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Medicine

Diffuse Spectroscopie optique pour l'évaluation quantitative de la toxicité de la peau induit par les rayonnements ionisants aiguë Utilisation d'un modèle de souris

doi: 10.3791/53573 Published: May 27, 2016

Introduction

Les améliorations technologiques en radiothérapie (RT) la planification et la livraison permettent maintenant des doses thérapeutiques hautement conformes à livrer à la région de la tumeur, tout en épargnant simultanément les structures environnantes normales. Pourtant, les toxicités aiguës et parfois sévères sont inévitables lorsque la cible à haute dose est à proximité de la peau. Si assez sévères, les lésions tissulaires normales résultant peut avoir une incidence négative sur le résultat du traitement RT et la qualité de vie des patients 1,2.

Malgré les conséquences néfastes, la gestion actuelle de l'érythème cutané de rayonnement reste non spécifique, en utilisant des crèmes ou des pommades qui ignorent les mécanismes biologiques sous-jacents menant à des dommages. Ces approches sont basées sur la diminution des symptômes plutôt que la cause. En outre, le calendrier et l'administration des thérapies interventionnelles est compliquée par la nature qualitative et subjective de l'évaluation des lésions de la peau de rayonnement. Alors que plusieurs ont reconnuorganisations (RTOG, EORTC) fournir des recommandations de classement visuel, les institutions varient dans leur choix de notation préféré, occultant ainsi les comparaisons des toxicités de tissus normaux aux fins de méta-analyses. En outre, ces systèmes de classement sont rudimentaires et sujettes à la variabilité inter-observateur, tels que les différences de rayonnement gravité des blessures peuvent être indiscernable dans les études d'évaluation des stratégies de réduction de la toxicité.

Plutôt que de décrire visuellement le degré d'érythème dans la peau irradiée, une autre approche consiste à mesurer des paramètres qui décrivent quantitativement les changements physiologiques sous-jacents qui se produisent dans l'organe. Hémoglobine (Hb), la saturation en oxygène du tissu (sto 2) ou de l' hémoglobine oxygénée (oxyHb) les niveaux ont été utilisés comme substituts pour l' érythème induit par irradiation chez la souris 3-6. Après irradiation, les niveaux Hb totaux subissent des fluctuations, mais oxyHb ou StO 2 subissent une forte hausse début caractéristique, suivi d'unl' automne et une autre augmentation de 3,6 plus persistante. Quand les irritants sont utilisées pour induire l' érythème cutané, les niveaux de oxyHb vasculaires sont en corrélation directe avec la sévérité de l'érythème et de l' inflammation locale 7.

Diffuse spectroscopie optique (DOS) utilise la lumière infrarouge proche pour fournir des informations fonctionnelles sur les composants biochimiques et microstructure des tissus vitaux composants. Cette technologie optique quantitative, non-invasive offre une méthode pour mesurer la vasodilatation induite par les cytokines dans les vaisseaux sanguins qui se produisent au cours de l' érythème par des substituts fonctionnels de concentration Hb et StO 2. Des études récentes comparant les paramètres mesurés avec DOS méthodes de notation cliniques contrôlés 8-11 montrent le potentiel de cette technique pour surmonter les limitations inhérentes à la classification actuelle systèmes.

Nous décrivons ici un, système DOS en interne portable qui emploie des substituts fonctionnels pour quantitativement detedifférences ction de la toxicité induite par le rayonnement dans la peau d' un modèle de souris pré-clinique 5. La plate-forme décrit peut fournir un moyen de notation standardisée érythème avec une grande sensibilité pour la détection précoce et la différenciation subtile de la réponse d'intervention de la drogue. En outre, avec seulement des adaptations mineures, l'instrumentation peut éventuellement être employé en clinique pour la surveillance de chevet en temps réel.

Protocol

Les méthodes suivantes sont en conformité avec les directives du Comité d'éthique de protection des animaux Sunnybrook Research Institute.

Système 1. Diffuse réflectance Spectroscopy

  1. Recueillir des spectres de réflexion diffuse en utilisant un ordinateur de poche, d'une sonde à fibre optique et portable système d'acquisition spectroscopique qui a été décrite précédemment (Kim et al. , 2010) et est brièvement rappelé sur la figure 1 (et les légendes associées) sont complets 1,2.

2. Préparation du modèle murin de lésions cutanées d'irradiation aiguë

  1. Ordre de 6 semaines vieilles souris (de préférence sans poils, comme athymiques ou SKH-1) et leur permettre d'acclimater dans l'animalerie pendant une semaine avant de commencer les expériences. Réserver au moins 3 souris pour un groupe témoin non irradié et 5 souris pour un groupe irradié.
  2. Avant de mesures de base DOS et irradiation, étiqueter les souris en utilisant des poinçons d'oreille ou un marqueur permanent markings sur la queue. Si la souris ne sont pas nue, enlever les poils sur un 2 cm par 2 cm parcelle de peau de flanc, mais cela peut provoquer une irritation de la peau.

3. Diffuse optique d'acquisition de données Spectroscopy

  1. Allumez l'alimentation à l'électronique.
  2. Pour la peau de la souris, définir les paramètres de signaux pour le logiciel d'acquisition en tapant 25 msec pour le temps de collecte, 25 pour les moyennes de signaux et 1 pour la largeur de filtre de wagon. Ces paramètres offrent un équilibre raisonnable entre le temps d'acquisition et le signal au bruit.
  3. Utilisation d'un logiciel d'acquisition personnalisé programmé, acquérir automatiquement une lecture de fond, R bg (LED éteinte) et réflectance diffuse à deux distances de séparation source-détecteur, meas R (260 um, 520 um) en cliquant sur ​​le bouton "Acquérir". Le temps d'acquisition total est ~ 2 sec.
  4. Eteignez toutes les lumières de la pièce fluorescentes en appuyant sur l'interrupteur de la lumière ambiante avant d'effectuer des mesures.
    NOTE: Fluorescsalle lumineuse ent interférer avec le signal détecté (ces lumières produisent une intensité lumineuse variable dans le temps et il est donc difficile de soustraire un signal d'arrière-plan). Bien que les ampoules à incandescence peuvent être employées garder les lumières à distance de la sonde DOS pour éviter des niveaux de fond élevés (et pauvre signal sur bruit).

4. anesthésie animale et Baseline DOS mesures

  1. Préparer l'appareil d'anesthésie en veillant à ce que toutes les connexions sont de niveau isoflurane intact et liquide est adéquate. Utilisez une chambre d'anesthésie à induction avec un tube fixé et le nez conique qui peut être enregistré vers le bas pour une surface doucement rembourrée stérilisée à distance confortable de la sonde DOS.
  2. Anesthésier une cage de souris à la fois dans la chambre d'induction par induction avec 4% d'isoflurane pendant 30 sec. Abaisser le montant isoflurane à 2% pour les 2 minutes suivantes. Vérifiez que la souris est anesthésié en observant aucune réponse de pincement d'un orteil de la patte postérieure.
  3. Rapidementdéplacer une souris sur la zone de sondage DOS stérilisée, placez-le sur le côté, fixer son museau dans le cône de nez et ouvrir le tube de cône de nez à l'écoulement de l'anesthésie (2% d'isoflurane).
    NOTE: Si la procédure prend plus de 1 - 2 min, appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
  4. Avant l'acquisition des mesures de la peau de la souris, stériliser la sonde en essuyant avec 70% d'éthanol. Ne pas stériliser la peau.
  5. Placez doucement la sonde sur la peau du flanc en veillant à éviter la dispersion de la vascularisation locale. Tenir la sonde à la main pour la durée de la mesure.
  6. Acquérir des données de réflectance en sondant une zone de peau de flanc d'environ 2 cm par 2 cm (la zone à irradier) en suivant la formation de 5 points sur un dé. Gardez ce modèle, la zone, la pression de sondage de la sonde et le côté du corps (gauche ou droite) cohérente pour toutes les mesures ultérieures.
    NOTE: Le balayage complet prend environ 60 secondes. la pression de la sonde doit être juste assez pour obtenir un balayage sans disperser lvasculature vecinal.
  7. Déplacez la souris dans une cage de récupération, et de déplacer la prochaine souris sur la zone de sondage DOS. Répétez les étapes 04.02 à 04.06 jusqu'à ce que toutes les souris ont été mesurées. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale.

5. irradiation animale

NOTE: Ce protocole nécessite l'utilisation d'un irradiateur, et la préparation des animaux peut être nécessaire d'ajuster pour répondre aux besoins du dispositif de irradiateur. Pendant l'irradiation, seule la petite surface de la peau du flanc doit être exposée au faisceau de rayonnement. L'irradiateur doit être situé dans une installation stérile et la stérilisation de la cage appropriée doit être observée lors du retour des souris à leur zone stérile du logement.

  1. Préparer la machine d'anesthésie (comme dans les étapes 4.1 - 4.2) et une souris anesthésier à la fois dans la chambre d'induction avant de le préparer pour l'irradiation.
  2. Retirez la souris de la chambre d'induction, gently pincer la bande de peau de flanc et la placer sur et en dessous de la peau tendue, formant un rabat.
  3. Placer la souris sur une scène de Plexiglas et recouvrir le corps avec un gabarit personnalisé conducteur (un dessin de travail est une boîte rectangulaire avec le fond et au moins une extrémité ouverte, et une fenêtre latérale pour permettre à la peau de flanc d'être tirée à travers). Tirez le rabat de la peau à travers la fenêtre de gabarit et la bande doucement le rabat sur la scène.
    REMARQUE: le gabarit personnalisé au plomb est suffisamment petit pour immobiliser la souris. Si le gabarit personnalisé n'immobilise pas complètement la souris, puis d'utiliser des retardateurs additionnels et / ou d'administrer la kétamine (80 - 100 mg / kg) et de xylazine (10 à 12,5 mg / kg) par injection intrapéritonéale de maintenir la souris immobilisé pendant toute la durée d'irradiation procédure.
  4. Placez le stade de plexiglass avec le gabarit et la souris dans l'irradiateur. Déterminez les paramètres (distance peau de source de rayons X, la tension, la durée et l' intensité) et délivrer la dose souhaitée (par exemple, 11 cm à partir d' un kVp x- 160source de rayons pendant 2,5 minutes à 6,3 mA).
    REMARQUE: Utilisez ATTENTION avec la source de rayons X en suivant les directives d'utilisation de la machine pour éviter les brûlures et les dommages à l'ADN.
    REMARQUE: des souris nues athymiques développent desquamation environ 14 jours après l'irradiation en réponse à 35 Gy, mais seulement desquamation inégale mineur avec 17 Gy.
  5. Prenez l'appareil et de la souris sur l'irradiateur, enlevez la protection, retirez la bande et le placer dans une cage de récupération individuelle. Retour de la souris dans sa cage partagée normale après avoir récupéré de l'anesthésie. Répétez les étapes 05.02 à 05.04 pour toutes les souris, et effectuer une opération fictive sur des souris de contrôle.
  6. Après irradiation, loger les animaux dans leurs conditions régulières. Si un comportement anormal se développe (par exemple, une posture voûtée, ce qui peut signifier la douleur), consulter un vétérinaire pour diagnostiquer le problème. La douleur atténuation peut comprendre l'administration de 0,1 mg / kg par voie sous cutanée buprénorphine ou comme dirigé par le vétérinaire. Si la perte de poids est supérieur à 20% de la normale body masse, maison séparément dans sa propre cage et de fournir des aliments à haute teneur en éléments nutritifs.

6. Suivi Mesures DOS

  1. Surveiller et mesurer la peau intensité de réaction en utilisant la technique quantitative DOS. L' inspection visuelle des changements de la peau et des travaux antérieurs suggèrent que de grands changements dans les paramètres DOS peuvent être attendus ( par rapport à la ligne de base) autour de 6 - 12 jours après irradiation 3,4. Toutefois, étant donné que des changements appréciables peuvent avoir lieu plus tôt ou plus tard, selon le modèle, d'autres points de temps de mesure peuvent être utiles pour enquêter.
  2. Mettre en place l'équipement et étalonnages comme décrit dans la section 3.Préparer l'appareil d'anesthésie et d'acquérir des mesures DOS comme décrit dans la section 4 DOS.

7. Post-acquisition Traitement

NOTE: Toutes les étapes de la section suivante sont effectuées à l'aide d'un programme personnalisé créé dans un environnement de logiciels de haute performance. Standardized nommage couventions pour chaque fichier d'acquisition spectrale sont utilisées pour permettre le traitement par lots. Toutes les étapes sont illustrées sur la figure 2.

  1. Soustraire la ligne de base (bruit de fond) de tous les spectres mesurés, y compris la lecture de fond.
  2. Soustraire la lecture de fond, R bg (LED éteinte), obtenu à l' étape 3.3 à partir du spectre de mesure, meas R.
    NOTE: Pour le reste de cet article tous les spectres sont supposés être du bruit de fond et le fond soustraites et appelés R corr.
  3. Convertir R corr à réflectance absolue, R abs, comme décrit dans les références 1,2 dans la section 1.
    1. Obtenir des mesures relatives de réflectance, Rrel, dans Intralipid-20% fantômes (Fresenius Kabi, Suède) Phantoms avec l' augmentation de 3% des fractions aliquotes jusqu'à 48% (soit 3%, 6%, 9%, ..., 48%) et créer de terrain de Rrel fonction de la concentration Intralipid.
    2. Générer un complot absolu de abs R par rapport &# 956; en utilisant l'équation de diffusion pour le facteur de réflexion de 14.
    3. Faites correspondre le pic des deux courbes et ajuster l'axe des x Rrel pour correspondre à l'axe des x R abs.
    4. À une longueur d'onde et la séparation source-détecteur donnée, l'échelle de l'axe y en utilisant:
      Figure 1
      NOTE: Dans la section suivante, tout ajustement de mesures fera référence à R abs.

Fitting 8. Données spectroscopiques

NOTE: La section suivante décrit la théorie et algorithme d'ajustement utilisé pour extraire les paramètres fonctionnels de souris peau. Pour toute théorie employée, se référer aux articles suivants 14-18 et les références qui s'y trouvent . Toutes les équations sont supposés être programmé dans un environnement logiciel scientifique haut de gamme (contenant des modules pré-programmés) couramment utilisés dans la physique ou l'ingénierie des laboratoires.

  1. Programmer une fonction qui décrit l'unspectre bsorption, u un (λ) de la peau comme la somme des chromophores individuels dans la gamme spectrale d'intérêt en utilisant l'équation:
    Figure 1
    Ici, H b est la concentration totale d'hémoglobine (g / L), tandis que StO 2 est la saturation en oxygène unitless allant de 0 à 1.
  2. Obtenir oxy, Figure 1 Et désoxy, Figure 1 , Les spectres d'hémoglobine (stockées sous forme de fichiers texte) de la collection en ligne de Prahl 19.
  3. Programmer une fonction qui décrit le spectre de la peau de diffusion, Figure 1 , En utilisant une dépendance de la loi de puissance, où A (cm -1) est la valeur de μ s λ o = 1 nm et k est un facteur de puissance dépend moyen16.
  4. Programmer une fonction mathématique pour la modélisation directe de réflexion diffuse sur la base des équations de référence 14 qui incorporent les équations spectrales étapes 8/2 à 8/3 dans la fonction de modèle vers l' avant ( à savoir R (r, u a (λ), u 's (λ )) = R (r, H b, StO 2, A, k).
    NOTE: Bien que divers modèles existent, l'équation de la théorie de la diffusion à l'état stable fournit une description simple et précise de la répartition de la lumière dans les tissus.
  5. Programmation d'une fonction que les carrés de la différence entre l'avant modélisé réflectance des spectres de la section 8.4 et les spectres de réflectance mesurée.
  6. Changer itérativement H b, StO 2, A, et k jusqu'à ce que la fonction des moindres carrés de différence dans la section 8.5 est plus petite. Le lsqcurvefit de MatLab peut être utilisé pour effectuer automatiquement cette étape.
  7. REPEAt étapes 08.05 à 08.06 pour obtenir des paramètres DOS (H b, StO 2, A, et k) pour tous les ensembles de données de réflectance mesurées.
  8. Tracer le changement relatif dans le paramètre DOS avec la mesure de référence unique correspondant en utilisant la moyenne de l'ensemble de 3 de chaque souris - 5 normalisées des mesures ponctuelles de la sonde. Ces parcelles sont créées en utilisant la commande plot de MatLab.

9. visuelle Radiation Dermatite Scoring Période

  1. Surveiller et marquer la peau intensité de la réaction en utilisant une échelle de notation qualitative (voir Douglas et Fowler échelle de classement 20) après irradiation toutes les 48 heures (on peut aussi observer des changements 3 - 24 h d'irradiation suivant). Deux enquêteurs en aveugle sont idéales. L' acquisition de photographies avec un appareil photo et référence échelle à main (c. -à- règle) peut aider avec des évaluations.
  2. NOTE: Marquer la peau tous les deux jours après l'irradiation peut aider à déterminer les temps de mesure optimale DOS for le modèle. Plus fréquente notation peut fournir des données importantes en fonction du modèle et de la recherche question.
  3. Tracer la médiane de chaque groupe à chaque point de temps. Comparer les groupes à des moments spécifiques ou les zones globales médianes sous chaque courbe.
  4. Après les souris ont été suivies au point de cicatrisation de la peau qui est souhaitée (par exemple, 4 semaines), euthanasier les souris par une méthode appropriée (approuvé).

Representative Results

La technique de réflectance DOS fournit une alternative objective aux méthodes qualitatives traditionnelles de l'évaluation de la toxicité induite par le rayonnement de la peau. changements visuels dans l'apparence de la peau après des doses toxiques de rayonnement présente comme des altérations de l'ampleur et la forme des spectres de réflectance mesurée. Les deux sont liés à des changements fonctionnels dans la microstructure cellulaire sous-jacente et de l'état du tissu physiologique. Dans cette section, les résultats représentatifs des travaux déjà publiés par Yohan et al. 2014 5 sont passés en revue.

Figure 3 ( à gauche) montre les spectres (lignes bleues minces) représentatives mesurée à une source um séparation 260 dans un modèle de souris athymiques de l' érythème de la peau 6 jours après 40 Gy d' irradiation. Par rapport à pré-irradiation (figure 3, panneau de droite), les différences dans la forme spectrale à ~ 550-650 nm sont observées, likely due à une augmentation du taux d'hémoglobine oxygénée. Une petite augmentation de la réflectance absolue est également considérée qui est corrélée à une augmentation de la puissance de diffusion du tissu. Les spectres observés au jour 6 après irradiation en corrélation avec un score de la peau visuelle de 0,75.

Une évaluation de l'après irradiation réflectance changements à sélectionner les longueurs d'onde ne fait pas l'utilisation du spectre de réflectance complète et porte également le problème potentiel de la sensibilité au bruit. Cependant, le montage du spectre complet permet l'ensemble à convertir en biomarqueurs optiques intuitives (H b, sto 2) les données entières. La figure 3 montrent les ajustements résultant (ligne vert) des données mesurées (mince ligne bruyante) en utilisant les équations présentées à la section 4. excellent accord est observé, confirmant que le choix des chromophores de base et la forme de diffusion décrivent adéquatement le modèle de peau de souris.

figure 4 montre les changements relatifs dans la peau StO 2 pour divers points de temps (6, 9, 12 jours) dans une cohorte de souris irradiées (n = 8) tandis que la figure 5 montre les scores qualitatifs de réaction de la peau correspondant. Une augmentation progressive de la StO 2 est observé statistiquement différent par rapport aux valeurs pré-irradiation sur tous les 3 jours (p <0,05). Ces tendances reflètent les augmentations observées visuellement dans des lésions cutanées gravité que le pic au jour 12 (score moyen de ~ 3) démontrant le potentiel de StO2 comme une notation de substitution visuelle (Figure 5).

Il convient de noter qu'aucune modification statistiquement significative n'a été observée pour l'un des biomarqueurs optiques renvoyés pour lanon irradié groupe témoin (n = 3) au cours des 12 jours de mesure (données non présentées). Les changements dans A et k peuvent également être surveillés au cours du temps (figure 6), et ceux - ci indiquent que les propriétés de diffusion de la peau sont en train de changer , en réponse à la radiation.

Figure 1
Figure 1. DOS instrumentation. (A) Représentation schématique de la géométrie de la mesure de la réflectance diffuse (B) de la sonde à fibre optique. La sonde optique est constitué d'un réseau linéaire de 200 um fibres optiques fondamentales qui sont regroupées dans une aiguille de calibre 18 métallique et espacées de 260 um d' intervalle. Deux fibres sources sont couplées à deux diodes émettrices de lumière à large bande tandis qu'une fibre de détection est connecté à un spectromètre optique. En faisant tourner de façon séquentielle sur chacune des sources, le spectromètre peut collecter réflectance diffuse à des distances de 260 um et520 um à partir de chacune des fibres de source (C) Système complet DOS comprenant un ordinateur portable, joint boîte de sonde et optique fibre optique. Un programme d'acquisition automatique de données est utilisée pour piloter la collection séquentielle de spectres. L'électronique sont logés dans un boîtier d'acquisition qui se connecte à la sonde à fibre optique via des connecteurs SMA. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
.. Figure 2 Traitement spectral Toutes les échelles de l' axe des x sont en nm: (A) de spectres relatifs Raw, la ligne de base est la lecture d' environ entre 900 - 1000 nm et approximativement égal au signal de fond (B) fond relative lecture (C.. ) Contexte et base soustraites s relatives pectra. (D) Absolument étalonné spectre suivant l' échelle des spectres traités montré en (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. typique blanc spectres de lumière de réflectance de non irradiées ( à gauche) et irradiées ( à droite) la peau de souris 6 jours après l' irradiation. Excellent accord entre la mesure (bruyant bleu) et des accès (vert solide) ont été généralement observées. Deux principales différences ont été observées entre les deux groupes: 1) une augmentation globale de la réflectance absolue et 2) un net changement dans la forme spectrale entre 550-600 nm. Avec la permission de Yohan et al. 2014 5.> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Changement dans la fraction d'oxygénation de la peau de souris après 40 Gy d' irradiation. La différence moyenne de référence normalisée entre les deux groupes (par souris) est significatif pour les jours 6 (encadré 1), 9 (encadré 2) et 12 (encadré 3 ). Avec la permission de Yohan et al. 2014 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Moyenne peau qualitative réactions scores (n = 8) en fonction des jours suivants 40 Gy irradiés peau de souris. Adapté de Yohan et al. 2014 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Les changements relatifs à A et k de la peau de la souris après 40 Gy d' irradiation sur les Jours 6 (encadré 1), 9 (encadré 2) et 12 (encadré 3). Le changement de A (côté gauche) et k (côté droit) le jour 6 (encadré 1, gauche et à droite) a été jugée significative (p <0,026). Avec la permission de Yohan et al. 2014 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Une approche DOS pour évaluer quantitativement les toxicités de la peau de rayonnement à l'aide de biomarqueurs optiques a été présenté. systèmes de notation visuelle de toxicité de la peau exigent une formation spécialisée et même alors, sont sujettes à la variabilité et de la subjectivité inter-observateur. Le système et l'analyse des logiciels DOS est simple à utiliser, nécessite un minimum de formation et renvoie les paramètres fonctionnels objectifs pour interpréter les changements physiologiques dans la peau. En outre, au lieu de décrire l'apparition d'une lésion de la peau comme un seul paramètre, DOS fournit une mine d'informations en forme spectrale, propriétés optiques et paramètres fonctionnels / microstructure qui offrent un degré supplémentaire de sensibilité et de spécificité non disponible dans les méthodes de notation qualitatives actuelles. Les articles 1 et 7 mettent en évidence les principales étapes de traitement pour obtenir des données spectrales absolues qui peuvent être utilisés pour le montage quantitative des biomarqueurs optiques. Contexte et base de soustraction sont indispensables pour permettre à l'utilisateur d'effectuerles mesures DOS dans des conditions d'éclairage normales. La section 8 fournit les modèles et les équations nécessaires pour décrire des souris athymiques avant et après irradiation aux rayons X nécessaire. Ici, le choix d'absorbeurs appropriés est vital pour une description précise des spectres mesurés. Il est conseillé que l'utilisateur une enquête approfondie dans la littérature les absorbeurs clés qui dominent la gamme de longueurs d'onde et de tissus d'intérêt utilisé dans une étude donnée avant de construire un modèle approprié de biomarqueur optique. Enfin, les sections 3-5 décrivent la manipulation de la souris athymiques lors de l'acquisition du DOS. Pour ne pas perturber la vascularisation locale, utilisez la force douce pour placer la sonde DOS sur la surface de la peau de la souris.

Bien que relativement peu coûteux par rapport aux systèmes de caméra hyperspectrale 3,4, une limitation claire de l'approche DOS décrit est l'utilisation d'une sonde de point pour mesurer la réflectance diffuse. Cette nécessité de la géométrie de réflectance le contact doux avec la peau eta le potentiel d'introduire l'incertitude de mesure en dispersant la vascularisation si une pression constante sonde peau est sans emploi. conceptions futures de la sonde DOS peuvent incorporer un capteur de pression pour maintenir des résultats cohérents. En outre, alors que l'utilisation de près la séparation source-détecteur (<2-3 mm) permet à des profondeurs de sondage optiques spécifiques à la surface de la peau, la spécificité améliorée vient à une perte de résolution spatiale par rapport à l'imagerie hyperspectrale 2D. Pour minimiser cette limitation, un balayage de quadrant 5 points qui capture le volume irradié global a été utilisé. Malgré l'absence de résolution spatiale, les travaux antérieurs chez des souris 5 a montré la capacité des biomarqueurs optiques en moyenne sur une zone clairsemée pour différencier non seulement la peau irradiée et non irradiée , mais aussi l'impact de la peau en épargnant les médicaments interventionnels tels que vasculotide 6.

Il convient de noter que, bien que la conception globale du système peut être modifié pour une peau différente modèles, la forme sous-jacente des spectres de base et de diffusion peuvent avoir besoin d'être optimisé. Plus précisément, alors que oxy- et désoxy-Hb bien décrire un modèle de souris athymiques, l'application du même modèle à la peau plus foncée peut nécessiter l'ajout de mélanine pour un ajustement optimal. En outre, l'extension de la bande passante DOS aux longueurs d'onde supérieures> 950 nm nécessiterait l'ajout d'eau, qui domine à des longueurs d'onde plus élevées. En outre, des modèles animaux avec des épaisseurs différentes de la peau peuvent nécessiter une autre séparation source-détecteur afin d'optimiser la sensibilité de la profondeur. Enfin, la fonction glabre fait des algorithmes plus simples. Bien que les modèles non-glabres peuvent être optimales pour certaines questions de recherche, ils auront besoin d'épilation avant que les mesures DOS, et l'irritation de la peau de ce processus peuvent influer sur les résultats. Pour la recherche où la fonction immunitaire totale est cruciale, une souris sans poils immunocompétent (par exemple, SKH-1) peut servir de meilleur modèle en raison de sa nature euthymique.

ent "> Considérations importantes pour les mesures de la sonde DOS sont compatibles RT et l' estimation de la zone irradiée. Les fluctuations de température peuvent affecter les tissus Hb et Sto 2 niveaux. Mesure d' un groupe de 3 animaux non irradiés à chaque moment de la collecte de données peut servir de base à qui fluctuations environnementales inattendues des valeurs des paramètres peuvent être normalisées. en outre, la zone irradiée peut être difficile à estimer (si les préparatifs des volets de la peau ne sont pas compatibles) avant que des dommages commence à se manifester visuellement autour du jour 5 (40 Gy). Si vous utilisez un marqueur permanent noir les points sur les limites de la peau exposée au rayonnement, d'éviter la consommation d'encre en excès pour empêcher le maculage d'encre, ce qui peut compromettre la lecture.

Une caractéristique supplémentaire de ce système est la possibilité de séparer l'absorption des propriétés de dispersion. Alors que les systèmes d'imagerie hyperspectrale alternatives offrent également la possibilité de surveiller et de concentration oxyHb Hb, la géométrie espace libre d'imagerie hyperspectrale i s incapables de résoudre les changements de diffusion. Cette limitation peut entraîner des imprécisions dans le retourné oxyHb, Hb et Sto 2 paramètres si des changements importants dans la diffusion se produisent en raison de l' érythème (rougeur). En outre, la surveillance des changements de diffusion en utilisant DOS peut fournir des biomarqueurs optiques supplémentaires pour l'évaluation de l'érythème. Comme le montre la figure 6, les premiers résultats de Yohan et al. (2014) indiquent que A et k montrent une tendance temporelle suivante rayonnements ionisants qui ne correspond pas avec les tendances observées à partir d' autres méthodes telles que les systèmes de notation visuelle. Cela indique que les changements de diffusion ne manifestent pas d'une manière visuellement descriptive et peuvent en fait être la description d'un processus biologique séparé. Par conséquent, par rapport à d'autres méthodes, DOS fournit une haute résolution pour les changements de diffusion superficielles, une avenue pour étudier de nouvelles lésions cutanées biomarqueurs qui peuvent être séparés à partir des mesures à base de Hb habituelles.

jove_content "> Bien que notre modèle utilise une seule dose importante de rayonnement (plutôt que plusieurs petites doses fractionnées qui sont utilisés dans le cadre clinique), cette imite la physiopathologie de aiguë radiotoxicité de la peau humaine 21. Il est prévu que , avec une optimisation plus poussée, DOS peut fournir une approche quantitative pour la notation automatisée et standardisée de rayonnement induit des réactions cutanées. Après avoir maîtrisé cette technique, les applications futures peuvent comporter des écarts entre la peau thérapeutique épargnant la surveillance (par exemple, la comparaison des niveaux oxyHb entre un contrôle et le traitement expérimental pour la radioprotection de la peau, ou pour la cicatrisation promotion ). Bien idéal pour criblage à haut débit de la drogue dans des modèles animaux, le système DOS est potentiellement adaptable à l'environnement clinique en raison de la facilité d'utilisation et la capacité de mesurer dans des conditions normales d'éclairage. dans ce cas, la conception de la sonde peut nécessiter des modifications mineures avec un peu plus grandes optode séparations pour tenir compte desl'épaisseur accrue de la peau humaine. Un système DOS clinique permettrait d'évaluation en ligne des thérapies interventionnelles qui pourraient minimiser les réactions cutanées douloureuses et d'améliorer le confort du patient et de la conformité. À l'avenir, il peut être intéressant d'élargir la quantification DOS aux caractéristiques des lésions de la peau induit par rayonnement chronique (par exemple, la fibrose).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nude mice e.g., Charles River Athymic nude Crl:NU(NCr)-Foxn1nu, or immunocompetent nude Crl:SKH1-Hrhr
Small animal irradiator  e.g., Faxitron X-Ray Corp. Faxitron CP160
Animal anaesthesia  If using isoflurane vaporizer machine with induction chamber, need tube and nose cone.
Lead jig and plexiglass stage Custom made If irradiator device exposes whole animal body to radiation, lead shielding must be used to expose only the skin flap.
Medical tape 
Permanent marker/ear puncher
Matlab Mathworks Inc., Natick, MA With StatisticsToolbox 
Labview National Instruments, Vaudreuil-Dorian, QB
DOS system
Optical multiplexer Ocean Optics, Dunedin, FL Model MPM-2000
Spectrometer Ocean Optics, Dunedin, FL Model S200
White light source Ocean Optics, Dunedin, FL Model LS-1
Intralipid-20% Kabi Pharmacia, New York, NY
Reflectance standard INO, Quebec City, QB

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References

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Diffuse Spectroscopie optique pour l&#39;évaluation quantitative de la toxicité de la peau induit par les rayonnements ionisants aiguë Utilisation d&#39;un modèle de souris
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Chin, L., Korpela, E., Kim, A., Yohan, D., Niu, C., Wilson, B. C., Liu, S. K. Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model. J. Vis. Exp. (111), e53573, doi:10.3791/53573 (2016).More

Chin, L., Korpela, E., Kim, A., Yohan, D., Niu, C., Wilson, B. C., Liu, S. K. Diffuse Optical Spectroscopy for the Quantitative Assessment of Acute Ionizing Radiation Induced Skin Toxicity Using a Mouse Model. J. Vis. Exp. (111), e53573, doi:10.3791/53573 (2016).

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