Первичная клетки Сертоли необходимы для изучения семенников иммунной привилегией, передачу сигнала при воспалении или инфекции, и использования их иммунозащитную свойств. Здесь мы опишем протокол на основе ферментов для изоляции высокоочищенных первичной клетки Сертоли и перитубулярных клеток из семенников крыс.
Семенников, и, в частности мужской гаметы, проблемы иммунной системы уникальным способом, потому что дифференцировать сперма сначала появляются во время полового созревания – более десяти лет после установления системной иммунной толерантности. Сперматогенного клетки экспрессируют ряд белков, которые можно рассматривать как несамостоятельного иммунной системой. Затем семенник должен иметь возможность устанавливать допуск к этим нео-антигенов, с одной стороны, но все еще быть в состоянии защитить себя от инфекций и развития опухоли, с другой стороны. Поэтому яичко является одним из немногих иммунопривилегированных сайтов в организме, которые переносят чужеродные антигены, не вызывая отрицательное воспалительный иммунный ответ. Клетки Сертоли играют ключевую роль для поддержания этой иммунной привилегированной среде яичек, а также продлить выживание cotransplanted клеток в чужой среде. Поэтому первичные клетки Сертоли являются важным инструментом для изучения иммунной привилегией яичка, которые не могут быть отправлены по электроннойasily заменен установленных клеточных линий или других клеточных моделей. Здесь мы представляем подробный и всесторонний протокол для выделения клеток Сертоли – и перитубулярных клеток при желании – с семенников крыс в течение одного дня.
Семенники производят мужские гаметы и половые гормоны, т.е. андрогены. Орган состоит из двух отсеков. В интерстициального, что составляет около 10-12% от общего объема яичек 1, стероидогенез происходит внутри клеток Лейдига. Трубчатый отсека составляет около 60-80% от объема яичка 1 и содержит зародышевые клетки и двух типов соматических клеток – перитубулярных клеток и клеток Сертоли. Яичка делится перегородками соединительной ткани в 250-300 долек, каждая из которых содержит 1-3 высоко запутанные семенных канальцев. Эти канальцы окружены базальной мембраной, лист коллагена, и окружной слоем перитубулярных клеток (Рис. 1А)
Зародышевого эпителия находится на просвета стороне базальной мембраны. Клетки Сертоли большие удлиненные клетки, которые охватывают всю зародышевого эпителия от базальной мембраны к просвету. Они сильно Attболели в базальной мембране и образуют сплошной клеточный лист через базолатеральных организованных плотных контактов, что закупоривает зародышевого эпителия из интерстиций и представляет гематотестикулярного барьер. Клетки Сертоли видные цитоплазматические выступы и последствия, которые позволяют им получить в плотный морфологической и функциональной контакте с видовой конкретного, но постоянным числом половых клеток. Диплоидные зародышевые стволовые клетки пролиферируют и дифференцируются в сперматогонии.
Во время мейоза я недолго тетраплоидных сперматоциты создаются, которые развиваются дальше в четырех гаплоидных сперматид во мейоза II. Все зародышевые клетки соединены цитоплазматическими мостиками, так что они образуют сотовую сеть. Главное событие во время созревания сперматид является выдавливание большей части цитоплазмы, образуя остаточные органы, в процессе, называемом спермиогенез. Остаточные органы фагоцитированы клеток Сертоли. Поздние сперматиды затем выбрасывается впросвете канальцев и транспортируется в придатка для дальнейшего созревания. Клетки Сертоли и половые клетки появляются взаимно координировать сперматогенез топографически и функционально.
Подготовка индивидуальных яичек типов клеток началось почти столетие назад, когда маленькие кусочки яичка культивировали и типы клеток были определены микроскопии 2. Путем тщательного вскрытия трубочек после открытия белочную оболочку, используя остроконечный пинцет это было позже можно отделить трубчатые и интерстициальные отсеков 3. В 1975 валлийцы и Вибе представила лечение коллагеназы, чтобы освободить канальцы от присоединения интерстициальной ткани и лечение панкреатина для удаления наружного слоя клеток перитубулярных 4. С самого начала молодых неполовозрелых крыс (около 20 дней) были использованы при котором клетки Сертоли составляют значительную часть населения трубчатой клетки, потому что сперматогенез еще не начался. В этой возрастной Sert крысМасляные клетки перестают делиться, и плотные соединения между соседними клетками образуют так, что кровь-яичко барьер устанавливается 5.
Независимо от валлийцев и Вибе Dorrington др. Ввели сочетание трипсина и Дезоксирибонуклеаза последующим ингибитора трипсина soybeen и обработки коллагеназой, которая была опубликована в том же году 6. Обе группы также используется механическое усилие (рисунок переваренных трубчатые фрагменты повторно через иглу шприца или пипетки Пастера соответственно) с целью получения однородной суспензии клеток для обшивки, содержащий приблизительно 70% клетки Сертоли. После 3-х дней в культуре, с использованием среды, что является свободной от сыворотки, процент клеток Сертоли увеличивается до приблизительно 90%. Это может быть в значительной степени объясняется смерти загрязняющих зародышевые клетки. Остаточные перитубулярных клетки (ПТК), однако, оставаться прочно прикреплены с помощью их внеклеточного матрикса. PTCS, но не клетки Сертоли, как известно, производятфибронектин, которые могут служить в качестве маркерного белка для оценки загрязнения с ПТК. Поэтому, Tung др. полагали, что дополнительный лечение гиалуронидаза может улучшить чистоту фракции клеток Сертоли 7. Действительно, они могли бы показать, что дополнительная обработка смог уменьшить загрязнение PTCs примерно 20-кратное, который становится особенно очевидным, когда по сравнению содержащей сыворотку среда используется для культивирования очищенные клетки Сертоли. С тех пор улучшенной процедуры Tung др. стала доминирующей протокол и широко используется другими основными группами в области 8 (рис 1б).
Во время лечения коллагеназы большинство PTCs будут освобождены и могут быть выделены в параллель к клеткам Сертоли. В то время как ФТК энергично размножаться и не реагируют на фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), клетки Сертоли не претерпевают митоз больше и реагировать на ФСГ характерными морфологических измененийи увеличение циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) концентрации 9. Очень похожие ферментативные протоколы пищеварения может быть использован для выделения первичных клеток Сертоли из других животных, как человек 10, мыши 11,12 Сибирского хомяка 13 или Як 14. Для удаления больших количеств загрязняющих зародышевых клеток гипотонический шок может быть использован в конце процедуры выделения 15. Это позволяет также эффективную изоляцию клетки Сертоли из семенников взрослой крысы 16. Обогащенного клеточной суспензии из клеток Сертоли также может быть отделен от половых клетках путем посева суспензии на лектин блюд, покрытых дурман обыкновенный агглютининов 17. Только клетки Сертоли и несколько остаточные PTCs придерживаться лектиновых пластин.
Культуры Первичная клеток Сертоли, в основном из крысы, были использованы изначально для исследования реагирования на гормоны или создания клеточных линий, как на элементный литий мыши Сертолипе ТМ4 18. Эта клеточная линия не была исследована в более чем ста исследований до сегодняшнего дня. В поступательного подхода были использованы клетки Сертоли для иммуно-защиты совместно культивировали клетки и ткани, как в котрансплантация ксенофобов или аллогенных панкреатических островков для долгосрочного выживания трансплантата без системной иммуносупрессии 19. Изолированные клетки Сертоли были также использованы в экспериментах со-культуры для изучения эпителиально-мезенхимальные (клетки Сертоли – PTCc) и соматических зародышевых клеток (клетки Сертоли – зародышевых клеток) взаимодействий 20, 21. Недавно первичные клетки Сертоли были использованы для исследования экспрессии Toll-подобных рецепторов и секрецию провоспалительных цитокинов, а также сигнальной трансдукции каскады приводит к цитокинами экспрессию после инфицирования непатогенных и уропатогенных Е. палочка 22. Другие недавние исследования использовали клетки Сертоли для изучения яичек иммунную рrivilege 23 и продемонстрировал, что тестостерон предварительная обработка подавляет LPS-индуцированной воспалительной реакции 24.
The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Гвидо Верховена, а Людо Deboel, Левен, которые были чрезвычайно полезны в создании изоляции первичных клеток Сертоли в лаборатории Meinhardt в Гессене. Моника Fijak, Гиссен, признается за помощь в рисунке 1а и советы. Исследования были поддержаны Немецкого исследовательского через грант BH 93 / 1-1 (СО) и финансирование Международного научно-исследовательский выпускник колледжа JLU Гиссен (Германия) / Университет Монаша (Мельбурн, Австралия) ГРК 1871 (СО). Была также получена из гранта земли Гессен в рамках программы "Ланды-наступательных цур Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) под названием "Männliche Infertilität бай Infektion & Entzündung" (MIBIE).
Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
Corning™ Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
DAPI mountant ProLong® Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/l |
Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
DNase I | Roche | 10104159001 | |
Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor® 488 conjugate |
Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
Wistar WU rats | Charles River | N/A | Should be 19 days old on day of experiment. |