Günümüzde glioblastoma (GBM) 'nin ex vivo modelleri, insan tümörü invazyonunun fizyolojik olarak ilgili çalışması için optimize edilmemiştir. Burada, taze insan GBM dokusundan alınan organotipik dilim kültürlerinin üretimi ve bakımı için bir protokol sunuyoruz. Zaman atlamalı mikroskopi ve kantitatif hücre göç analiz tekniklerinin bir açıklaması sağlanmıştır.
Glioblastom (GBM), cerrahi, kemoterapötik ve radyasyon tedavisine rağmen son derece kötü klinik prognoz taşımaya devam etmektedir. Çevreleyen beyin parankim içine progresif tümör invazyonu, kalıcı bir terapötik zorluğu temsil eder. GBM için anti-migrasyon terapileri geliştirmek için, kontrollü deneyler için fizyolojik açıdan alakalı bir arka plan sağlayan model sistemleri esastır. Burada, cerrahi rezeksiyon sırasında elde edilen insan GBM dokusundan dilim kültürleri üretmek için bir protokol sunmaktayız. Bu kültürler, hayvan ksenograftları ya da tek hücreli kültürler aracılığıyla pasifleştirilmeden ex vivo denemeye izin verir. Ayrıca, tümör hücrelerinin migratör davranışını nicel olarak incelemek ve terapötiklerle ilişkili tepkiyi incelemek için hücre izlemeyle birlikte konvansiyonel mikroskopi taramalı zaman atlamalı lazer taramasını tarif ediyoruz. Dilimler, cerrahi doku ediniminden 90 dakika sonra tekrarlanabilir bir şekilde üretilir. Retroviral aracılı fluoresan hücre laBeling, konfokal görüntüleme ve tümör hücresi migrasyon analizleri daha sonra kültürden iki hafta içinde tamamlanır. İnsan GBM'sinde artan göç davranışıyla ilişkili genetik faktörleri ortaya çıkarmak için bu dilim kültürlerini başarıyla kullandık. Ayrıca, modelin göç karşıtı tedavilere yanıt olarak hastaya özgü varyasyonu saptama yeteneğini doğrulamış bulunuyoruz. İleriye doğru ilerleyerek, insan GBM dilim kültürleri kişiselleştirilmiş nöro-onkolojik terapiyi ilerletmek için terapötik ajanlara tümör hassasiyetinin hızlı ex vivo değerlendirmesi için çekici bir platformdur.
Glioblastomun (GBM) laboratuvar çalışması, insan hastalığının gerekli patolojik özelliklerini, yani tümör hücresi migrasyonu ve istilasını sadakatle tekrarlayan model eksikliği nedeniyle engellenmektedir. 2D ve 3D in vitro invazyon testlerinin yanı sıra 3B kemirgen dilim kültür modelleri ile karşılaştırmalı çalışmalar, bu iki bağlamda mekanik olarak birbirinden farklı hücresel göç programlarını ortaya çıkarmıştır, bu bulgular 2D sistemlerinden insan hastalığına 1 , 2 , 3'e çevrilebilirliği potansiyel olarak sınırlayıcıdır. Burada tarif edilen organotipik tümör dilim kültürü ve görüntüleme paradigması, cerrahi rezeksiyonla elde edilen ex vivo insan tümör dokusu dilimleri içindeki tümör hücresi göçünün incelenmesine izin verir. Böylece, cerrahi olarak rezeke edilen tümör dokusunun dilim kültürleri, zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile birleştiğinde yerli halktaki tümör hücresi göçünü incelemek için bir platform oluştururlarDoku eritme veya kültür pasajı olmaksızın mikro ortam.
İnsan tümörü ksenograftlarından, retroviral kaynaklı tümörlerden ve tümör invazyonu 1 , 2 , 3 , 4 , 5'i çalışmak için hücresel bindirmelerden üretilen GBM'nin kemirgen beyin dilim kültürü modellerini kullanan geniş literatür var. Yakın geçmişte, birkaç grup organotipik dilim kültürlerinin üretimini doğrudan insan GBM dokusundan 6 , 7 , 8 , 9 , 10'dan anlattı. Bununla birlikte, dilimleme tekniği ve kültür ortamı ile ilgili yayınlanmış protokoller arasında belirgin bir farklılık var. Ayrıca, organotipik dilim kültürlerinin kullanımı, hücre sinyalindeki değişiklikleri içeren statik deneysel son noktalara odaklanmıştırNg, çoğalma ve ölüm. Burada tarif edilen protokol, zamana bağlı lokal tarama konfokal mikroskobu ile dinamik tümör hücresi davranışlarının zaman çözümlemeli gözlemini dahil ederek önceki dilim kültürü paradigmalarını genişletir. Arası 11 ve tümör içi, 12 yeni keşfi, insan GBM'de 13 genetik çeşitlilik tümör hücre davranışları ve tedavi tümör yanıtı üzerindeki etkileri ile bu heterojenite bağlama öneminin altını çizmektedir. Burada, bir insan kanser dokusundan doğrudan dilim kültürlerinin kullanımı için, yakın zamanda gerçek zamanlı olarak tümör hücresi göçünü görselleştirmek için aerodinamik ve tekrarlanabilir bir protokol bildirdik.
İnsan kanser dokusundan alınmış organotipik dilim kültürleri, klinik öncesi translasyonel deneyler için cazip ve az kullanılan bir platform sağlar. Tümör hücrelerinin doğal tümör mikro ortamındaki göç, çoğalma ve hücre ölümüne ilişkin nüfus düzeyindeki davranışlarının anlaşılması eksiktir. Kritik olarak, hücre davranışı seviyesinde dinamik, zamanla çözülmüş biçimde terapiye tümör tepkisinin incelenmesi, yeni tedavi direnci mekanizmalarına ışık tutabilir. İnsan tümör …
The authors have nothing to disclose.
Burada açıklanan dil kültürü konfokal görüntüleme protokolüne teknik uzmanlıkları ve katkıları için Dr. Lee Niswander ve Dr. Rada Massarwa'ya teşekkür etmek istiyoruz. Dr. Kalen Dionne, beyin tümörü doku dilimleme ve kültür parametrelerinin optimize edilmesine ilişkin uzmanlık sağlayan ek teşekkürler sayesinde teşekkür ederiz.
DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
Equipment | |||
Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |