciones. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Importancia de contraste adecuado de imágenes para stmap Generación. (A) muestra una imagen inadecuada contrastada y stmap, mientras que el panel B muestra una imagen debidamente contrastada y stmap. En (A) las bandas blancas horizontales generadas a partir de la imagen adecuadamente contrastada (B) no son tan obvias y hay varios artefactos (sombreado blanco) debido a la imagen inicial de estar en escala de grises. En el stmap generada a partir de la imagen correctamente en contraste (B) los artefactos de sombreado blancas de la escala de grises desaparecen y las ondas de propagación son más pronunciados. Además, el sombreado negro representando ah relajaciónead de la onda contráctil de propagación se puede ver en el extremo anal del stmap con cada ola de contracción. En el panel B ilustran las flechas blancas un artefacto stmap generada por una región de la imagen que no pudieron ser adecuadamente contrastada. Este tipo de artefacto se debe principalmente a las burbujas intraluminales que ocasionalmente se producen en la preparación durante el curso del protocolo experimental. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
La motilidad intestinal ha sido visto y descrito de una serie de perspectivas basadas en la naturaleza de los parámetros a ser grabada. La grabación de vídeo y mapeo espacio-temporal ha demostrado ser una herramienta valiosa que permite el análisis de movimiento y / o propulsión general durante largos segmentos del intestino, así como el análisis de la actividad en puntos específicos a lo largo del segmento. El enfoque adoptado para la grabación de vídeo y mapeo espacio-temporal puede ser doble, y es un reflejo de la región examinada y la naturaleza de los contenidos luminales. En los segmentos intestinales donde contenido luminal son más fluidos y en el colon proximal donde los contenidos son más semi-sólido, la actividad es inducida por la introducción intraluminal de líquido mediante bolo o infusión. Mapas espacio-temporales hechas de estos registros de vídeo están diseñados para representar el movimiento de todo el segmento como se describe anteriormente. En cambio, en la segunda mitad de colon distal donde los contenidos son más sólidos, la actividad se inicia mediante la inserción de un pelle fecalt (recubierto con epoxy pellet natural o artificial pellet) y los mapas espacio-temporales están diseñados para reflejar el movimiento de la pastilla a través del colon, como se ilustra en el artículo JOVE de Hoffman et al. 13. Por lo tanto la configuración del experimento y análisis son cruciales y dependen del tipo de estímulo y la región que se está estudiando. Por lo tanto, los pasos críticos para la generación y análisis de mapas espacio-temporales de la motilidad intestinal inducida por el fluido son: 1) la eliminación adecuada de mesenterio del tejido diseccionado; 2) la calibración imagen adecuada antes de la grabación; 3) la eliminación adecuada de los artefactos durante la generación y análisis stmap; 4) la configuración adecuada del sistema de análisis; y 5) la obtención de la destreza manual para cateterizar y suturar los segmentos sin dañarlos.
Aunque el uso de STmaps de diámetro luminal han mejorado la capacidad de visualizar y analizar los patrones de motilidad completos sobre una región de intestino, se utiliza mejor la técnica cuando se combina conmediciones funcionales de presión o la contracción muscular 2,15,20. Por ejemplo, mientras que algunas contracciones musculares pueden cambiar ligeramente el diámetro luminal y ser visibles en algunos STmaps (es decir, ondulaciones miogénicas) que en realidad no puede causar ningún propulsión o de mezcla de los contenidos intestinales 25. Esto no puede ser conocida sin acoplamiento de esta técnica a otras mediciones funcionales. Además, la naturaleza de muchas preparaciones de tejido en este tipo de sistema (es decir, un sistema cerrado luminal o constante de perfusión luminal por un sistema de bomba) conduce a artefactos dentro de STmaps. Por lo tanto, el usuario debe ser consciente de cómo su preparación órgano específico y el experimento puede conducir a artefactos en los datos y las formas de evitar o excluir estos artefactos en el análisis de datos (por ejemplo, líneas verticales inducidos mesenterio-o pixelación oscuro debido a la incapacidad del tejido expulsar el fluido desde el sistema en una preparación luminal cerrado). Existen múltiples métodos para la perfusión luminal de un entacto segmento intestinal además de un sistema cerrado. Un método consiste en utilizar en su lugar un sistema abierto que mantiene una constante presión intraluminal / vuelta a través del uso de un tubo elevada y / o válvula de una vía en el extremo anal de la preparación 8-10,30. Esto permite que el líquido salga de la preparación durante las contracciones de propulsión.
Como el sistema está configurado principalmente para detectar cambios en el diámetro luminal, esas contracciones o patrones de motilidad que no afectan en gran medida de diámetro luminal son a menudo difíciles de visualizar por este protocolo. Dado que los cambios en el sombreado de píxeles dentro de la stmap se basan en cambios en el diámetro luminal, los patrones de motilidad que no causan grandes cambios en el diámetro no serán visualizados bien en este método si contracciones fuertes también están presentes dentro de la misma grabación. Como se ha descrito para la visualización y el análisis de tipo ondulación contracción (Figura 3), el establecimiento de las líneas de análisis en el vídeo de grabación más cerca to la pared del tejido puede obviar este problema. Este método reduce el diámetro máximo que aparece dentro de la stmap, por lo que las contracciones que cambian sólo mínimamente diámetro tejido pueden ser visualizados. Otra opción para resolver este problema está cambiando la duración del segmento de vídeo analizado, para excluir las contracciones que afectan en gran medida de diámetro luminal, de manera que las contracciones más pequeños se visualizan más fácilmente. Esto conduce al problema potencial de la motilidad que cambia mínimamente diámetro luminal mirando similar a un stmap separada donde contracciones cambiaron en gran medida de diámetro luminal. Esto es porque la determinación de píxeles blancos en el mapa se basa en el diámetro más pequeño en un vídeo dado. Si no hay mucha variabilidad en diámetro dentro del vídeo (poca o ninguna contracción del músculo circular) muy pequeñas contracciones que no cambian el diámetro de la preparación en gran medida puede ser similar a contracciones peristálticas de otro video. Por lo tanto, es importante considerar la figuraleyenda en la esquina superior derecha del mapa. Si la diferencia entre los diámetros máximo y mínimo es pequeño, es importante comparar el stmap al video que se generó a partir de determinar la validez del cambio sombra píxel como se representa en la stmap. Por lo tanto, el examen de la barra de escala en conjunción con la grabación real es crítica para corregir la interpretación del mapa.
La grabación de vídeo y mapeo espacio-temporal de segmentos intestinales y colónicas se han aplicado a una variedad de especies, incluyendo el pez cebra 26, ratón 25,27 - 30, rata 7,9,30 - 33, conejillo de indias 5,6,8,13 - 19, 24,30,32,34,35, brushtail zarigüeya 12,36, conejo 2,30,37,38, pollo 39, cerdo 40,41 y humano 42. Las especies más ampliamente estudiado es el conejillo de indias. Esto no es sorprendente ya que el conejillo de indias del sistema nervioso entérico hcomo sido más completamente caracterizados y históricamente ha sido el animal más estudiado in vitro con respecto a la motilidad propulsora del intestino 43. Mapeo espacio-temporal se ha aplicado principalmente a los segmentos tubulares de intestino de animales pequeños; Sin embargo, los estudios en los que utilizan sistemas modificados de conejo y cerdo demuestran la aplicación de esta metodología a los animales más grandes. En el caso del conejo, el enfoque es idéntica a la de los animales más pequeños, excepto que los segmentos más grandes y baños de órganos se utilizaron 30. El enfoque utilizado en el cerdo era utilizar un bucle exteriorizada del intestino de un cerdo anestesiado en lugar de la inmersión de un segmento de tejido diseccionado en un baño de órganos. También, STmaps fueron generados por correlación cruzada en lugar del método utilizado en la transiluminación mayoría de los estudios 40. La preparación de bucle aislado, perfundido vascularmente para la grabación de vídeo y mapeo espacio-temporal también se ha aplicado a las especies más pequeñas, como de rata
Estudios de STmaps generados a partir de movimientos de la pared y cambios en el diámetro luminal (también llamado DMAPS) han permitido descripciones detalladas de los patrones de motilidad tales como ondas peristálticas de propulsión y contracciones segmentales localizadas. Si bien estos patrones fueron identificados por métodos experimentales anteriores, el enfoque actual permite una definición más precisa de los movimientos contráctiles localizados tales como ondulaciones y contracciones antiperistálticos nuevos 9,24,25,30,31,42. La construcción de STmaps y análisis de los cambios en el patrón de la motilidad se han aplicado a las preguntas claves en la motilidad gastrointestinal de intestino y colon. Estos incluyen: la diferenciación de las contracciones neurogénica y miogénicos y definir el papel de las células intersticiales de Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 - 31,33,37 - 40,42, la comprensión de la complejainteracciones entre las capas musculares circular y longitudinal 2,7,8,11,12,32,39,40, examinando los efectos de los nutrientes intraluminales 10,18,19, 34 cepas microbianas, y viscosidades 12,36 sobre diversos patrones de motilidad, y la comprensión del papel de los distintos agentes neurohormonales endógenos y exógenos agentes farmacológicos 2,4 - 7,9,10,13 - 17,28,35,40 en la generación y modificación de la motilidad. El futuro de esta técnica consiste en el acoplamiento con otras mediciones incluyendo la presión, la electrofisiología y la tensión / la contractilidad. Estudios recientes han incorporado a menudo una o más de estas mediciones en conjunción con grabación de vídeo y mapeo espacio-temporal para proporcionar detalles adicionales correlativos 2,42. Por otra parte, el sistema puede ser usado para medir la motilidad en otros órganos tubulares y no tubulares. Por ejemplo, se han hecho intentos en la medición de la motilidad gástrica usandoun sistema de este tipo, pero la técnica y el software necesitan refinamiento para cuantificar mejor la motilidad en un órgano tan no tubular 45. No hay duda de que el uso de técnicas de mapeo espacio-temporales solos y en combinación con los métodos más tradicionales de análisis dará lugar a una profunda y más amplia comprensión de la motilidad gastrointestinal en el futuro.
Acknowledgments
DMK fue apoyado por una beca IRACDA de NIGMS (K12GM093857) a Virginia Commonwealth University. Este trabajo fue apoyado por NIDDKD subvención DK34153 a John R. Grider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | For Krebs buffer. |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | BP366 | For Krebs buffer. |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Fisher | P285 | For Krebs buffer. |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | For Krebs buffer. |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C7902 | For Krebs buffer. |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328 | For Krebs buffer. |
| Glucose | Sigma | G7021 | For Krebs buffer. |
| Carboxygen (95% O2/5% CO2) | |||
| Dissecting pins | |||
| Dissecting trays/dishes | |||
| Dunkin Hartley Guinea Pigs | Charles River | Strain 051 | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | Freely available online. | |
| GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM) | Catamount Inc., St. Albans, Vermont | Includes parts listed below. | |
| Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
| Bath Cameras | Included with GIMM. | ||
| Bath TransIllumination Backlights | Included with GIMM. | ||
| Organ Baths | Included with GIMM. | ||
| Backlight Intensity Controls | Included with GIMM. | ||
| GIMM Processor ImageJ Plugin | Included with GIMM. | ||
| Polyethylene Tubing | Included with GIMM. | ||
| Tubing Connectors | Included with GIMM. | ||
| Masterflex tubing for Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
| Heating Bath/Water Circulator | Included with GIMM. |
References
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