Текущие модели ex vivo глиобластомы (GBM) не оптимизированы для физиологически значимого изучения инвазии опухоли человека. Здесь мы представляем протокол для генерации и поддержания органотипических культур срезов из свежей ткани человеческого GBM. Приводится описание методов временной микроскопии и количественного анализа миграции клеток.
Глиобластома (GBM) по-прежнему имеет крайне плохой клинический прогноз, несмотря на хирургическую, химиотерапевтическую и лучевую терапию. Прогрессивная инвазия опухоли в окружающую паренхиму мозга представляет собой прочный терапевтический вызов. Для разработки антимиграционных методов лечения для GBM необходимы моделирующие системы, которые обеспечивают физиологически обоснованный фон для контролируемых экспериментов. Здесь мы представляем протокол для получения срезов культур из ткани GBM человека, полученных во время хирургической резекции. Эти культуры позволяют проводить эксперименты ex vivo без прохождения через ксенотрансплантаты животных или культуры отдельных клеток. Кроме того, мы описываем использование латентно-сканирующей конфокальной микроскопии с временной задержкой в сочетании с отслеживанием клеток для количественного изучения миграционного поведения опухолевых клеток и связанного с ними ответа на терапию. Срезы воспроизводимо генерируются в течение 90 минут после приобретения хирургической ткани. Ретровирально-опосредованная флуоресцентная клетка laЭпиляция, конфокальная визуализация и анализ миграции опухолевых клеток затем завершаются в течение двух недель после культивирования. Мы успешно использовали эти срезовые культуры для выявления генетических факторов, связанных с увеличением миграционного поведения в человеческом GBM. Кроме того, мы подтвердили способность модели обнаруживать специфические для пациента вариации в ответ на антимиграционную терапию. Двигаясь вперед, человеческие культуры срезов GBM являются привлекательной платформой для быстрой оценки ex vivo чувствительности опухоли к терапевтическим агентам, чтобы продвигать персонализированную нейро-онкологическую терапию.
Лабораторное исследование глиобластомы (GBM) затруднено отсутствием моделей, которые добросовестно повторяют необходимые патологические характеристики заболевания человека, а именно миграцию и инвазию опухолевых клеток. Сравнительные исследования двумерных и трехмерных исследований инвазии in vitro, а также трехмерных моделей культивирования кусочков грызунов выявили механически разрозненные программы миграции клеток в этих двух контекстах, что потенциально ограничивает возможность переводимости результатов 2D-систем на болезнь человека 1 , 2 , 3 . Описанная здесь органотипическая культура кусочков опухоли и парадигма визуализации позволяют изучать миграцию опухолевых клеток внутри срезов ткани опухоли человека ex vivo, полученных при хирургической резекции. Таким образом, срезовые культуры хирургически резецированной опухолевой ткани в сочетании с временной конфокальной микроскопией обеспечивают платформу для изучения миграции опухолевых клеток в нативнойМикросреды без растворения ткани или пассирования культуры.
Существует обширная литература, в которой используются модели культивирования мозговых срезов грызунов GBM, полученные из ксенотрансплантатов опухолей человека, опухолей, индуцированных ретровирусом, и клеточных оверлеев для изучения инвазии опухоли 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Недавно несколько групп описали генерацию органотипических срезов кусочков непосредственно из ткани GBM человека 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Тем не менее, среди опубликованных протоколов есть заметные различия в отношении техники среза и культуральных сред. Кроме того, использование органотипических культур срезов было сосредоточено на статических экспериментальных конечных точках, которые включали изменения в сигнале клетокНг, пролиферацию и смерть. Протокол, описанный здесь, раскрывается по предшествующим парадигмам культуры среза путем включения разрешенного во времени наблюдения динамического поведения опухолевых клеток с помощью скоростной лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Недавнее обнаружение интер- 11 и внутриутробной 12 , 13 генетической вариации в человеческом GBM подчеркивает важность увязки этой гетерогенности с поведением опухолевых клеток и ее последствиями для ответа опухоли на терапию. Здесь мы сообщаем об упорядоченном и воспроизводимом протоколе для использования прямых культур срезов из раковой ткани человека для визуализации миграции опухолевых клеток в почти реальном времени.
Органотипические культуры срезов из раковых тканей человека обеспечивают привлекательную и недоиспользуемую платформу для доклинических трансляционных экспериментов. Отсутствует понимание поведенческого поведения опухолевых клеток в отношении миграции, пролиферации и гибели кл?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Ли Нисвандера и доктора Раду Массарва за их технический опыт и вклад в протокол конфокальной обработки изображений среза, описанный здесь. Кроме того, благодаря доктору Калену Дионне, который предоставил экспертные знания в отношении оптимизации среза ткани опухоли головного мозга и параметров культуры.
DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
Equipment | |||
Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |