Aislamiento de células de Sertoli y peritubulares Las células de testículos de ratas
Summary
Se requieren células de Sertoli primaria para el estudio de testículo-inmune privilegio, la transducción de señales durante la inflamación o infección, y la utilización de sus propiedades inmunoprotectivos. Aquí se describe un protocolo basado en enzima para el aislamiento de células de Sertoli primaria altamente purificadas y células peritubulares de testículos de ratas.
Abstract
El testículo, y en particular el gameto masculino, desafía al sistema inmunológico de una manera única porque los espermatozoides diferenciados aparecen por primera vez en el momento de la pubertad – más de diez años después del establecimiento de la tolerancia inmune sistémica. espermatogénica células expresan una serie de proteínas que pueden ser vistos como no propio por el sistema inmune. El testículo debe entonces ser capaz de establecer tolerancia a estos neo-antígenos, por un lado, pero aún ser capaz de protegerse de infecciones y el desarrollo de tumores en el otro lado. Por lo tanto el testículo es uno de los pocos sitios privilegiados inmune en el cuerpo que toleran los antígenos extraños sin evocar una respuesta inmune inflamatoria perjudicial. células de Sertoli desempeñan un papel clave para el mantenimiento de este entorno privilegiado inmunitario de los testículos y también prolongan la supervivencia de las células cotransplanted en un entorno exterior. Por lo tanto, las células de Sertoli primarias son una herramienta importante para el estudio del privilegio inmune de los testículos que no puede ser correoasily reemplazado por líneas celulares establecidas o otros modelos celulares. Aquí se presenta un protocolo detallado y completo para el aislamiento de las células de Sertoli y las células peritubulares – si se desea – a partir de testículos de ratas dentro de un solo día.
Introduction
Testículos producen gametos masculinos y hormonas sexuales, es decir, los andrógenos. El órgano se compone de dos compartimientos. En el compartimiento intersticial, que representa alrededor del 10-12% del volumen total de testículo 1, la esteroidogénesis se lleva a cabo dentro de las células de Leydig. El compartimento tubular representa aproximadamente el 60-80% del volumen testicular 1 y contiene células germinales y dos tipos de células somáticas – células peritubulares y células de Sertoli. El testículo está dividido por tabiques de tejido conectivo en 250-300 lóbulos, cada uno con 1-3 túbulos seminíferos intrincadas. Estos túbulos están rodeados por una membrana basal, una hoja de colágeno, y una capa circunferencial de células peritubulares (Figura 1A).
El epitelio germinal se encuentra en el lado luminal de la membrana basal. células de Sertoli son grandes células alargadas que se extienden a todo el epitelio germinal desde la membrana basal al lumen. Son muy attdolía a la membrana basal y formar una lámina celular continua a través de las uniones estrechas organizados basolateral que ocluye el epitelio germinal del intersticio y representa la barrera sangre-testículo. Las células de Sertoli tienen proyecciones citoplasmáticas prominentes y ramificaciones que les permiten entrar en contacto morfológica y funcional apretado con un número específico de especie pero constante de células germinales. Las células madre germinales diploides proliferan y se diferencian en espermatogonias.
Durante la meiosis I de corta duración espermatocitos tetraploides son generados que se desarrollan a su vez en cuatro espermátidas haploides durante la meiosis II. Todas las células germinales están interconectadas por puentes citoplasmáticos de manera que formen una red celular. El evento principal durante la maduración de las espermátidas es la extrusión de grandes partes del citoplasma, formando cuerpos residuales, en un proceso llamado espermiogénesis. cuerpos residuales son fagocitados por las células de Sertoli. espermátidas tardías son luego liberados enla luz tubular y transportados en el epidídimo para su posterior maduración. las células de Sertoli y las células germinales aparecen para coordinar mutuamente espermatogénesis topográficamente y funcionalmente.
Preparación de tipos de células testiculares individuales comenzó hace casi un siglo, cuando pequeñas piezas testiculares fueron cultivadas y tipos de células identificados por microscopía 2. Mediante una cuidadosa disección de los túbulos después de la apertura de la túnica albugínea con unas pinzas de punta fina que era más tarde posible separar tubular y compartimentos intersticiales 3. En 1975 Welsh y Wiebe introdujo un tratamiento con colagenasa con el fin de liberar a los túbulos se adhiera tejido intersticial y un tratamiento de pancreatina para la eliminación de la capa de células peritubular exterior 4. Desde el principio ratas inmaduras jóvenes (alrededor de 20 días de edad) habían sido utilizados en el que las células de Sertoli comprenden una gran parte de la población de células tubulares debido a la espermatogénesis no ha comenzado aún. A esta edad Sert ratacélulas oli dejan de dividirse, y uniones estrechas entre las células vecinas de modo que forman la barrera sangre-testículo se establece 5.
Independiente de Gales y Wiebe Dorrington et al. Introduce una combinación de tripsina y desoxirribonucleasa seguido de inhibidor de tripsina y soybeen tratamiento con colagenasa que fue publicado en el mismo año 6. Ambos grupos también utilizan la fuerza mecánica (dibujo los fragmentos digeridos tubulares repetidamente a través de una aguja de jeringa o una pipeta Pasteur, respectivamente) con el fin de producir una suspensión celular homogénea para el chapado que contiene las células de Sertoli de aproximadamente 70%. Después de 3 días en cultivo, utilizando un medio que está libre de suero, el porcentaje de células de Sertoli aumenta a aproximadamente el 90%. Esto podría atribuirse en gran parte a la muerte de contaminación de las células germinales. células peritubulares residuales (PTCs), sin embargo, se mantienen firmemente unidos a través de su matriz extracelular. PTCs, pero no las células de Sertoli, son conocidos por producirfibronectina que puede servir como una proteína marcadora para la estimación de la contaminación con PTCs. Por lo tanto, Tung et al. razonó que un tratamiento adicional hialuronidasa puede mejorar la pureza de la fracción de células de Sertoli 7. De hecho podían muestran que un tratamiento adicional fue capaz de reducir la contaminación por los PTC aproximadamente 20 veces, lo que se hace particularmente evidente cuando en comparación un medio que contiene suero se utiliza para el cultivo de células de Sertoli purificados. A partir de entonces el procedimiento mejorado de Tung et al. se convirtió en el protocolo vigente y fue utilizado ampliamente por otros grupos importantes en el campo 8 (Figura 1B).
Durante el tratamiento de colagenasa la mayoría de los PTCs se liberan y se puede aislar en paralelo a las células de Sertoli. Mientras que los PTCs proliferan enérgicamente y no responden a la hormona estimulante del folículo (FSH), las células de Sertoli no sufren mitosis más y responden a la FSH por los cambios morfológicos característicosy un aumento de la adenosina monofosfato cíclico (cAMP) concentración 9. Protocolos de digestión enzimática muy similar se pueden utilizar para el aislamiento de células de Sertoli primarios de otros animales como el hombre 10, ratón 11,12, hámster siberiano 13 o yak 14. Para la eliminación de grandes cantidades de contaminación de las células germinales de un choque hipotónico pueden emplearse en el extremo del procedimiento de aislamiento 15. Esto permite también el aislamiento eficiente de células de Sertoli del testículo de rata adulta 16. Una suspensión de células de Sertoli enriquecido también puede ser separado de las células germinales en placas la suspensión en placas revestidas con lectina aglutinina de Datura stramonium 17. Sólo las células de Sertoli y algunas PTCs residuales se adhieren a las placas de lectina.
cultivos de células primarias de Sertoli, principalmente de la rata, se han utilizado inicialmente para la investigación de la capacidad de respuesta a las hormonas o el establecimiento de líneas celulares como el li celular de ratón Sertoline TM4 18. Esta línea celular se ha investigado en más de un centenar de estudios hasta la actualidad. En un enfoque de traslación se han utilizado las células de Sertoli para inmuno-protección de las células y tejidos, como en la co-trasplante de islotes pancreáticos xeno o alogénicos para la supervivencia del injerto a largo plazo co-cultivadas sin inmunosupresión sistémica 19. Las células de Sertoli aisladas también se han utilizado en los experimentos de co-cultivo para el estudio de epitelio-mesenquimal (células de Sertoli – PTCC) y de células somáticas de gérmenes (células de Sertoli – células germinales) las interacciones 20, 21. Se han empleado células de Sertoli Recientemente primarias para la investigación de la expresión de receptores de tipo Toll y la secreción de citocinas proinflamatorias, así como las cascadas de transducción de señales que conduce a la expresión de citoquinas después de la infección con E. no patógeno y uropathogenic coli 22. Otras investigaciones recientes estaban usando células de Sertoli para estudiar testicular p inmunerivilege 23 y demostró que la testosterona pre-tratamiento suprime la respuesta inflamatoria inducida por LPS-24.
Protocol
Representative Results
Discussion
The seminiferous tubules are bounded by a circular layer of peritubular cells and a basal lamina on the luminal side. Sertoli cells are resting on the basal lamina, establish the blood testis barrier through formation of occluding junctions between adjacent cells and provide the structural framework for the organisation of the seminiferous epithelium. Sertoli cells and adjacent spermatogenic cells maintain intimate contacts throughout germ cell development providing physical contact and communication alike. Therefore, wh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Guido Verhoeven y Ludo Deboel, Lovaina, que eran extremadamente útil para establecer el aislamiento de las células de Sertoli primarias en el laboratorio Meinhardt en Giessen. Monika Fijak, Giessen, es reconocido por su ayuda en la figura 1A y asesoramiento. Los estudios fueron apoyados por la Deutsche Forschungsgemeinschaft a través BH subvención 93 / 1-1 (SB) y la financiación de la Investigación de Graduados de la universidad de Giessen JLU Internacional (Alemania) / Universidad de Monash (Melbourne, Australia) GRK 1871 (SB). El apoyo también se obtuvo de una subvención del Estado de Hessen, dentro del programa "Landes-ofensivo zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) llamado "männliche Infertilität bei Infektion y Entzündung" (MIBIE).
Materials
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning™ Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong® Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/l |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor® 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | N/A | Should be 19 days old on day of experiment. |
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