Gjeldende ex vivo- modeller av glioblastom (GBM) er ikke optimalisert for fysiologisk relevant studie av humant tumorinvasion. Her presenterer vi en protokoll for generering og vedlikehold av organotypiske skivekulturer fra fersk, human GBM-vev. En beskrivelse av tidsforskjellmikroskopi og kvantitative cellemigreringsanalyseteknikker er gitt.
Glioblastom (GBM) fortsetter å bære en ekstremt dårlig klinisk prognose til tross for kirurgisk, kjemoterapeutisk og strålebehandling. Progressiv tumor invasjon i omkringliggende hjerneparenchyma representerer en varig terapeutisk utfordring. For å utvikle anti-migreringsterapier for GBM, er modellsystemer som gir en fysiologisk relevant bakgrunn for kontrollert eksperimentering avgjørende. Her presenterer vi en protokoll for generering av skivekulturer fra humant GBM-vev oppnådd under kirurgisk reseksjon. Disse kulturer tillater eks vivo- eksperimentering uten å passere gjennom dyr-xenografter eller enkeltcellekulturer. Videre beskriver vi bruken av tidsforskjell laserscanning konfokal mikroskopi i forbindelse med celleoppfølging for kvantitativt å studere svangerskapsvirkningen av tumorceller og tilhørende respons på terapi. Skiver genereres reproducerbart innen 90 minutter av kirurgisk vevsoppkjøp. Retroviralt mediert fluorescerende celle laBeling, konfokal imaging og tumorcelle migreringsanalyser blir deretter fullført innen to ukers kultur. Vi har med hell brukt disse skivekulturer for å avdekke genetiske faktorer knyttet til økt migrerende atferd i menneskelig GBM. Videre har vi validert modellens evne til å oppdage pasient-spesifikk variasjon som svar på anti-migrasjonsbehandlinger. Fremover er menneskelige GBM-stykkulturer en attraktiv plattform for rask eks vivo- vurdering av svulstfølsomhet overfor terapeutiske midler, for å fremme personlig neuro-onkologisk terapi.
Laboratorieundersøkelsen av glioblastom (GBM) hindres av mangel på modeller som trofast rekapitulerer de nødvendige patologiske egenskapene til den menneskelige sykdommen, nemlig tumorcellemigrasjon og invasjon. Sammenligningsstudier av 2D- og 3D- in vitro- analyser samt 3D-gnagerekulturmodeller har avdekket mekanisk forskjellig cellulære migrasjonsprogrammer i disse to sammenhenger, som potensielt begrenser translatabiliteten av funn fra 2D-systemer til den humane sykdommen 1 , 2 , 3 . Det organotype tumorskivekulturen og avbildningsparadigmet beskrevet her tillater studier av tumorcellemigrasjon i skiver av humant tumorveve fra ex vivo oppnådd fra kirurgisk reseksjon. Dermed gir skivekulturer av kirurgisk resektert tumorvev i forbindelse med konfidensmikroskopi med tidsforskyvning en plattform for å studere tumorcelle-migrasjon i den nativeMikromiljø uten vevsoppløsning eller kulturpassasje.
Det er omfattende litteratur som benytter gnagere hjerneskivekulturmodeller av GBM generert fra humane tumor-xenografter, retroviral-induserte svulster og cellulære overlegg for å studere tumorinasjon 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Nylig har flere grupper beskrevet genereringen av organotypiske skivekulturer direkte fra humant GBM-vev 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Det er imidlertid markert variasjon blant publiserte protokoller med hensyn til kuttteknikk og kulturmedier. Videre har bruken av organotypiske skivekulturer fokusert på statiske eksperimentelle endepunkter som har inkludert endringer i celle signalerNg, spredning og død. Protokollen beskrevet heri utvider seg på tidligere slice kultur paradigmer ved å inkorporere tidsløst observasjon av dynamisk tumor celle oppførsel gjennom time-lapse laser scanning konfokal mikroskopi. Nylig oppdagelse av inter 11 og intratumoral 12 , 13 genetisk variasjon i human GBM understreker viktigheten av å knytte denne heterogeniteten til tumorcelleadferd og dens implikasjoner på tumorrespons på terapi. Her rapporterer vi en strømlinjeformet og reproduserbar protokoll for bruk av direkte skivekulturer fra et humant kreftvev for å visualisere tumorcellemigrasjon i nær sanntid.
Organotypiske skivekulturer fra humant kreftvev gir en attraktiv og underutilisert plattform for preklinisk translasjonell eksperimentering. Forståelse av befolkningsnivåbetegnelse av tumorceller med hensyn til migrasjon, proliferasjon og celledød i det naturlige tumormiljømiljøet mangler. Kritisk kan studiet av svulstrespons på terapi i en dynamisk, tidsbesparende måte på nivået av celleadferdighet, kaste lys på nye mekanismer for behandlingsmotstand. Humane tumorskivekulturer gir en sammenheng mellom den hum…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Dr. Lee Niswander og Dr. Rada Massarwa for deres tekniske ekspertise og bidrag til slice culture confocal imaging protokollen beskrevet her. Videre takk til Dr. Kalen Dionne som ga kompetanse om optimalisering av hjernesvulstensnitt og kulturparametere.
DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
Equipment | |||
Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |