We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.
Manipulasjon og kultur av tidlige mus embryoer er en kraftig men stort sett lite benyttet teknologi å øke verdien av denne modellen system. Motsatt har cellekultur vært mye brukt i utviklingsbiologi studier. Imidlertid er det viktig å bestemme om in vitro-dyrkede celler virkelig representerer in vivo-celletyper. Å pode cellene i embryoer, etterfulgt av en vurdering av deres bidrag under utvikling er en nyttig metode for å bestemme den potensielle av in vitro dyrkede celler. I denne studien, beskriver vi en fremgangsmåte for å pode cellene i et definert område av tidlig fostertap mus embryo, etterfulgt av ex vivo kultur. Vi introduserer også en optimalisert elektroporering metode som benytter glasskapillærer med kjent diameter, slik at nøyaktig lokalisering og justering av antall celler som får eksogent DNA med både høy transfeksjonseffektivitet og lav celledød. Disse teknikkene som ikke krever noen specialized utstyr, render eksperimentelle manipulasjoner av gastrulation og tidlig stadium organogenese-mus embryo mulig, slik at analyse av satsing i dyrkede celle subpopulasjoner, og effekten av genetiske manipulasjoner in situ på celledifferensiering.
Cellekultur har vært mye brukt i utviklingsbiologi studier. Muse embryonale stamceller (ESCs) og epiblast stamceller (EpiSCs) kan differensiere til alle tre bakterie lag in vitro, og er en nyttig modell for celledifferensiering i tidlig pattedyr embryogenese. Avledning av disse cellelinjer har åpnet opp en mulighet for in vitro manipulasjon og detaljert undersøkelse av de lokaliserte signalanlegg hendelser og transkripsjons nettverk som opererer under tidlig embryo mønster. Imidlertid er det viktig å bestemme in vivo relevansen av noen manipulasjoner utføres i kultur. Den in vivo potensialet preimplantation embryo-avledet mus ESCs har blitt vurdert ved å introdusere dem tilbake i preimplantation embryoer (morulae eller blastocysts) 1. Imidlertid kan EpiSCs som representerer de epiblast cellene i fostertap embryoer ikke integrere effektivt i preimplantation embryoer 2,3. Vår previooss funn har vist at EpiSCs effektivt kan generere chimeras og bidra til alle bakterie lag, når podet inn fostertap embryoer 4. Således er den beste måten for å evaluere in vitro dyrkede celler for å introdusere dem til deres korresponderende omgivelsene in vivo.
Elektroporering er en mye brukt metode for å levere eksogene molekyler inn målrettede celler både in vivo og in vitro-eksperimenter. Elektrisk energi kan generere et stort antall porer i cellemembranen, noe som gjør det mulig for eksogen deoksyribonukleinsyre (DNA) eller ribonukleinsyre (RNA) for å komme inn i cellene. En av de største utfordringene for denne teknikken er å kombinere optimal celle levedyktighet med høy electrotransfection effektivitet 5,6. For elektroporering av nukleinsyrer i embryonale vev, gullbelagt elektroder har oftest vært brukt, slik målretting av celler i et bredt spekter romlig 7-9. For å oppnå en mer localized genoverføring, har en nål formet elektrode blitt benyttet for å oppnå en fokal elektrisk felt 10,11. Ved hjelp av denne metoden, forfatterne viste at etter elektroporering, hadde rundt 30 til 60 celler tatt opp DNA-konstruksjon 11. Likevel synes det som nøyaktig justering av antall elektroporerte celler forblir vanskelig med en fast bredde elektrode. Den kapillære elektroporering teknikken har blitt brukt til å levere plasmider til enkeltceller 12-14. Imidlertid har denne teknikken ikke er søkt electroporating plasmider til embryoer ex vivo. Mer nylig har en microdevice blitt rapportert til lokalt electroporate noen distal viscerale endoderm celler (mindre enn 4 celler) i tidlig fostertap museembryoer 15. Men det er fortsatt ukjent om denne enheten kan effektivt målrette ektoderm og mesoderm ex vivo.
I denne studien beskriver vi to nye metoder for å vurdere cellulære og gen-funksjon i tidlig post-implantation embryoer. Vi først demonstrere hvordan å pode in vitro dyrkede celler inn i definerte områder i tidlige mus embryoer for å vurdere deres in vivo potensial. Integrasjonen av de podet celler og deres etterkommere, alle merket med en genetisk kode (for eksempel en grønn fluorescerende protein (GFP), kan bli ytterligere undersøkt ved farging av vev spesifikke proteiner fire. Dernest beskriver vi en forbedret metode for å gi nøyaktig DNA til lokaliserte områder i fosteret via elektroporering. Snarere enn å bruke en nålformet elektrode, innsatt vi en tynn tråd inne i en tynn glasskapillar, og viser at denne modifikasjon kan levere DNA til et lite antall celler med høy virkningsgrad og begrenset celledød. Videre viser vi at ved å bruke glasskapillærer med ulike åpningsstørrelser, kan vi kontrollere antall elektroporerte celler. Derfor tror vi denne metoden kan være til stor nytte for å studere tidlig embryo mønster som involverer små tall of celler.
Negl
Den kritiske trinn for celle pode eksperimenter er innsetting av en sammenhengende rekke celler ideelt i en enkelt handling, for å unngå breakup av klumpen. Denne teknikken krever litt øvelse i å kontrollere munnen pipette. Dersom donorceller innlemme godt i verten, vil deres derivater dispergeres i embryo. For å kunne fastslå om spredt donor avledet-cellene differensieres hensiktsmessig i verten, kan immunofarging utføres på embryo deler. Dersom donorcellene er ikke kompatible med verten miljøet, de enten ikke kan registreres (etter hvert som de blir utstøtt fra embryo) eller danner klumper uinkorporerte i embryoer etter kulturen. Hvis begge spredte celler og celleklumper ble observert, kan dette tyde på at for mange celler ble podet og overdreven donorceller som ikke kan samhandle med omkringvertsceller medførte klump formasjon. I dette tilfellet ytterligere transplantater inneholdet mindre antall celler kan utføres.
Den viktigste begrensning for cellen podingen teknikk er at det ikke er mulig å bestemme det fulle potensiale in vivo av celler ex vivo, siden mus kultur over perioder lengre enn 48 timer er ikke blitt oppnådd. Imidlertid, hvis den kombineres med ultralyd-styrt celleinjeksjon, kan det være mulig å overføre dyrkede celler til embryoene in utero. For å oppsummere, celle pode eksperimenter har blitt mye brukt i vår gruppe og har gitt oss verdifulle ledetråder om in vivo potensialet i ulike celletyper 4,21,22. Det er en teknikk av generell anvendbarhet for å vurdere potensialet for in vivo in vitro dyrkede celler i tidlige embryoer fostertap.
Electroporation
Selv om det i denne studien har vi bare vist at det er effektivt å bruke kapillær elektroporering teknikk for å målrette epiblast, jegt er også mulig å bevisst målrette andre bakterie lag som endoderm celler. Det kritiske trinnet for kapillær electroporation teknikk er å minimere tiden det tar å electroporate hvert embryo (<5 min per embryo) siden PBS er meget suboptimal for tidlig mus embryo. Våre data ovenfor, har vist at i de fleste områder i embryoer, ikke elektroporering påvirker ikke embryo vekst. Men elektroporering i node forårsaket unormal utvikling og førte til tidlig død av embryo. Dette er sannsynligvis på grunn av skade eller død av cellene som danner viktige signalsentre 23. Derfor ville denne regionen må unngås med denne teknikken. En ytterligere påminnelse er at, som nevnt i resultatene delen, mens epiblast eller primitive strek cellene var målrettet, noen endoderm celler ble også elektroporert. Dette kan være fordi DNA kommer til endoderm gjennom hullene under epiblast epitel. Endoderm består av epitelceller og i vår erfaring thESE celler har en større tilbøyelighet til å ta opp DNA. Derfor, ved anvendelse av denne teknikken for skjebne kartlegging, er det viktig å vurdere hvilke celler innledningsvis tar opp DNA.
Det bør også bemerkes at selv om pCAG-GFP og pCAG-Cre: kan GFP plasmider effektivt leveres ved hjelp av electroporation parametrene som er vist i denne studien, kan effektiviteten av andre DNA-konstruksjoner varierer og må individuell optimalisering. Endringer i DNA-konsentrasjon, elektroporering spenning eller det antall pulser som kan bli gjort dersom plasmider er funnet å være vanskelig å transfektere.
For å oppsummere, kan vår nettside optimalisert kapillær elektroporering systemet effektivt og reproduserbart levere GFP eller Cre: GFP plasmider i en svært få celler i embryoet med begrenset celledød. Etter denne metoden ikke krever dyrt eller høyt spesialisert utstyr, kan det være til stor nytte for celle sporing studier, eller i å teste virkningen av ektopisk ekspresjon eller betinget sletting of gener i tidlige embryoer, er hvis elektroporering utføres i embryoer bærer floxed betingede mutante alleler. Derfor gir denne teknikken elektroporasjon et nyttig verktøy for å forstå funksjonelt på en celle-for-celle-basis rollene til celle-indre faktorer i sammenheng med lokaliserte villtype embryoniske miljø.
The authors have nothing to disclose.
We thank Filip Wymeersch and Anestis Tsakiridis for comments on the manuscript, staff in the SCRM animal unit for help with animal maintenance and Prof. Stuart Forbes for immunohistochemistry reagents. This work was supported by MRC grant Mr/K011200/1 and the China Scholarship Council
Forceps | Dumostar | T5390 | |
Dissecting stereomicroscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
Stereomicroscope system with fluorescence | Nikon | AZ100 | |
Inverted microscope with a digital camera | Olympus | Olympus BX61 | |
Inverted confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 | |
Low melting point agarose | Life Technologies | 16520-050 | |
Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 11397863 | |
30mm Petri dishes | Fisher Scientific | 121V | |
4-well plates | Thermo scientific | 179820 | |
M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 10010015 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Pipettes | NICHIRYO | Nichipet | |
tips | Greiner Bio One | 685280 | |
Cell culture incubator | SANYO | MCO-17AIC | |
Roller culture apparatus | BTC Engineering | ||
Syringe filters 0.45µm, sterile | Sigma-Aldrich | 10462100 | |
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154 | |
non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
L-glutamine | Fisher Scientific | SH30549.01 | |
Sodium pyruvate solution | Fisher Scientific | SH30239.01 | |
Penicillin and Streptomycin 10.000UI/ml | Lonza | DE17-602E | |
Gas Cartridge for Portable Meker Burner | COLEMAN | COLEMAN 250 | |
Thin Wall Borosilicate Capillary Glass with Fillament, OD 1.0 mm, ID 0.78 mm | Harvard Apparatus | 640798 | |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Microforge | De Fonbrune | BS030301 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV830 | |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956.003 | |
ECM 830 square wave pulse generator | BTX | 45-0002 | |
Green food coloring dye | Sigma-Aldrich | C.I. 42053 | |
A far-red cell membrane-impermeable nuclear dye | Biotium | 40060-T | |
pCAG-Cre:GFP | Addgene | #13776 | |
pCAG-GFP | Addgene | #16664 | |
Multimeter | Excel | XL830L | |
Micromanipulators | Leitz | ||
0.2mm diameter platinum wire | Agar Scientific | E404-2 | |
Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | |
Goat anti-Chicken IgY, HRP | Santa Cruz | sc-2428 | |
Liquid DAB+ Substrate Chromogen System | Dako | K3467 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Life Technologies | D21490 | |
A far-red fluorescence nuclear counterstain | Life Technologies | T3605 |