Abstract
Molteplici approcci sono stati utilizzati per registrare e valutare la motilità gastrointestinale, tra cui: i cambiamenti di registrazione in tensione muscolare, la pressione endoluminale, e potenziale di membrana. Tutti questi approcci dipendono misurazione dell'attività in una o più posizioni lungo l'intestino contemporaneamente che vengono poi interpretati per fornire un senso di schemi generali di motilità. Recentemente, lo sviluppo di registrazione video e le tecniche di mappatura spazio-temporale (STmap) hanno permesso di osservare e analizzare modelli complessi in ex vivo interi segmenti di colon e dell'intestino. Una volta registrati e digitalizzati, registrazioni video possono essere convertiti in STmaps in cui il diametro del lume viene convertito in scala di grigi oa colori [chiamato mappe di diametro (DMAP)]. STmaps possono fornire dati sulla direzione motilità (ossia, stazionario, peristaltica, antiperistaltici), velocità, durata, frequenza e la forza contrattile dei modelli di motilità. I vantaggi di questo approccio sono: analysis di interazione o sviluppo simultaneo di diversi schemi di motilità in diverse regioni dello stesso segmento, visualizzazione del modello motilità cambia nel tempo, e l'analisi di come l'attività in una regione influenza l'attività in un'altra regione. Le registrazioni video possono essere riprodotti con differenti scadenze e parametri di analisi in modo che STmaps separati ed i modelli di motilità possono essere analizzati in modo più dettagliato. Questo protocollo dettagli in particolare gli effetti della distensione fluida e intraluminali stimoli intraluminali che influenzano la generazione motilità. L'uso di agonisti e antagonisti dei recettori luminali fornisce informazioni su come meccanicistica specifici modelli sono iniziati e come un modello può essere convertito in un altro modello. La tecnica è limitata dalla capacità di misurare solo la motilità che provoca cambiamenti nel diametro luminale, senza fornire dati su cambiamenti di pressione intraluminale o tensione muscolare, e la generazione di artefatti basate su apparato sperimentale; anche se, analysimetodi s possono spiegare questi problemi. Rispetto alle precedenti tecniche la registrazione video e l'approccio STmap fornisce una comprensione più completa della motilità gastrointestinale.
Introduction
Vari metodi di registrazione e l'analisi motilità intestinale sono state sviluppate nel corso degli ultimi 150 anni 1. Questi hanno spaziato da quella iniziale in vivo osservazioni e descrizioni di William Beaumont e di Walter Cannon ai metodi più recenti di misura e l'interpretazione di registrazione multisito di tensione muscolare, pressione intraluminale, e / o potenziale di membrana (cioè potenziali giunzionali) 2 - 6. Questi ultimi approcci forniscono un'istantanea di modelli generali motilità, ma sono limitati dal numero di siti di registrazione e la validità interpolazione dei dati da zone tra i siti di registrazione.
Il recente sviluppo di registrazione video e le tecniche di mappatura spazio-temporale (STmap) hanno permesso di osservare e analizzare i modelli di motilità complessi ex vivo interi segmenti di colon e dell'intestino. Approcci iniziali, prima descritte per intessegmenti fonodale alla fine del 1990, 7,8 dipendeva software investigatore-progettato per analizzare la registrazione video; molti gruppi hanno ora creato o modificato il software per questo scopo 2,8 - 12. Mentre molti gruppi hanno generato i loro pacchetti software propri o plugin, tutti analizzano diametri di un segmento di tessuti e convertire i vari diametri alla rappresentazione in scala di grigi. Un sistema di registrazione e di analisi disponibili in commercio chiamato il Sistema di monitoraggio motilità gastrointestinale (GIMM) fornisce un approccio chiavi in mano che consente di analizzare sia motilità propulsiva via fecale determinazione velocità pellet nella cavia colon distale 13 così come l'analisi dei modelli di motilità propulsiva e miscelazione con uno stimolo liquido nei segmenti intestinali intatte 4,5,14 - 19. Quest'ultimo approccio dipende la generazione e l'analisi di STmaps ed è descritto in questo documento. L'obiettivo di questo metodo è quello di aumentare tha capacità di analizzare qualitativamente e quantitativamente diversi schemi di motilità presenti nell'intestino. Mentre altri gruppi hanno usato il STmap per l'analisi della motilità attraverso il proprio software, questa è la prima descrizione di come utilizzare il GIMM per analizzare i modelli di motilità dalla generazione di STmaps. Nel presente lavoro, forniamo istruzioni dettagliate passo-passo su: la preparazione dei tessuti intestinali per la registrazione video, la corretta impostazione dei parametri di registrazione video per massimizzare la capacità di rilevare variazioni del diametro del tessuto, la creazione di STmaps, così come il interpretazione e analisi dei STmaps utilizzando il sistema GIMM e software ImageJ.
Il metodo qui descritto è specifico per l'analisi della perfusione luminale dei liquidi o semisolidi contenenti composti che influenzano gli schemi di motilità intestinale. Un metodo per l'analisi di fecale pellet propulsione è descritto in un articolo di Mawe e colleghi 13. Il metodo generale qui descritto potrebbe essereapplicato ad altri organi tubolari muscolari lisce quali: tenue, vasi sanguigni, uretra, ureteri, ecc Mentre questo metodo da solo non fornisce dati sulle variazioni di pressione o tensione muscolare, potrebbe essere accoppiato con l'uso di pressione trasduttori, trasduttori di forza o misurazioni elettrofisiologiche per fornire un quadro più completo dei modelli di motilità come alcuni altri gruppi hanno dimostrato 2,15,20,21.
Protocol
Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali della Virginia Commonwealth University (IACUC) ha approvato tutti gli animali e le procedure di eutanasia utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione di soluzioni
- Preparare 4 L di tampone Krebs (composto [in mm]: 118 NaCl, KCl 4.75, 1.19 KH 2 PO 4, 1.2 MgSO4, 2.54 CaCl 2, 25 NaHCO3, 11 glucosio). Pesare le quantità appropriata di ogni sostanza chimica solida, mettere nel volume adeguato di acqua deionizzata e miscelare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida.
- Poi, aerare la soluzione con carboxygen (95% O 2, 5% CO 2) per 30 minuti durante il riscaldamento a 37 ° C.
- Determinare il pH della soluzione, mentre a 37 ° C (la stessa temperatura come nel bagno organo) e regolare a pH 7,4 con HCl, se necessario. Mantenere il tampone Krebs continuamente carboxygenated ea 37 ° C per tutta la durata dell'esperimento.
- Metterei tubi di afflusso e deflusso delle pompe peristaltiche nel serbatoio tampone e accendere le pompe peristaltiche per iniziare perfusione del buffer di tutto il sistema vasca tubi e organo.
NOTA: Buffer può inizialmente essere pompata nel contenitore originale fino l'aggiunta di due tessuti nei bagni d'organo o di sostanze chimiche nel buffer di perfusione. Questo riduce la quantità totale di tampone richiesto per la sperimentazione. Poi le linee di perfusione tampone in uscita deve essere collocato in un contenitore vuoto in modo che i buffer uscita che in entrata non si mescolano. - Calibrare la temperatura del sistema di riscaldamento sul circolatore bagno in modo che il buffer nei bagni organo diventa e rimane 37,0 ± 0,5 ° C per tutta la durata dell'esperimento. Conferma e modificare, se necessario, il pH del tampone Krebs almeno una volta prima immissione segmenti del tessuto nel bagno nel passo 2.8.
2. Preparazione di tessuti
- Eutanasiauna cavia utilizzando anidride carbonica inalazione / asfissia in una camera sigillata o un altro metodo di eutanasia approvato dalla cura degli animali e l'uso comitato locale.
- Dopo aver confermato l'eutanasia degli animali, tagliare aprire la parete addominale longitudinalmente con le forbici dissezione e individuare gli intestini. Tagliare il mesentere attaccato al piccolo intestino per aiutare a smascherare cieco.
NOTA: Per verificare l'eutanasia eseguire una procedura secondaria, come la toracotomia bilaterale come approvato da un comitato cura degli animali e l'uso. - Individuare l'estremità distale del cieco e il colon prossimale transetto appena distale al suo collegamento al cieco. Poi transetto il colon prossimale di nuovo ~ 8 cm distalmente alla prima resezione.
- Collocare il tessuto del colon in soluzione Krebs riscaldato e carboxygenated (descritto nella sezione 1) per ulteriori dissezione. Pin i due punti nel bagno dissezione e utilizzare un insieme ridotto di forbici per rimuovere la maggior quantità mesenterio e grasso possibile.
- Nella hvassoio dissezione eated, rimuovere tutti i contenuti endoluminale delicatamente perfusione di tampone Krebs attraverso il lume con una siringa accoppiato ad un catetere estremità smussata (per aiutare a prevenire la perforazione del tessuto). Evitare sovradistensione del segmento durante questo processo perfusione.
- Ottenere due cateteri tubo di vetro ribruciate (diametro 3 mm) e posizionare un breve pezzo di tubo di polietilene (~ diametro 3 mm di lunghezza e ~ 3 mm) attorno alla porzione del tubo di vetro di entrare nel lume del tessuto.
NOTA: Questo permetterà la sutura da collocare intorno al tubo di tessuto di vetro e di rimanere sicuro e non scivolare la preparazione viene posto nel bagno organo e durante variazioni di lunghezza del tessuto. - Inserire un catetere nel fine orale della preparazione dei tessuti e legare una sutura intorno al piccolo pezzo di tubo che circonda il catetere con il nodo di un chirurgo. Cercate delicatamente di catetere di nuovo fuori per assicurarsi il nodo è comodo. Quindi, eseguire la stessa azione dall'altro t catetere entrareegli aboral fine del tessuto.
- Una volta che i cateteri sono fissati, spostare l'intera preparazione (tessuto più cateteri) dal vassoio dissezione in uno dei bagni d'organo. Posizionare la preparazione nel bagno con l'estremità orale rivolto verso l'utente.
- Successivo montare / fissare i cateteri tubo di vetro al bagno organo di uno dei due metodi suggeriti.
NOTA: fissare il vetro tubi impediscono il segmento tessuto di modificare la lunghezza durante l'esperimento o venendo sopra il livello del tampone Krebs nel bagno.- Opzione A: Fissare la parte superiore del tubo di vetro alla parte superiore del lato della vasca organo plastica attraverso l'uso di argilla di modellatore o una clip di plastica.
- Opzione B: Fissare i tubi di vetro per i pali di metallo che tengono le telecamere sopra la preparazione bagno organo mediante l'uso di clip di plastica.
- Una volta che i cateteri sono fissate alla vasca, collegare a 5 cm pezzo di tubo all'estremità aperta di ciascun catetere. Per il gatto oraleheter, collegare questi tubi ad una siringa da 10 ml, che sarà utilizzato per iniettare tampone nel lume del colon prossimale segmento. Per il catetere aboral, questo pezzo di tubo consentirà il deflusso luminale di essere diretto in un contenitore di raccolta (50 ml becher, serbatoio, etc.).
- Usando la siringa attaccata all'estremità orale, lentamente a filo riscaldato tampone Krebs attraverso il lume del tessuto per garantire che il liquido può fluire attraverso il tessuto. Il flusso viene confermato uscendo liquido catetere aboral. Calibrare il sistema di video-registrazione (sezione protocollo 3), mentre il tessuto equilibra per 30 min.
3. La calibrazione del sistema di video-recording
- Calibrare il posizionamento altezza della telecamera, le impostazioni video per la luminosità e il contrasto, e la distanza orizzontale utilizzando il software.
NOTA: Le impostazioni migliori per configurazioni perfusione intraluminali sono diverse rispetto alle impostazioni utilizzate per determinare la velocità di pellet di propulsione 13. - Click sulla scheda esperimento per la fotocamera da calibrare. Poi nel menu 'File' click 'Calibra'.
- Una volta che il video viene visualizzato nella finestra 'calibrare workstation', impostare la fotocamera a un'altezza dove l'immagine comprende le estremità dei cateteri inseriti nel lume del colon.
- Poi, calibrare la distanza orizzontale visualizzato nell'immagine utilizzando l'adesivo righello traslucido allegato ad ogni vasca.
NOTA: Questa calibrazione è fondamentale per i calcoli del software successive di diametro luminale e velocità delle onde contrattili. - Nella stessa finestra 'workstation calibrare', impostare le linee guida verticali rosse in modo che essi sono di 10 mm l'uno dall'altro secondo il righello nell'immagine della telecamera. Poi, digitare la distanza adeguata (10 mm) nella finestra 'cursori a distanza »e fare clic sul pulsante' CAL '.
- Avanti, regolare il guadagno, la luminosità, e otturatore cursori all'interno della finestra 'calibrare workstation' per modificare l'immagine della telecamera in modo cheil segmento di tessuto appare come una sagoma scura su uno sfondo chiaro.
NOTA: La figura 4 mostra esempi di questa procedura di calibrazione buoni e cattivi. - Per regolare correttamente l'immagine, regolare anche il focus e apertura manopole la fotocamera stessa.
- La calibrazione è ora completa. Fare clic su 'Salva', quindi su 'OK' nel pop-up, e infine fare clic sul pulsante 'EXIT'.
4. Procedure Generale Sperimentali
- Dopo le procedure di calibrazione della fotocamera e 30 minuti per il raggiungimento dell'equilibrio del tessuto sono completi, il nome delle prove in ciascun protocollo sperimentale. Nomi di prova possono essere basati sul nome e la concentrazione del composto e il volume di liquido che viene endoluminale perfusi nel segmento di tessuto durante quella parte dell'esperimento.
- Poi, occludere il tubo che sporge dal catetere aboral attraverso l'uso di un morsetto del tubo.
NOTA: Questo impedisce luminale liquido di uscire alla fine aboral durante Fusperimentazione rther, permettendo l'uso di specifici volumi nel lume di provocare vari livelli di distensione (Figura 1). - Iniettare circa 0,7 ml di tampone Krebs nel lume del colon prossimale per fornire abbastanza distensione di avviare contrazioni propulsive nella cavia ex vivo preparazione.
NOTA: Questo volume può variare leggermente (0,1 - 0,2 ml) in funzione della lunghezza complessiva del segmento intatto e la quantità di stirata applicata al segmento nel bagno organo. - Una volta che il segmento è dilatato dal fluido luminale, accendere la fotocamera e quindi registrare la motilità per un periodo predeterminato di tempo (ad esempio, 10 min).
- In particolare, fare doppio clic sul processo nome appropriato per aprire la vista sperimentale fotocamera e quindi l'interruttore in posizione "ON" per visualizzare il campo della fotocamera. Quindi, fare clic sul pulsante di registrazione per iniziare la registrazione (pulsante di registrazione rimarrà rosso mentre la fotocamera è di registrazione) unand fare di nuovo clic sul pulsante di registrazione per interrompere la registrazione.
- Al termine di questo processo iniziale distensione controllo, svitare / rimuovere il morsetto occludere il catetere aboral per consentire il segmento tissue per spingere il liquido distendere fuori del lume.
- Dopo 10 min periodo di riequilibrio, ripetere questa procedura con qualsiasi di una varietà di sostanze nutritive, agenti bioattivi, farmaci o agonisti / antagonisti nel fluido luminale modificare la motilità propulsiva del segmento (ad esempio, acidi grassi a catena corta o decanoico L'acido) 10,18.
- Per aiutare calibro quando il nuovo fluido sperimentale entra nel segmento colico, lasciare una bolla d'aria vicino al porto della siringa in modo che dopo la perfusione della nuova soluzione nel colon lume il progresso della bolla permetterà all'utente di sapere quando il fluido sperimentale ha raggiunto il lume.
- Continuare perfusione intraluminale con il catetere aborale aperta finché la bolla è stato premuto completamente attraverso ilsistema di perfusione luminale (può richiedere 2-3 ml di perfusato). Poi, consentono il segmento tessuto di espellere fluido attraverso il catetere aboral aperta per 5 min.
NOTA: Dopo questa procedura, il lumen conterrà un volume d'fluido, consentendo perfusione di un volume noto di liquido nel lume.
- Re-occludere il tubo del catetere luminale aboral utilizzando un morsetto tubo (come al punto 4.3) iniettare lo stesso volume di distensione fluido come nella condizione di controllo attraverso la siringa. Registra gli schemi di motilità del periodo sperimentale per successiva analisi e confronto alla condizione Krebs di controllo (come nel passaggio 4.5).
- Ripetere paragrafi 4.4 - 4.7 del protocollo con diversi composti luminali o diverse concentrazioni dello stesso composto luminale.
5. Costruzione di mappe spazio-temporale (STmaps)
- Dopo il completamento della registrazione dell'esperimento, fare doppio clic sul nome di un processo specifico per aprire il vento analisiow per la costruzione di un STmap.
- All'interno dell'area di riproduzione video, regolare i cursori contrasto e della luminosità nella finestra di analisi per rendere l'immagine appropriata per l'analisi (nero silhouette tessuto su sfondo chiaro, figura 4).
NOTA: Se la calibrazione fotocamera non è stata eseguita in modo appropriato prima di iniziare l'esperimento l'immagine può essere modificata solo in misura minore, a questo punto. - Quando l'immagine è contrastata correttamente, impostare le linee orizzontali e verticali rossi all'interno della finestra immagine video per isolare la regione di tessuto per l'analisi e rimuovere le aree contenenti artefatti. Inoltre, selezionare il segmento temporale appropriata dalla registrazione determinando inizio e fine punti di tempo per l'analisi.
- In particolare, selezionare il punti iniziali e finali all'interno del video utilizzando i pulsanti gialli 'B' verde 'A' e all'interno del software di analisi. Impostare il cursore tempo per l'inizio del segmento video per analizzare e lan fare clic sul pulsante 'A' verde. Quindi, impostare il cursore alla fine del segmento per analizzare e fare clic sul pulsante giallo 'B'.
- Avanti, fare clic sulla scheda 'analisi motore' per aprire la finestra STmap e fare clic sul pulsante 'cronometro'. Dopo aver cliccato il cronometro, prossimo clicca il cursore a croce all'interno della sagoma nera del tessuto all'interno del filmato registrato per iniziare generazione STmap.
- Dopo aver cliccato il mirino nella silhouette del tessuto, il software genera e visualizza il STmap per quella regione del video.
NOTA: Questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti a seconda della lunghezza del video selezionato per l'analisi. - Fare clic su 'Zoom' per vedere l'immagine ingrandita della STmap e controlli per regolare l'immagine.
- Selezionare l'opzione 'colore' nella finestra appena creata per visualizzare l'STmap come colore invece che in scala di grigi. Inoltre, fare clic sull'opzione 'Abilita' per essere in grado di posizionare il cursore su specifici pixel all'interno della mappa e view un tracciato della variazione di diametro luminale per quella regione tessuto specifico. Fare clic su 'Exit' una volta terminato.
- Esportare un STmap per l'uso in documenti o presentazioni o per analizzare ulteriormente in ImageJ selezionando il menu 'File', poi selezionando 'esportazione dati' e poi 'Meta File'. Nome della STmap, che sarà salvato come file EMF e fare clic sul pulsante 'Salva'.
- In alternativa, salvare le immagini del STmap catturando uno screenshot. Ciò è necessario per salvare le versioni pseudo-colore del STmap.
6. Analisi della contrattile della velocità dell'onda in STmaps
- Per analizzare la velocità di propagazione contrattile o la durata di contrazione, prima convertire il file STmap .emf a .tiff, .gif, .jpg, .bmp o formati che siano accettabili per ImageJ attraverso un programma di conversione di file di scelta.
NOTA: ImageJ non apre il formato di output EMF dei STmaps dal software.- Alternatively, uso software cattura screenshot per scattare una foto di un STmap sullo schermo e salvarlo in un formato di file appropriato.
- Quindi aprire il STmap ri-formattato in ImageJ e quindi aprire il plugin GIMMProcessor aprendo il 'menu e selezionando' "Plugins GIMMProcessor '. Si aprirà due' finestre GIMMProcessor 'e' Misure Tabella.
- Fare clic sul 'strumento di selezione rettangolare' all'interno della finestra di ImageJ e quindi utilizzarlo per delineare cliccando e trascinando l'intera area della barra di scala nell'angolo in alto a destra della STmap. Dopo aver selezionato quella regione, fare clic sul pulsante 'set di calibrazione' nel plugin. Infine, inserire la distanza adeguata (mm) e il tempo (sec) nella casella di taratura secondo i valori sulla barra di scala e fare clic su 'Fatto'.
- Avanti, fare clic sullo strumento di disegno riga nella finestra di ImageJ. Tracciare una linea sul STmap attraverso il centro di una contrazione propaga lungo l'angolo di the pendenza cliccando e trascinando l'immagine STmap su. In alternativa, tracciare una linea verticale attraverso una banda di non propagazione contrazione per determinare la durata di contrazione.
- Dopo che la linea è disegnata in modo appropriato (una sola riga, può essere oggetto alla volta), fare clic sul pulsante 'prendere la misura' nel plugin per generare una lettura-out della distanza orizzontale, distanza verticale, e la pendenza della linea; che corrispondono alla lunghezza (mm), il tempo (sec), e la velocità (mm / sec), rispettivamente. Questi dati vengono visualizzati nella finestra 'Misure Table'.
- Ripetere il disegno al tratto e l'analisi i passaggi più volte all'interno di un determinato STmap e salvare i dati in un file .gmd. Fare clic sul pulsante 'Salva' nel plugin e il nome del file. Quindi fare clic di nuovo 'Salva' per completare il processo. Questi dati possono poi essere confrontati con altri dati di prova o utilizzati per ri-disegnare linee su un STmap.
Representative Results
Comprendere mappe spazio-temporali (STmaps) come mappe Diametro (DMAP)
Mentre le mappe generati da questa tecnica sono spaziotemporale, variazioni del diametro luminale del tessuto è il parametro specifico sia visualizzato in distanza e tempo. Il STmap ritrae distanza orizzontale lungo il segmento tissue l'asse x (in mm) e l'ora l'asse y (in sec) con il tempo di avviamento al momento alto e termina nella parte inferiore. Nell'angolo in alto a destra è una leggenda, che visualizza diametro luminale minimo e massimo, nonché di scala sia per la xey assi (Figure 1-4). Così, diverse tonalità di pixel all'interno dell'immagine in scala di grigio corrispondono a differenti diametri luminale. Più scuri pixel corrispondono ai diametri più ampi e pixel più chiari corrispondono ai diametri più piccoli. Pertanto, onde contrattili del muscolo circolare appariranno come regioni di pixelation leggero a causa della riduzione del diametro luminale (
Luminal distensione-indotte moltiplicazione Contrazioni
Nella figura 1, cavia colon prossimale è dilatato con 0,5, 1,0, 1,5, e 2,0 ml di tampone Krebs per 5 minuti a ciascun volume. Contrazioni moltiplicazione stati suscitato da tutti i volumi ≥1.0 ml e appaiono bande bianche sottili nella STmap (Figura 1). La distensione del lume intestinale provoca l'apertura di contrazioni moltiplicazione. Come mostrato in figura 1, il diametro del lume aumenta con maggiori volumi intraluminali e i pixel del STmapcorrisponde al suo diametro diventa più scuro creando uno sfondo scuro complessiva. Ad un certo livello di distensione viene attivato il riflesso peristaltico (1,0 ml; Figura 1), che avvia onde propulsive di contrazione al termine orale che riducono il diametro del lume e si muovono verso la fine anale del segmento (mostrato come bande bianche nelle figure 1 e 4). Il bianco contrazione banda rappresenta è spesso preceduta da una banda scura, che rappresenta il rilassamento aboral avanti dell'onda peristaltica (frecce bianche Figura 1C). Questi pixel bianchi e neri corrispondono alla contrazione ascendenti e discendenti componenti rilassamento del riflesso peristaltico, rispettivamente 22,23. Nella STmap nella figura 1 pannello A, ci sono 0 onde propulsive a 0.0 ml, 0 onde propulsivi a 0,5 ml distensione, 3 onde propulsivi a 1,0 ml distensione, 6 onde propulsivi a 1,5 ml distensione, e 5 onde propulsivi unt 2,0 ml distensione.
Stazionari / contrazioni miscelazione nutrienti indotta
Ondate di moltiplicazione contrazione non sono l'unico motivo motilità che può essere visualizzato con STmaps. Modelli miscelazione della motilità come segmentazione può essere visto anche in STmaps e corrispondente immagine (Figura 2A). Questo modello è diverso da quello di moltiplicazione contrazioni. Durante la miscelazione modelli molti piccoli, contrazioni stazionari si verificano in diverse aree contemporaneamente (visualizzato come più piccoli quadrati bianchi nella stessa linea orizzontale, ma non si toccano). Mentre ogni contrazione segmentale è fermo e non si muove nella orale maniera anale come descritto per contrazioni di moltiplicazione, la capacità dei STmaps per illustrare modelli contrattili complessi lunghi periodi di tempo permette la visualizzazione della lenta progressione delle contrazioni anally nel tempo (Figura 2A freccia nera). La durata diogni individuo contrazione può essere determinato anche tracciando una linea verticale attraverso la piazza contrazione bianco utilizzando ImageJ e il plugin associato (Figura 2A). In questo particolare STmap generato da perfusione intra-colon degli acidi grassi a catena corta, la durata media contrazione stazionaria è ~ 2 sec (range: 1,9-2,1 sec). Mentre mesentere rimanente su un segmento tessuto può causare artefatti di analisi, gli artefatti generati da linee verticali mesentere (figure 1B, 2B) possono essere utilizzati per determinare movimenti muscolari longitudinali. Nelle figure 1B e 2B il movimento orizzontale della linea verticale nera è dovuta alla contrazione e rilassamento della muscolatura longitudinale. Questo movimento laterale del muscolo longitudinale può essere visualizzato su STmaps come movimenti orizzontali delle bande verticali generati dai manufatti mesentere (figure 1B, 2B).
ImageJ e Plugin Analisi di STmaps
Sia la velocità di un'onda di propagazione (Figura 3) così come la durata di contrazione (figura 2) può essere determinata utilizzando ImageJ e il plugin GIMMProcessor. Nella Figura 3, la velocità di propagazione delle onde sia ortograda e retrogrado era ~ 0.25 mm / sec (range: 0.21 al 0.35 mm / sec). Come si può vedere l'immagine video sopra la mappa in ST, le linee di analisi (linee rosse che formano una scatola sull'immagine video) sono stati fissati proprio attorno un bordo del segmento tessuti anziché intorno all'intero segmento. Si tratta di un importante utilizzo delle linee guida nel software. Regolazione precisa di queste linee guida è fondamentale per una corretta analisi del video come ulteriormente analizzati nella sezione di discussione. Questo permette la generazione di un STmap che visualizza miogeniche contrazioni ondulazione 24. Queste contrazioni sono miogenico di origine e non cambiano diametro luminale notevolmente. Inoltre, dir diversoriflessioni di propagazione (ortograda o retrogradi), che sono comuni per increspature, possono essere analizzati utilizzando questa tecnica (Figura 3). Come mostrato in figura 2 la durata della contrazione può variare nelle diverse regioni del segmento tissue.
Analisi corretta di STmaps
Un potenziale problema con la creazione di STmaps è possibile generazione artefatto dovuto alla metodologia sperimentale. Per esempio, mesentere lasciato all'esterno del tessuto aumenta il diametro lettura per quel segmento del tessuto creando una linea nera verticale sulla STmap (figure 1, 2B). La presenza di mesentere anche amplia artificialmente mappa scala di grigi aumentando la misura più larga lume, che si traduce in un'attenuazione delle misure di contrasto della scala. Per questo motivo è utile per rimuovere il mesentere più completamente possibile dal segmento senza perforare il tessuto. Un altra possibile artefatto STmap è una linea verticale bianca a causa di bolle all'interno del fluido luminale che non può essere contrapposta al nero (Figura 4B). Queste bolle possono rendere il diametro luminale sembrare più piccolo al software di analisi o sovrapporre regioni bianco / luce sugli schemi di motilità del STmap. Pertanto, l'installazione del segmento del tessuto e proprio contrasto della registrazione video prima analisi sono assolutamente cruciale per il successo nella costruzione STmaps (Figura 4). Configurazioni contrastanti corretta e non sono mostrati in Figura 4. È importante notare che la regolazione video sia la calibrazione della camera di pre-esperimento e finestra di analisi post-esperimento sono cruciali per la generazione STmap corretta ed analisi. Calibrazione dell'immagine non corretta può portare a STmaps con dati inutilizzabili (Figura 4A).
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Figura 1. onde che si propagano nel colon prossimale. (A) Una curva distensione-risposta (eseguita nella cavia colon prossimale) è stata utilizzata per determinare il volume di fluido intraluminale opportuno avviare propagazione delle onde in questo segmento (bande bianche orizzontali). Frecce nere illustrano esempi di onde di propagazione full-length. Frecce bianche illustrano l'artefatto linea causato dalla rimozione mesentere incompleta. (B) Una visione più ravvicinata di moltiplicazione contrazioni raggiunti dalla generazione STmap da un esperimento simile a Pannello A, ma un video di durata più breve. È facile notare che le contrazioni progrediscono in direzione orale anale e per identificare il rilassamento aboral precedente rappresentato come un'area scura avanti della banda bianca rispetto al pannello A. Questa mappa fornisce anche un'altra vista di manufatti mesentere. La scatola rossa identifica la regione di questo STmap ampliato nel Pannello C. (C) Questo pannello mostra una visione ancora più vicina of lo stesso video e la mappa come nel pannello frecce B. Bianchi etichettati punto 'Distensione Fluid' di pixel scuri che sono dovuti a luminale distensione da aborale fluido l'onda di propagazione. Si tratta di regioni in cui si verifica il rilassamento muscolare circolare aborale alla contrazione muscolare circolare. Si noti che le contrazioni si propagano sembrano linee completamente orizzontali nel pannello A causa della lunga scala temporale della mappa. Nei pannelli B e C il tempo di scale sono graduale diminuzione in modo che l'onda contrattile ha una pendenza che può essere misurato e riportato come la velocità del movimento delle onde. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Determinazione della contrazione durata per STmap. (A) Cavia prossimale del colon shOWS un modello motilità miscelazione / segmentale in risposta alla perfusione endoluminale di acidi grassi a catena corta (butirrato). Linee rosse verticali sono state elaborate attraverso i periodi di contrazione per determinare la durata contrazione utilizzando immagine J e il plugin GIMMProcessor. La freccia nera indica la direzione di propagazione aboral delle contrazioni stazionari. (B) contrazioni moltiplicazione in topo ileo spesso mostrano regioni di contrazione sostenuta. Frecce verticali disegnate su questa mappa mostra che le regioni più orali rimasti contratti per una durata più lunga. In questa preparazione, la fine anale della preparazione venne chiuso per evitare fluido di lasciare il sistema chiuso durante le contrazioni del tessuto. L'immagine in alto del pannello mostra un momento in cui l'intera parte orale del tessuto è contratta (bianco su STmap), mentre l'intera parte anale è distesa da fluido (nera STmap). Il movimento orizzontale / laterale del nero verticale nel centro del pannello B STmap mostra il movimento delstrato muscolare longitudinale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Schemi bidirezionale motilità. Propagazione onde possono muoversi in entrambe ortogrado (orale anale) e retrograda (anale orali) direzioni. Frecce nere indicano Solid normale propagazione ortograda e frecce nere tratteggiate mostrano propagazione retrograda. La velocità di propagazione sia orthograde e contrazioni retrogrado in questo STmap stati determinati mediante analisi ImageJ ed erano ~ 0.25 mm / sec. Linee di analisi delle immagini (linee rosse che formano una scatola dell'immagine video qui sopra la STmap su) sono stati posti a distanza ravvicinata un bordo del tessuto di visualizzare contrazioni ripple miogenici che sono bassa ampiezza, contrazioni poco profondi spesso orientati in ortograda, retrograde, o entrambe le direzioni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. L'importanza del contrasto delle immagini per STmap generazione. (A) mostra un'immagine impropriamente contrastato e STmap, mentre riquadro B mostra un'immagine adeguatamente contrastata e STmap. In (A) le bande orizzontali bianche generato dall'immagine correttamente contrastata (B) non sono così evidenti e ci sono più artefatti (ombreggiamento bianco) a causa l'immagine iniziale di essere in scala di grigi. Nella STmap generato dalla corretta contrastata immagine (B) i manufatti di ombreggiatura bianchi della scala di grigi scompaiono e onde di propagazione sono più pronunciate. Inoltre, l'ombreggiatura nero che rappresenta il rilassamento ahead della propagazione dell'onda contrattile può essere visto nel fine anale del STmap con ogni onda di contrazione. Nel pannello B frecce bianche illustrano un artefatto STmap generato da una regione dell'immagine che non possono essere adeguatamente contrastata. Questo tipo di artefatto è in gran parte dovuto alle bolle intraluminali che ogni tanto si verificano nella preparazione durante il corso del protocollo sperimentale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Motilità intestinale è stato visto e descritto da diversi punti di vista in base alla natura dei parametri in registrazione. Video registrazione e mappatura spaziotemporale è dimostrato uno strumento prezioso che permette l'analisi di movimento complessivo e / o spinta su lunghe segmenti di intestino e analisi dell'attività in punti specifici lungo il segmento. Il metodo adottato per la registrazione video e mappatura spaziotemporale può essere duplice e è riflettente della regione esaminato e la natura del contenuto luminale. Nei segmenti intestinali cui contenuto luminale più fluidi e colon prossimale cui contenuti sono più semi-solido, l'attività è indotta dall'introduzione di fluido intraluminale in bolo o per infusione. Mappe spazio-temporali in queste registrazioni video sono progettati per rappresentare il movimento dell'intera segmento come descritto sopra. Al contrario, nel medio colon distale, dove i contenuti sono più solide, l'attività è iniziata da inserimento di una pelle fecalet (epossidiche pellet naturali o artificiali pellet) e le mappe spazio-temporali sono progettati per riflettere il movimento del pellet attraverso i due punti come illustrato nell'articolo JOVE di Hoffman et al. 13. Così la configurazione dell'esperimento e l'analisi sono cruciali e dipende dal tipo di stimolo e la regione in fase di studio. Pertanto, le fasi critiche per la generazione e l'analisi delle mappe spazio-temporali di liquido indotta motilità intestinale sono: 1) corretta eliminazione del mesentere dal tessuto sezionato; 2) calibrazione dell'immagine corretta prima della registrazione; 3) la corretta rimozione di artefatti durante la generazione e l'analisi STmap; 4) la corretta configurazione del sistema di analisi; e 5) conquistando la manualità cateterizzare e suturare i segmenti senza danneggiarli.
Mentre l'uso di STmaps di diametro luminale hanno migliorato la capacità di visualizzare e analizzare i modelli completi motilità su una regione dell'intestino, la tecnica è ottimale quando accoppiato conmisurazioni funzionali di pressione o di contrazione muscolare 2,15,20. Ad esempio, mentre alcune contrazioni muscolari possono cambiare diametro luminale leggermente ed essere visibile su alcuni STmaps (cioè, ondulazione miogenici) non possono effettivamente causare alcun propulsione o la miscelazione del contenuto intestinale 25. Questo non può essere conosciuta senza giunto di questa tecnica per altre misurazioni funzionali. Inoltre, la natura di molti preparati tissutali in questo tipo di sistema (cioè, un sistema chiuso o luminale costante perfusione luminale da un sistema di pompa) comporta difetti all'interno STmaps. Così, l'utente deve essere a conoscenza di come la loro preparazione organo specifico e esperimento può portare ad artefatti nei dati e modi per evitare o escludere questi artefatti di analisi dei dati (ad esempio, linee verticali mesentere indotta o pixelation buio a causa dell'incapacità del tessuto espellere fluido dal sistema in un preparato luminale chiuso). Esistono diversi metodi per perfusione luminale di un intatto segmento intestinale oltre ad un sistema chiuso. Un metodo è quello di utilizzare invece un sistema aperto che mantiene costante intraluminale / indietro pressione attraverso l'uso di un tubo in rilievo e / o la valvola unidirezionale sull'estremità anale della preparazione 8-10,30. Questo permette al fluido di muoversi fuori dalla preparazione durante contrazioni propulsive.
Poiché il sistema è configurato principalmente per rilevare i cambiamenti di diametro luminale, quelle contrazioni o modelli di motilità che non incidono notevolmente diametro luminale sono spesso difficili da visualizzare da questo protocollo. Poiché l'evoluzione delle shading pixel all'interno della STmap sono basati su variazioni di diametro luminale, schemi di motilità che non provocano grandi cambiamenti nel diametro non saranno visualizzati anche in questo metodo se contrazioni forti sono presenti anche all'interno della stessa registrazione. Come descritto per la visualizzazione e l'analisi di ondulazione tipo di contrazione (figura 3), cala analisi della registrazione video vicina to la parete tessuto può ovviare a questo problema. Questo metodo riduce il diametro massimo visualizzato all'interno STmap, così contrazioni che cambiano solo minimamente diametro tessuto possono essere visualizzati. Un'altra opzione per risolvere questo problema sta cambiando la durata del segmento video analizzato, per escludere contrazioni che influenzano notevolmente diametro luminale, cosicché contrazioni più piccoli sono più facilmente visualizzate. Questo porta al potenziale problema di motilità che cambia minimamente diametro luminale cercando simile a un STmap separato dove contrazioni notevolmente cambiati diametro luminale. Questo perché la determinazione di pixel bianchi sulla mappa si basa sul diametro più piccolo in un determinato video. Se non c'è molto variabilità del diametro all'interno del video (poca o nessuna contrazione del muscolo circolare) molto piccole contrazioni che non cambiano il diametro del preparato può notevolmente simile a contrazioni peristaltiche da un altro video. Pertanto, è importante considerare la figuraleggenda nell'angolo in alto a destra della mappa. Se la differenza tra i diametri massimo e minimo è piccola, è importante confrontare il STmap al video è stato generato per determinare la validità del cambiamento ombra pixel come rappresentato nel STmap. Pertanto, l'esame della barra della scala in collaborazione con la registrazione effettiva è fondamentale per la corretta interpretazione della mappa.
Registrazione video e mappatura spazio-temporale di segmenti intestinali e del colon sono stati applicati a una varietà di specie, tra cui 26 zebrafish, topo 25,27 - 30, ratto 7,9,30 - 33, cavia 5,6,8,13 - 19, 24,30,32,34,35, trichosurus 12,36, coniglio 2,30,37,38, pollo 39, maiale 40,41 e umano 42. Le specie più studiati è la cavia. Questo non è sorprendente perché la cavia sistema nervoso enterico hcome stato più completamente caratterizzata e storicamente è stato l'animale più studiato in vitro per quanto riguarda la motilità propulsiva dell'intestino 43. Mappatura spazio-temporale è stato per lo più applicata ai segmenti tubolari di budella da piccoli animali; tuttavia, gli studi nei sistemi modificati utilizzando il coniglio e maiale dimostrano l'applicazione di questa metodologia di animali più grandi. Nel caso del coniglio, l'approccio è identico a quello degli animali inferiori, salvo che i segmenti grandi e bagni di organi sono stati utilizzati 30. L'approccio utilizzato nel maiale era di utilizzare un ciclo di esteriorizzato dell'intestino da un suino anestetizzato piuttosto che l'immersione di un segmento di tessuto sezionato in un bagno d'organo. Inoltre, STmaps sono stati generati da cross-correlazione piuttosto che il metodo utilizzato nella transilluminazione maggior parte degli studi 40. L'isolato, vascularly perfuso preparazione loop per la registrazione video e la mappatura spazio-temporale è stata applicata anche alle specie più piccole, come ratto
Studi di STmaps generati dai movimenti a muro e variazioni del diametro luminale (chiamato anche DMAP) hanno permesso la descrizione dettagliata dei modelli di motilità come le onde peristaltiche propulsive e le contrazioni segmentale localizzati. Mentre questi modelli sono stati identificati con metodi sperimentali precedenti, l'attuale approccio consente una definizione più raffinata dei movimenti contrattili localizzati, come increspature e nuove contrazioni anti-peristaltiche 9,24,25,30,31,42. La costruzione di STmaps e analisi delle variazioni del pattern di motilità sono stati applicati alle domande chiave nella motilità gastrointestinale dell'intestino e del colon. Questi includono: la differenziazione delle contrazioni neurogena e miogenici e la definizione del ruolo delle cellule interstiziali di Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 - 31,33,37 - 40,42, la comprensione del complessointerazioni tra gli strati muscolari circolari e longitudinali 2,7,8,11,12,32,39,40, esaminando gli effetti dei nutrienti intraluminali 10,18,19, 34 ceppi microbici, e viscosità 12,36 su vari modelli di motilità, e la comprensione del ruolo di vari agenti neuro-ormonali endogeni e agenti farmacologici esogeni 2,4 - 7,9,10,13 - 17,28,35,40 nella generazione e modifica della motilità. Il futuro di questa tecnica comporta l'accoppiamento con altre misure, tra cui pressione, elettrofisiologia e tensione / contrattilità. Recenti studi hanno spesso incorporato una o più di queste misurazioni in combinazione con registrazione video e mappatura spaziotemporale per fornire ulteriori dettagli correlativo 2,42. Inoltre, il sistema può essere utilizzato per misurare la motilità in altri organi tubolari e non tubolari. Ad esempio, si è tentato di misurare la motilità gastrica usandoun tale sistema, ma la tecnica e il software necessario raffinatezza quantificare meglio motilità in un organo simile non-tubolare 45. Non vi è dubbio che l'utilizzo di tecniche di mappatura spatiotemporal solo e in combinazione con i metodi più tradizionali di analisi porterà ad una più approfondita e completa comprensione della motilità gastrointestinale in futuro.
Acknowledgments
DMK è stata sostenuta da una sovvenzione IRACDA da NIGMS (K12GM093857) alla Virginia Commonwealth University. Questo lavoro è stato sostenuto da NIDDKD concessione DK34153 a John R. Grider.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | BP358 | For Krebs buffer. |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher | BP366 | For Krebs buffer. |
| Potassium Phosphate (KH2PO4) | Fisher | P285 | For Krebs buffer. |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M2643 | For Krebs buffer. |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C7902 | For Krebs buffer. |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher | BP328 | For Krebs buffer. |
| Glucose | Sigma | G7021 | For Krebs buffer. |
| Carboxygen (95% O2/5% CO2) | |||
| Dissecting pins | |||
| Dissecting trays/dishes | |||
| Dunkin Hartley Guinea Pigs | Charles River | Strain 051 | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/ | Freely available online. | |
| GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM) | Catamount Inc., St. Albans, Vermont | Includes parts listed below. | |
| Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
| Bath Cameras | Included with GIMM. | ||
| Bath TransIllumination Backlights | Included with GIMM. | ||
| Organ Baths | Included with GIMM. | ||
| Backlight Intensity Controls | Included with GIMM. | ||
| GIMM Processor ImageJ Plugin | Included with GIMM. | ||
| Polyethylene Tubing | Included with GIMM. | ||
| Tubing Connectors | Included with GIMM. | ||
| Masterflex tubing for Peristaltic Pumps | Included with GIMM. | ||
| Heating Bath/Water Circulator | Included with GIMM. |
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