Summary
Os modelos atuais ex vivo de glioblastoma (GBM) não são otimizados para o estudo fisiologicamente relevante da invasão de tumores humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para geração e manutenção de culturas de fatia organotípicas a partir de tecido GBM humano fresco. É fornecida uma descrição da microscopia por lapso de tempo e técnicas quantitativas de análise de migração celular.
Abstract
Glioblastoma (GBM) continua a apresentar um prognóstico clínico extremamente fraco, apesar da terapia cirúrgica, quimioterapêutica e de radiação. A invasão progressiva do tumor no parênquima cerebral circundante representa um desafio terapêutico duradouro. Para desenvolver terapias anti-migração para GBM, os sistemas modelo que fornecem um fundo fisiologicamente relevante para experimentação controlada são essenciais. Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de culturas de fatia de tecido GBM humano obtido durante ressecção cirúrgica. Essas culturas permitem a experimentação ex vivo sem passar por meio de xenoenxertos de animais ou culturas de células únicas. Além disso, descrevemos o uso da microscopia confocal de varredura a laser em lapso temporal em conjunto com o rastreamento celular para estudar quantitativamente o comportamento migratório das células tumorais e resposta associada à terapêutica. As fatias são reproduzíveis geradas dentro de 90 minutos da aquisição de tecido cirúrgico. Células fluorescentes mediadas por RetrovirallyAs imagens de imagem confocal e de migração de células tumorais são posteriormente concluídas dentro de duas semanas de cultura. Nós usamos com sucesso essas culturas de fatia para descobrir fatores genéticos associados ao aumento do comportamento migratório no GBM humano. Além disso, validamos a capacidade do modelo para detectar variações específicas do paciente em resposta a terapias anti-migração. Avançando, as culturas de fatia GBM humanas são uma plataforma atraente para uma avaliação rápida e ex vivo da sensibilidade do tumor a agentes terapêuticos, a fim de promover a terapia neurocircóológica personalizada.
Introduction
O estudo laboratorial do glioblastoma (GBM) é dificultado pela falta de modelos que recapitulem fielmente as características patológicas necessárias da doença humana, nomeadamente a migração de células tumorais e a invasão. Estudos comparativos de ensaios de invasão in vitro 2D e 3D, bem como modelos de cultura de fatias de roedores 3D, descobriram programas de migração celular mecanicamente dispares nestes dois contextos, potencialmente limitando a translatabilidade dos achados dos sistemas 2D à doença humana 1 , 2 , 3 . O paradigma de cultura e imagem de corte de tumor organotípico aqui descrito permite o estudo da migração de células tumorais em fatias de tecido de tumor humano ex vivo obtido a partir de ressecção cirúrgica. Assim, as culturas de fatia de tecido tumoral ressecado cirurgicamente em conjunto com microscopia confocal de lapso de tempo fornecem uma plataforma para estudar a migração de células tumorais no nativoMicroambiente sem dissolução de tecido ou passagem de cultura.
Existe uma extensa literatura que emprega modelos de cultura de fatias de cérebros de roedores de GBM gerados a partir de xenoenxertos de tumores humanos, tumores induzidos por retrovirais e sobreposições celulares para estudar invasão tumoral 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Recentemente, vários grupos descreveram a geração de culturas de fatia organotípicas diretamente do tecido GBM humano 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . No entanto, existe uma variação acentuada entre os protocolos publicados em relação à técnica de corte e aos meios de cultura. Além disso, o uso de culturas de fatias organotipicas se concentrou em pontos finais experimentais estáticos que incluíram mudanças no sinal celularNg, proliferação e morte. O protocolo aqui descrito expande sobre paradigmas de cultura de fatia anteriores, incorporando observação resolvida no tempo de comportamentos dinâmicos de células tumorais através de microscopia confocal de varredura laser com lapso de tempo. A descoberta recente de inter 11 e intratumoral 12 , 13 variação genética no GBM humano ressalta a importância de vincular essa heterogeneidade com os comportamentos das células tumorais e suas implicações na resposta do tumor à terapia. Aqui, relatamos um protocolo simplificado e reprodutível para o uso de culturas de fatia diretas de um tecido de câncer humano para visualizar migração de células tumorais em tempo quase em tempo real.
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Protocol
Antes de iniciar a coleta de amostras de tecido do paciente, o consentimento informado deve ser obtido de cada paciente de acordo com um protocolo aprovado da Junta de Revisão Institucional (IRB). Os autores deste protocolo receberam o consentimento para o trabalho descrito nos protocolos IRB aprovados no Hospital da Universidade do Colorado e no Hospital Inova Fairfax. Os dados coletados dessas culturas de fatia não foram usados para direcionar as decisões de cuidados ao paciente.
1. Preparação pré-cortar
- Prepare mídia de "processamento de tecidos" e mídia de "manutenção de cultura de fatia" no dia anterior à ressecção de tumor planejada e coleta de tecido (ou utilize mídia gerada anteriormente dentro de 2 semanas). Adicione 5 mL de solução de penicilina-estreptomicina (10 000 U / mL) e 5 mL de HEPES 1 M para 500 mL de um DMEM com alto teor de glicose para gerar o meio de processamento de tecidos.
- Prepare 250 mL de meios de manutenção de cultura de fatia usando uma base de meio neuronal ( por exemplo , Neurobasal) witHalo de vermelho de fenol. Complemente este meio com HEPES 10 mM, 1x suplemento B-27, L-glutamina 400 μM, dipeptídeo L-alanil-L-glutamina 600 μM, penicilina 60 U / mL, estreptomicina 60 μg / mL e 6 nistatina U U / mL.
- Armazene todas as mídias a 4 ° C por não mais de 2 semanas.
2. Dia de cirurgia: aquisição de tecidos
- No dia da aquisição do tecido, prepare 50 - 100 mL de soluções de 1% e 2% (% em peso / volume) de agarose de baixa temperatura de fusão em meios de processamento de tecidos usando produtos de vidro autoclavados e técnica estéril em uma capa de fluxo laminar. Ambas as concentrações de agarose são necessárias para acomodar a variação imprevisível da consistência do tecido tumoral.
- Aqueça a suspensão de agarose, usando um microondas, até observar uma ebulição suave. Coloque a solução de agarose em um banho de água a 37 ° C para manter no estado líquido até o uso.
- Coloque 1 mL de meio de manutenção de cultura de fatia em cada poço de uma placa de 6 poços.
- Use um estérilFórceps para colocar inserções de cultura de PTFE vazias em cada poço. Coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos humidificada, revestida com água, com uma atmosfera de 5% de CO 2 mantida a 37 ° C.
- Usando uma pipeta de Pasteur estéril numa câmara de fluxo laminar, de espuma uma mistura de 95% O2 / 5% de gás de CO 2 num balão contendo gelo tecido frio meios de processamento para, aproximadamente, 15 a 30 min, antes da aquisição tecido tumoral. O uso de meios supra-oxigenados minimiza a hipoxia no tecido em massa durante o processamento.
- Prepare os tubos cônicos de 50 mL rotulados (suficiente para o número desejado de regiões tumorais individuais a serem isoladas) contendo alíquotas de 20 mL de meios de processamento gelados supra-oxigenados para transportar tecido entre a sala de operação e a instalação de fatiamento.
- Em conjunto com um neurocirurgião, planeja pré-operativamente a região tumoral para a aquisição da amostra. Selecione uma região de tumor com aumento de contraste como demonstrado na imaginação clínica do pacienteG (sequências de ressonância magnética pós-gadolínio T1 (MRI)). A experiência anterior sugere que esta área produz tecido tumoral viável em oposição ao tecido necrótico.
NOTA: foi tentada a geração de fatias da substância branca circundante (peritumoral); No entanto, a autofluorescência de fundo e a diminuição da densidade de células tumorais limitaram a utilidade experimental dessas fatias. - Obtenha tecido tumoral no início da ressecção tumoral. Evite a coleta de tecido tumoral exposto ao cauterismo bipolar extensivo, o que pode comprometer a viabilidade do tecido secundário à lesão térmica. As amostras de tecido adquiridas durante a ressecção tumoral fragmentada demonstram viabilidade melhorada quando comparadas aos tecidos adquiridos a partir de ressecções em bloco longas. Esta observação pode referir-se à privação diferencial do tecido tumoral do fluxo sanguíneo como resultado da ressecção cirúrgica e tempo prolongado para a aquisição.
- Se desejar, rotular e armazenar o tecido tumoral em tubos cônicos separados para isolar amostrasDe regiões tumorais distintas. (Ou seja, tecido superficial versus tecido tumoral profundo). Localizações precisas de tecido podem ser registradas se / quando a navegação cirúrgica intra-operatória estiver disponível.
3. Fatia Cultura Preparação
NOTA: Este protocolo requer o uso de tecido humano fresco não fixado. Todas as amostras são presumidas como infecciosas e devem ser manipuladas de acordo com os protocolos de patógenos transmitidos pelo sangue. O equipamento de proteção pessoal apropriado deve ser colocado em todos os momentos. A pinça e os bisturis devem ser expostos a 15 min de luz UV antes do uso. Durante o uso, pulverize intermitentemente as ferramentas com etanol a 70% (EtOH), permitindo que o tempo de evaporação do líquido antes do uso. O processo de corte é realizado de forma semi-estéril, utilizando um capuz de fluxo laminar horizontal com ar filtrado.
- Coloque peças de tecido de tumor em uma placa de Petri com meios de processamento gelados. Para lavar o tecido do tumor e minimizar os glóbulos vermelhos aderentes, nósEa pipeta para trocar e descartar a mídia na placa de Petri três vezes.
- Usando um bisturi, corte peças de tumor em formas de caixa retangulares. Ajustar peças de tecido para aproximar 3 mm x 3 mm x 10 mm. Remova com cuidado todas as embarcações presas por excisão ou tração suave com fórceps finos.
- Pipetar 5 - 7 mL de agarose a 37 ° C em um molde de incrustação de plástico pequeno em forma de cubo (~ 2 cm 3 ). Confirmar a temperatura da solução de agarose não é superior a 37 ° C com um termômetro estéril antes da utilização.
- Permitir que agarose se sente durante aproximadamente 1 minuto sobre uma cama de gelo.
- Coloque 2 a 4 tiras de tecido de tumor em agarose com eixo longo orientado verticalmente.
NOTA: As tiras de tecido tendem a "afundar" na agarose antes da solidificação. Para evitar esta complicação, mantenha temporariamente a tira de tecido em orientação vertical até que a agarose seja solidificada. - Mantenha o tecido contendo o molde de agarose em uma cama de gelo por 2 a 5 miN para facilitar a solidificação.
- Retire o molde do gelo e remova suavemente o bloco de agarose cortando os lados da forma com um bisturi. Evite colocar força excessiva no bloco, que pode frustrar a agarose.
- Use uma gota generosa de cola de cianoacrilato para afixar o bloco de agarose na placa do espécime de vibração. Deixe a cola ser ajustada por aproximadamente 1 a 2 min.
- Encha o reservatório de vibração com meios de processamento gelados para submergir o bloco de agarose afixado na placa do espécime.
- Durante o corte, bolha de 95% de O2 / 5% de CO 2 da mistura de gases para dentro do reservatório vibratome através de uma pipeta de plástico estéril aparado.
- Defina a espessura da fatia de vibração para 300 a 350 μm.
- Ajuste a velocidade de avanço da lâmina e a amplitude da lâmina de acordo com a consistência do tecido. O tecido GBM "mais rígido" requer velocidades de avanço da lâmina mais lentas e maior amplitude. As configurações exatas da velocidade da lâmina e da amplitude variam de acordo com as especificações do vibratome.
- Transfira as fatias de tecido para a placa de Petri com meios de processamento gelados usando uma microspatula de aço inoxidável.
- Obtenha placas de 6 poços contendo inserções de PTFE e meios de cultura de fatia equilibrados da incubadora (conforme preparado na seção 2, passo 4).
- Corte fatias de tecido usando uma microspatula de aço inoxidável. Minimize o contato direto e manipulação de tecido, usando um pincel de cerdas finas para gerar uma "onda fluida" para empurrar suavemente a fatia da espátula aE na inserção de cultura.
NOTA: Minimize a quantidade de mídia de processamento introduzida na parte superior da inserção de cultura de tecidos. Se quantidades excessivas de mídia forem transferidas, fazendo com que as fatias flutuem, use uma pipeta Pasteur estéril para remover a mídia. - Retornar as placas de 6 poços contendo fatias de tumor para uma incubadora mantida a 37 ° C com uma atmosfera de CO 2 a 5%.
NOTA: Todo o protocolo de incorporação e corte deve ser completado dentro de 90 min da aquisição de tecido tumoral na sala de operações.
4. Cortar a manutenção da cultura
- Após 12 - 24 h, transfira as culturas da fatia agarrando cada rebordo de inserção com uma pinça estéril e transfira para placas que contenham meios de manutenção de cultura de fatia fresca. Certifique-se de que a mídia de manutenção da cultura da fatia aliquoteada em cada poço se equilibre na incubadora por pelo menos 15 min antes de transferir as pastilhas.
- Mova as pastilhas para novas placas de 6 poços com fatias frescas frescasTure mídia a cada 48 h.
- Se desejado, alíquota de meio de cultura de fatia de idade com uma pipeta para uso imediato em ensaios bioquímicos ( ou seja, ELISA) ou congelar a -80 ° C para uso futuro.
5. Rotulação de células tumorais através de proteína de fluorescência verde que expressa o retrovírus
NOTA: O microscópio de lapso de tempo para análise da migração de células tumorais requer rotulagem fluorescente estável a longo prazo das células dentro da cultura da fatia. O uso de retrovírus é sugerido porque infecta seletivamente as células em divisão, enriquecendo a rotulagem fluorescente dentro da população de células tumorais em oposição à microglia ou a outros tipos de células presentes dentro da fatia. A padronização da infecção sugere que um título viral de 10 4 UFC / μL resulta em uma expressão de proteína fluorescente verde suficiente para o rastreamento e análise da migração celular. Aumento do título viral, uso de vírus não seletivos ( ou seja , adenovírus, lentivírus) ou otSeu meio de rotular todas as células pode impedir a identificação de limites celulares claros durante a migração, o que complica a análise. O uso de marcadores fluorescentes alternativos pode ser utilizado e otimizado conforme necessário.
- Obter retrovírus para infecção de fatias de tumor, quer através de protocolos padrão 5 , 14 ou de uma fonte comercialmente disponível. Diluir o sobrenadante viral adicionando o volume apropriado em meio neuronal não suplementado para obter um título viral de 10 4 UFC / μL.
- Entre 7 e 10 dias de cultura, infectam as culturas de fatiga do tumor de interesse com 5 - 10 μL de vírus (10 4 CFUs / μL). Coloque o vírus gentilmente gota a gota na superfície de cada fatia de tecido. Diminua o volume do sobrenadante adicionado se a fatia flutuar na superfície da inserção. Devolver placas contendo culturas de fatia para incubadora.
- Avalie as fatias das células tumorais marcadas a partir das 24 h após Infecção viral (ver seção 6). Esta demora no tempo variará dependendo da incorporação viral e da cinética de expressão de genes de fluorescência. Para as construções virais usadas aqui, 72 h foram obrigados a observar o sinal fluorescente robusto com um microscópio padrão de epifluorescência.
NOTA: Raramente, as fatias exibem uma distribuição predominantemente periférica de células marcadas viralmente, o que pode complicar a imagem confocal. Para evitar esta complicação, tente reduzir a espessura da fatia e a variação da espessura em toda a fatia. Se a cultura da fatia tiver uma região mais espessa perto do centro, isso pode impedir a penetração adequada de nutrientes, limitando assim a população de células tumorais que dividem ativamente. Um ensaio qualitativo para detectar esta complicação é a adição de um reagente de corante de tetrazólio ( isto é, MTT) ao meio de cultura de fatia. As áreas da fatia que não ficam azuis depois de adicionar o reagente indicam falta de atividade metabólica e compromete a saúde da fatia.
NOTA: Após a confirmação da transdução e da saúde bem sucedida da cultura, as células podem ser imaginadas sob condições de controle, seguidas de um período igual de imagem em condições de tratamento. Usando este protocolo, as células foram criadas com sucesso e rastreadas durante 12 horas em cada condição. No entanto, períodos mais curtos ou mais longos de imagem e manipulação ambiental também podem ser informativos.
- Carregando o microscópio
- Antes da imagem, coloque 1 mL de mídia de fatia fresca em um prato inferior de vidro.
- Permitir que a mídia no prato de fundo de vidro se equilibre em uma incubadora por 15 min.
NOTA: Neste ponto, agentes de rotulagem solúveis, tais como lectinas fluorescentemente conjugadas ( isto é, Isolectina IB 4 para marcação de microglia) ou pontos quânticos conjugados com ligandos, podem ser adicionados ao meio de cultura de fatia para identificação de célulasSub-populações ular durante a imagem. - Transfira a inserção para ser fotografada em um prato de fundo de vidro usando pinças estéril em uma capa de fluxo laminar. Transporte o prato para o estágio do microscópio.
- Manter culturas de fatia a 37 ° C e 5% de atmosfera de CO2 em uma incubadora de palco com um microscópio selado. Utilize humidificação H 2 O estéril da câmara de incubação se disponível para evitar a evaporação excessiva da mídia (especialmente importante para experimentos de imagem mais longos).
- Utilize um microscópio confocal com uma longa distância de trabalho objetivo de ar 10X e excitação a laser para fotón único e / ou multifônico.
NOTA: Certifique-se de que a lente objetiva do microscópio proporciona distância de trabalho adequada. Como resultado da altura adicionada da incubadora de palco, do prato de fundo de vidro e da inserção de cultura de tecidos, os objetivos longos de distância de trabalho são críticos. - Prenda a placa de fundo de vidro, remova a tampa de plástico Petri e cubra com um gás-Membrana permeável.
- Aquisição de imagem
- Use o microscópio para inspecionar visualmente a fatia e localize um campo adequado com densidade adequada de células tumorais marcadas de forma fluorescente entre a borda da fatia e o centro. Evite campos de imagem na borda da fatia, devido ao aumento da suscetibilidade dos movimentos de tecido durante a imagem. As harpas de fatia de tecido podem ser empregadas para limitar esta mudança.
- Use o software de imagem em modo de análise multidimensional para definir os primeiros limites (da parte inferior) e o último (topo) da camada Z, de modo que todas as posições a serem visualizadas contenham um sinal celular fluorescente visível. A imagem através de 150 a 200 μm da fatia, com um passo Z constante de 10 μm forneceu uma resolução adequada para o rastreamento de caminhos celulares (isso pode ser ajustado para necessidades individuais de imagem).
- Se o microscópio tiver um estágio motorizado, assegure-se que seja permitido tempo adequado para cada aquisição de pilha Z. Defina o intervalo de tempo entre aquisições para igualTempo de varredura por posição x número de posições para imagem ( ou seja, regiões tumorais imaginadas).
NOTA: Para a excitação simultânea dos fluoróforos verdes e vermelhos, utilize um programa de varredura de linha a laser de duas linhas, com excitação simultânea de 488 nm e 633 nm. O comprimento de onda da excitação laser selecionada variará de acordo com as proteínas fluorescentes individuais expressas. - Mantenha o poder uniforme do laser e as configurações confinais do pinhole entre as regiões tumorais imaginadas. Utilize a configuração de potência de laser mais baixa necessária para demarcar claramente os órgãos e processos celulares tumorais para limitar a fototoxicidade. As unidades de parâmetros de imagem específicas ( ou seja, configurações de energia e configurações de pinhole confocal) variam de acordo com as especificações do microscópio e fonte de laser.
- Compensar a potencial evaporação da mídia, adicionando 2 - 3 "buffer" etapas de pilha Z nos aviões focais avançando em direção ao objetivo. Isso efetivamente impede o tecido de deixar o alcance do acervo Z-stackÍons no plano vertical.
7. Pós-processamento de imagens e rastreamento de células tumorais
NOTA: Muitos sistemas de imagem confocal são equipados com software de processamento de imagem proprietário. As etapas de processamento discutidas abaixo compreendem um protocolo geral, que pode ser executado em plataformas de software. Serão fornecidas instruções específicas para plataformas de código aberto, NIH ImageJ e MTrackJ 15 .
- Abra um arquivo de pilha em Z. No ImageJ, clique em "Imagem → Pilhas → Projeto Z". Escolheu a primeira e última pilha Z para incluir, e escolheu "Max Intensity" como o tipo de projeção. O resultado é uma renderização chamada de projeção de intensidade máxima (MIP). Crie um MIP de cada conjunto de imagens de pilhas Z capturadas em cada região criada.
- Concatene os MIPs de cada região para criar uma série de tempo. Clique em "Imagem → Pilhas → Imagens para empilhar".
- Identificar manualmente a localizaçãoDo "centroide" do corpo da célula selecionando o ponto central visualmente aproximado do corpo da célula tumoral. Isso é conseguido clicando no corpo da célula usando a funcionalidade de trilha "adicionar" de MTrackJ (um plugin para código aberto para NIH ImageJ).
- Clique para demarcar a localização do corpo da célula em cada quadro da série de imagens. Isso cria uma única "faixa" para cada célula. Seqüencialmente, marque as localizações do corpo da célula próxima. Repita esse processo até que todos os caminhos de migração celular sejam rastreados.
- Uma vez que uma população de células é rastreada em uma determinada micro região de tumor, exporte todas as coordenadas de trilha celular usando a função "medida" de MTrackJ. Salve o arquivo como um formato .xls para que os dados brutos possam ser analisados usando planilha eletrônica ou software gerado por usuários.
- Use as coordenadas registradas para cada ponto ao longo da faixa de migração de uma célula, para realizar análises quantitativas, incluindo derivação de velocidade de migração, direcionalidade e outras migraçõesMétricas, como descrito em Parker et al 16 .
NOTA: Todas as distâncias e velocidades calculadas são sub-estimativas de valores reais. Isso é inerente à transformação de imagens tridimensionais (e caminhos de migração) para dados bidimensionais através da geração de projeções de intensidade máxima.
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Representative Results
Nosso grupo gerou com sucesso culturas de fatia de mais de 50 pacientes submetidos à ressecção GBM inicial. Este protocolo de produção, cultura, reviragem retroviral, imagem e análise de migração de fatia foi simplificado em um fluxo de trabalho reprodutível ( Figura 1 ). Criticamente, essas fatias organotípicas de GBM demonstram concordância com o tecido tumoral originário em toda a cultura, incluindo manutenção de características patológicas e microglia até 15 dias em cultura ( Figura 2 ). Além disso, utilizamos este sistema para realizar ensaios funcionais de resposta tumoral a mudanças microambientais. Como uma métrica de integridade fisiológica, foram examinados como GBM culturas de fatias respondeu a hipoxia (1% de O2) através da medição da produção do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), um processo que ocorre abundantemente dentro do microambiente do GBM in vivo 17,"18. Demonstrámos que ao colocar as culturas de fatia em condições hipóxicas, as fatias montaram uma resposta fisiológica rápida, induzindo a liberação de VEGF para a mídia ( Figura 3 ).
Para avaliar aspectos qualitativos e quantitativos da migração de células tumorais, utilizamos as imagens de lapso de tempo para gerar mapas de migração detalhados. Esses mapas demarcam todas as células GBM rastreadas dentro dos limites das microrregiões tumorais (1 mm 2 ), proporcionando uma visualização estática do comportamento migratório dinâmico da população tumoral. As medidas quantitativas da velocidade e direcionalidade da migração (deslocamento celular / distância total percorrida) foram calculadas para cada célula, permitindo a investigação de mudanças nos parâmetros de migração em regiões tumorais, amostras tumorais e em resposta ao tratamento ( Figura 4 ).
O protocolo de identificação e marcação de célulasCribado aqui também fornece resolução espacial e temporal suficiente para avaliar mudanças na morfologia celular durante a migração através do microambiente de tumor nativo. Observamos a presença de células tumorais moveis morfologicamente distintas e microgliais entremeadas dentro da cultura de fatia ( Figura 5A ). O movimento das células tumorais foi caracterizado por um processo de "busca e explosão", que envolveu protrusão e retração repetidas de filopodas a partir de uma célula estática, seguido por um curto período de movimento eficiente. As regiões da fatia de imagens aproximadamente a cada 10 min também forneceram uma resolução temporal adequada para gravar imagens de lapso de tempo de células tumorais submetidas à divisão celular. Essas células divididas pararam da migração, completaram a mitose e as células filhas re-iniciaram a migração sem demora, tudo dentro de um prazo de 3 horas ( Figura 5D ). Em contraste, as microglias migram a uma velocidade maior e mais consistente, com direcionalidade menor do que as células tumorais adjacentes,Demonstrando sua migração relativamente ineficiente ( Figura 5C, 5E-G ). Tais observações podem ser importantes para obter informações sobre a biologia subjacente às respostas específicas do paciente ou células ao tratamento.
Finalmente, utilizamos este protocolo para demonstrar a variabilidade paciente-paciente nos parâmetros de migração celular ao nível da população, incluindo uma correlação da amplificação genômica do receptor do fator de crescimento epidérmico ( EGFR ) com o potencial migratório aumentado das células tumorais 16 . Além disso, o microscópio em lapso de tempo de fatias de tumor antes e após o tratamento com o fármaco anti-invasivo, o gefitinib, demonstrou uma redução significativa na migração, que era específica para fatias tumorais amplificadas por EGFR 16 .
Figura 1: Transmissão de infecção, imagem e fluxo de trabalho de análise de migração celular. O tecido tumoral é localizado em uma região específica através de equipamentos de navegação intra - operatórios. Uma semana após o corte, o ZsGreen que expressa o retrovírus é adicionado às culturas de fatia para rotular as células tumorais mitoticamente ativas. 3 dias após a infecção, as fatias são preparadas para imagem confocal. Os dados de imagem 3D são pós-processados em imagens 2D para o rastreamento do caminho de migração celular, geração de mapas de migração de células tumorais e cálculo de parâmetros de migração de células tumorais. Porções desta figura foram originalmente publicadas em Parker et al , 2013 16 e reproduzidas com permissão da Oxford University Press. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. As fatias organotípicas do GBM humano mantêm características histológicas ao longo da cultura Ex Vivo . ( A ) As seqüências de ressonância magnética de contraste T1 foram utilizadas para localizar e documentar a (s) região (s) de aquisição de tecido (seta). ( B ) Coloração de H & E do tecido doador inicial (OR) e fatias no dia 8 da cultura de uma cultura de fatia gerada a partir do tecido obtido da região destacada em A. ( C ) As características patológicas e celulares microambientais do GBM, in vivo , são mantidas Em toda a cultura de fatia. (I, II) A imuno-histoquímica para CD68, um marcador de microglia / macrófago, com ampliação baixa (superior) e alta (inferior), demonstra a persistência microglial em fatias após 15 dias de cultura. A coloração de H & E no dia 4 da cultura de fatia confirma a manutenção da necrose pseudopalisante, um pathoCaracterística lógica do GBM, tanto na ampliação baixa (iii) quanto alta (iv). Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Culturas de fatia GBM humanas secretam VEGF em resposta à hipoxia. ( A ) O experimento utilizou inserções de cultura individuais contendo 3 fatias tumorais de tamanho semelhante geradas a partir da mesma região tumoral. As fatias foram mantidas em normoxia por 12 h, seguidas por dois intervalos de hipóxia de 12 h, com novas mídias adicionadas antes de cada intervalo. ( B ) A secreção de VEGF na mídia medida por ELISA (média ± desvio padrão) de culturas de fatia geradas a partir de dois tumores representativos foi significativamente aumentadaHipoxia do que normoxia (p <0,05). ( C ) Uma análise conjunta de culturas de fatia de 4 tumores diferentes demonstrou aumento da secreção de VEGF após intervalos sequenciais de 12 h de hipoxia em comparação com normoxia (p <0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Dados da trilha do caminho da célula tumoral permitem a determinação quantitativa da velocidade e direção da célula. ( A ) As células tumorais com uma direccionalidade de 1 representam a eficiência perfeita ao longo de um vetor reto, enquanto que aqueles com direcionalidade inferior se envolvem em caminhos meandros ineficientes, como representado neste esquema 16 . Reimpresso com permissão da Universidade de OxfordPressione. ( B ) Análise de dados de trilha de caminho representativos (resolução "baixa" ~ 55 minutos de intervalos de rastreamento celular) demonstra variabilidade celular em velocidade e direcionalidade. ( C ) A direcionalidade versus velocidade de migração para cada faixa celular é plotada para visualizar o comportamento de migração em toda a população celular (cada ponto representa uma célula individual). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Microglia dentro de GBM Slice Cultures são caracterizadas pela alta velocidade de migração e baixa direcionalidade relativa às células tumorais. ( A ) Replicando as células tumorais que expressam seletivamente o retrovírus ZsGreen e a microglia marcada com uma Isolectina-I O conjugado B 4 -647 existe misturado numa microrregião tumoral representativa a partir de uma cultura de fatia representativa. ( BC ) Os caminhos do GBM ( B ) e da microglia ( C ) rastreados individualmente na mesma micro região do tumor demonstram comportamentos de migração discordantes. Barras de escala = 200 μm. ( D ) Uma célula de migração ativada pausa, retrai seus processos (seta), sofre divisão celular e duas células filhas migram para fora em direções opostas (setas). Barras de escala = 50 μm. ( E e F ), a microglia demonstra aumento da velocidade de migração (p <0,0001) e diminuição da direcionalidade (p <0,0001) quando comparado às células tumorais na mesma região. (G) A distribuição de células tumorais e microgliais com base na velocidade e direcionalidade demonstra os fenótipos migratórios únicos das duas populações celulares.Et = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As culturas de fatias organotípicas de tecido de câncer humano fornecem uma plataforma atraente e subutilizada para experimentação pré-clínica de tradução. Não existe conhecimento dos comportamentos a nível populacional das células tumorais no que diz respeito à migração, proliferação e morte celular no microambiente do tumor nativo. Criticamente, estudar a resposta tumoral à terapia de forma dinâmica e resolvida no tempo ao nível do comportamento celular pode esclarecer novos mecanismos de resistência ao tratamento. As culturas de fatia de tumor humano fornecem uma ligação entre o processo da doença humana e as técnicas de modelagem ex vivo e in vivo atual 19 . Recentemente, validamos a técnica descrita aqui como um método para estudar a migração de GBM, relatando as variações inter-tumorais mensuráveis pela primeira vez no comportamento da migração celular relacionadas à amplificação e sinalização de EGFR 16 . Este estudo também utilizou o modelo de cultura de fatia para testar a paciênciaEficácia específica do nt do inibidor de EGFR, gefitinib, como potencial terapia anti-invasiva para GBM 16 .
Várias das armadilhas comuns durante o corte de tecidos, infecção retroviral, imagem e paradigma de análise de imagem foram discutidas acima. No entanto, o protocolo de infecção retroviral merece atenção adicional. Dada a variação de paciente a paciente, pode ser desafiador avaliar a densidade de células tumorais marcadas viralmente dentro de cada fatia. Se números insuficientes de células forem marcados pela construção viral, adicione alíquotas adicionais de 5-10 μL de sobrenadante retroviral para a superfície de cada fatia diariamente até a concentração desejada de células tumorais marcadas. Em culturas de fatia primárias, a percentagem de células replicantes é geralmente inferior à das linhas celulares transformadas, limitando assim o subconjunto de células permissivas à incorporação retroviral em qualquer ponto do tempo. Alternativamente, se muitas pilhas estiverem rotuladas, evitandoDemarcação de urate dos caminhos de migração celular, diluir o sobrenadante viral com meios neuronais para obter um título efetivo mais baixo. A microglia associada ao tumor incorporou a proteína fluorescente expressando retrovírus a uma frequência de aproximadamente 1% de todas as células marcadas. Nós conseguimos isolar visualmente essas células para análise separada pelo uso de uma lectina de ligação à microglia para análises de dados pós-imagem ( Figura 5 ).
O microambiente do tumor, incluindo aspectos da distribuição de nutrientes, interações células-células e matriz extracelular, todos desempenham um papel na patogênese do GBM 20 . Culturas humanas diretas de fatia de GBM eliminam a necessidade de passagens em modelos de animais pequenos ou cultura de células disseminadas, ao mesmo tempo que fornecem uma recapitulação próxima do microambiente do tumor humano. Além disso, as culturas de fatia fornecem acesso uniforme a nutrientes em amostras, enquanto mantêm as interações celulares e células-ECM. Reduzindo VarNo acesso celular aos nutrientes que se sabe que ocorrem nos tumores, propomos que as diferenças observadas nas culturas arrojam luz sobre as diferenças intrínsecas entre os comportamentos das células tumorais ( isto é, a migração) ao nível da população. No entanto, a interpretação de dados coletados em culturas de fatia geradas a partir de tumores humanos é complicada pela heterogeneidade intra e intra-tumoral inerente. Criticamente, é necessário um maior estudo para caracterizar as potenciais mudanças genéticas e epigenéticas que podem ocorrer durante a manutenção ex vivo de culturas de fatias tumorais humanas.
O uso de culturas de fatias de tumor humano em paralelo com os ensaios clínicos de Fase I / II é uma estratégia promissora para correlacionar os parâmetros da fatia com os resultados clínicos do paciente. A validação desses potenciais parâmetros preditivos / prognósticos é necessária antes que as culturas de fatia possam ser usadas para personalizar a terapia oncológica. Nosso trabalho, bem como o de outros, demonstra viabilidade de validação de biomarcadores <Sup class = "xref"> 21, bem como teste rápido ex vivo de agentes terapêuticos em culturas de fatia de GBM 9 , 16 . Técnicas similares de cultura de fatia humana usando pulmão 22 , colon 22 , cabeça e pescoço 23 , mama 24 e câncer de próstata 25 tecidos sugerem que esta abordagem é generalizável em todos os tipos de câncer humano.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Lee Niswander e ao Dr. Rada Massarwa por sua experiência técnica e contribuições para o protocolo de imagem confocal de cultura de fatia descrito aqui. Além disso, graças ao Dr. Kalen Dionne, que forneceu conhecimentos sobre como otimizar o corte de tecido cerebral e os parâmetros de cultura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 °C, Remains fluid at 37 °C, and sets rapidly below 25 °C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square - S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20 mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 mm |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
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