This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.
The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).
Ischemisk hjärtsjukdom (IHD) fortsätter att vara den enskilt största orsaken till sjuklighet och dödlighet för män och kvinnor över hela världen 1. På grund av komplexiteten och inbördes som finns mellan de organ och system på organismnivå, förblir användningen av hela djuret som en modell för IHD relevant inte bara för vår förståelse av sjukdomar patofysiologi, men också tillåter utvärdering av nya preventiva och terapeutiska strategier . Musmodeller, i synnerhet, har bidragit till vår kunskap om hjärt utveckling, patogenes av hjärtinfarkt, hypertrofi, myokardit, och aneurysmatisk skador 2-7. De parametrar som bestämmer hjärtprestanda och är användbara när det gäller prognos och val av terapeutisk intervention är hjärt massa och geometri, global och regional funktion, rumslig fördelning av myocardial blodflöde och myokardviabilitet.
Dock de flesta av traditional prövnings metoder som används i musmodeller av hjärtsjukdom innebär invasiva mätningar som kräver timmar för fullbordande, vilket djuret kan inte användas för upprepade mätningar, eller metoden kräver djuroffer 8-12. Till exempel för att mäta regional myocardial perfusion, radioaktivt eller fluorescerande mikrosfärer används där radioaktivt räkna eller fluorescerande signaler upptäcks på ett fysiskt dissekerade hjärta eller in situ 13,14.
På liknande sätt, utvärdering av infarktstorlek i djurmodeller för hjärtinfarkt är oftast utförs av trifenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning, och för att bestämma tidsförloppet av infarktutveckling och effekten av terapeutiska ingrepp, kräver denna teknik att djuren behöver offras för hjärtat histopatologisk undersökning vid olika tidpunkter 15. Som sådana, icke-förstörande och humana metoder som skulle tillåta quantitative och longitudinell analys av hjärt morfologi, funktion, metabolism och livsduglighet är av största vikt. I detta sammanhang är preklinisk avbildning av stor relevans. Bland de för närvarande tillgängliga avbildningsmetoder magnetisk resonanstomografi (MRT) och ekokardiografi är den vanligaste 16,17,18.
Men, och trots det faktum att MRT anses modalitet referenspunkt i både kliniska och prekliniska arbetet, de höga kostnaderna för att förvärva och bibehålla särskilda små djur MRI system, samt komplexiteten av denna teknik för icke-avancerade användare att använda gör MRI oöverkomligt dyra för rutinmässig användning. Med avseende på ekokardiografi existerar det betydande nackdelar med det sätt hjärtfunktion mäts. De data som produceras av de flesta ekokardiografiska undersökningar är tvådimensionell, och för att härleda volymer, geometriska antaganden måste göras 19. Dessutom, dålig inom och mellan observatör reproducibility är en annan betydande begränsning av denna teknik. Radioisotop avbildning med single-photon emission computed tomography (SPECT) och positronemissionstomografi (PET) är främst används för bedömning av myocardial perfusion och metabolism 17,20,21. Men gör begränsad rumslig upplösning av dessa avbildningsmetoder hjärt avbildning i möss utmanande.
Å andra sidan, med tillkomsten av platt detektorteknologi som möjliggör bättre röntgenkänslighet och snabbare avläsning gånger, nuvarande toppmodern microCT system kan nu erbjuda kardiorespiratorisk gated tredimensionella (3D) och fyrdimensionella ( 4D) bilder av MRI-kvalitet. De är i stort sett underhållskostnader gratis och enkelt att använda icke-avancerade användare. Sålunda kan sådana microCT instrument vara väl lämpad för rutinundersökning av små djur som modeller av human sjukdom. Viktigast av allt, med utvecklingen av en ny preklinisk joderat kontrastmedel, simultaneous funktionell och metabolisk bedömning av hjärtat blev möjligt 22-24.
Denna kontrastmedlet innehåller en hög koncentration av jod (160 mg / ml), som producerar en stark blod-pool kontrast efter dess intravenösa administrering möjliggör in vivo-avbildning av vaskulaturen och hjärtats kammare. Inom en timme efter administrering, kan observeras en kontinuerlig ökning av myokardisk kontrast associerad med dess metaboliska upptag, alltså samma kontrastmedlet kan användas för utvärdering av myokardial bedövning och viabilitet.
Målet med den teknik som beskrivs i detta manuskript är att göra det möjligt för forskare att använda höghastighets microCT system med inneboende kardiorespiratorisk gating, i samband med blod pool joderat kontrastmedel, för att bestämma hjärtmuskel global och regional funktion tillsammans med myocardial perfusion och livskraft hos friska möss och i en hjärtischemi musmodell inducerad genom permanent ocklusionav den vänstra främre nedåtgående kransartären (LAD). Genom att använda denna djurmodell och bildteknik, kan utföras snabbt utvärdering av de viktigaste hjärtparametrar repetitivt med en enda avbildning modalitet och utan behov av invasiva procedurer eller behovet av att offra djuren. Tekniken kan utföras för att utvärdera nya förebyggande och terapeutiska strategier.
MicroCT har under de senaste åren blivit modalitet många undersökningar anses för karakterisering av hjärt struktur och funktion i små djur 26-29,30. Emellertid det instrument som används i den tidigare arbete var antingen specialbyggd eller inte längre är kommersiellt tillgänglig. Som sådan var denna studie syftar till att ge en enkel och omfattande protokoll för användningen av höghastighets microCT system med inneboende kardiorespiratorisk grind att bestämma hjärt global och regional funktion tillsammans med myocardial perfusion och lönsamhet i små djur som modeller för mänskligt hjärta sjukdom.
En av de viktigaste förutsättningarna för att studera hjärt struktur och funktion är skannerns förmåga att redogöra för fysiologiska hjärtrörelser. För detta ändamål, EKG-baserade prospektiva och retrospektiva grindningstekniker kan användas. Men förlitar prospektiv (steg och skjuta) grind på en förutbestämd intervall av hjärtcykeln, för examenpel under diastole, när hjärtat rörelsen är minst. Med detta tillvägagångssätt endast en bild per hjärtcykel erhålls och endast en fas av hjärtcykeln kan rekonstrueras. Som sådan, förutom att vara tidskrävande att generera, prospektivt gated rekonstruktioner producerar bara en datamängd, som berövas funktionell information. Retrospektiv gating, å andra sidan, gör det möjligt för rekonstruktion av flera dataset vid varje parti av hjärtcykeln, så att global och regional vänsterkammar funktionell analys.
Det pågående arbetet användes hjärt- rekonstruktioner med inneboende retrospektiv gating. Intrinsic retrospektiv grind använder egenutvecklade bildbaserad programvara för att rekonstruera slutdiastoliska och slut-systoliskt hjärt faser utan behov av dedikerade andnings- och hjärtövervakningsanordningar 29,31,32. En utmärkt överenskommelse inneboende retrospektiv och yttre EKG-beroende retrospektiv grind för studying hjärtfunktion hos möss och råttor visades av Dinkel et al. 29. Under denna nuvarande arbete, inre retrospektiv grind inte bara avsevärt minimerat den tid som behövs för att ställa in skanningen, men också elimineras beroende av övervakning hårdvara, såsom EKG-avled och andnings pneumatisk givare, samt ytterligare operatörs färdigheter för att korrekt ställa upp.
Efter återuppbyggnaden, var bildkvaliteten hos både slutdiastoliska och slut systoliskt dataset hittades tillfredsställande för hjärt analys. Vid granskning av bilder, ägnades särskild uppmärksamhet till rörelseartefakter som kan uppstå under en otillräcklig anestesi, strimmor artefakter som kan hända till följd av saknade prognoser i djur med hög andningsfrekvens, låg dämpning artefakter som ofta orsakas av benstrukturer och kan härma perfusion, och ring artefakter som kan uppstå från felaktig kalibrering eller fel på en eller flera detektor element.
Förmågan hos microCT att producera hjärt strukturell och funktionell information är också beroende av tillgången på lämplig intravaskulärt kontrastmedel. De flesta för närvarande kommersiellt tillgängliga microCT kontraster kan generellt delas in i partikel icke-metaboliserbara makrofager specifika och polydispersa metaboliserbara jod-baserade kontraster 23,33-36. Även om partikelformiga medel erbjuder större röntgen opacifiering på grund av deras högre atomnummer (barium, Z = 56; och guld, Z = 79), kan de inte användas för metabolisk bedömning. Dessutom är dessa medel betraktas som skadliga för organismen och avlägsnas av levern makrofager (Kupffer-celler), den eliminerande cellerna i det retikuloendoteliala systemet (RES). På grund av deras icke-metaboliserbar natur, dessa medel inducerar förändringar i levern mikro samtidigt med leverskada 37.
Metaboliserbara jodbaserade kontraster, å andra sidan, är inte targeTed för RES-specifika avlägsnande, vilket bör erbjuda bättre säkerhetsprofil och undvika levertoxicitet. Förutom deras bättre säkerhetsprofil, är dessa kontraster tas upp av metaboliskt aktiva vävnader, vilket kan användas för lönsamheten bedömning 22,23. För detta ändamål var joderat kontrastmedel ut för denna studie. Kontrasten administrerades vid en dos av 5 eller 10 | j, l per gram djurets kroppsvikt som en enda intravenös bolusinjektion. Även om båda doserna gett tillfredsställande förbättringsresultat, var en dosberoende ökning av vänster-ventrikulära och myokardiala kontrastnivåer observerades när 10 | il / g av kontrast injicerades. Av intresse, med den större dosen, varaktigheten av blodpoolen var långvarig och toppen av hjärtinfarkt kontrastupptag försenades. Ett djur (mus 1) följdes upp under 10 veckor efter operationen och under denna period är det avbildades varannan vecka. Av erfarenhet, inga negativa effekter i samband med kontrasten (totalt 5 ijections) eller relaterade till röntgenexponering (totalt 10 microCT skannar) observerades i denna mus under övervakningsperioden. En av de vanligaste rapporterade biverkningar av långvarig jod exponering är sköldkörteln störning som inte observerades makroskopiskt på obduktioner. Mannheim et al. Studerade tyroxinnivåer efter 3 kontrast förvaltningar i rad och fann ingen skillnad när nivåerna jämfördes med kontrollerna 37. Med användningen av samma microCT dataset ades inga tecken på strålningsinducerad lungfibros detekteras i detta djur (data ej visade), som överensstämmer säkerheten av förfarandet.
Bedömning av global och regional kammarhjärtfunktion anses vara den starkaste faktorn för hjärtprestanda och betydelse för prognos och val av terapeutisk intervention 38,39. De globala vänstra ventrikulära funktionella index omfattar vänster kammar enddiastolisk volym (LVEDV), vänsterkammarslutslagvolym (LVESV), vänsterkammarslagvolym (LVSV), vänster kammares ejektionsfraktion (LVEF) och hjärtminutvolym (CO). Tidigare microCT studier bekräftade att kvantitativ utvärdering av den globala hjärtfunktion är möjlig i musmodeller hjärt-kärlsjukdom och att uttalad minskning av den globala hjärtfunktion sker strax efter LAD artärocklusion. Dessa upptäckter är i överensstämmelse med tidigare rapporter i det markant minskning i LVSV, LVEF, och CO inträffade redan på dag 1 efter ocklusion 29,40-43. Det är anmärkningsvärt att nämna att hjärt funktionella prestanda är beroende av typen och graden av anestesi, vilket för noggranna mätningar av hjärtfrekvensen under bildtagning bör hållas så fysiologisk som möjligt 44.
Kvantitativ bedömning av vänsterkammar myocardial massa (LVMM) är viktig för utvärdering av vänsterkammarhypertrofi och främst genomförs med hjälp av MRI 11,43,45,46. LVMM ofta korrigeras för kroppsvikt och presenteras som vänsterkammar myocardial mass index (LVMMI) för att möjliggöra normalisering av hjärtvikten bland möss av olika ålder och habitus. Noggrann uppskattning av dessa parametrar är viktigt, eftersom möss med hjärtinfarkt utveckla betydande LV hypertrofi 47. Bedömning av LVMM, LVMMI, och LV geometri är också viktigt för diagnostik av hjärthypertrofi och dysplasi 11. Som sådan kommer bestämningen av dessa parametrar dessutom vara fördelaktigt att skilja tillstånd såsom koncentriska hypertrofi, excentrisk hypertrofi, eller koncentriska ombyggnad. I föreliggande arbete, var båda LVMM och LVMMI värden bestämdes i möss som utsatts för LAD artär ligering och i skenopererade djur. Därefter bestämdes storleken av hjärtinfarkt identifierades och användes för att beräkna den procentuella andelen av infarktstorlek. Även under operationen ligaturen till LAD kransartären var Applied på samma nivå, på ocklusion genereras infarkter med viss variabilitet: 13,3%, 15,8%, och 22,4% (Tabell 1). En möjlig förklaring till denna variation kan härröra från skillnader i kranskärls anatomi och deras territoriella blodtillförsel mellan djuren, och i överensstämmelse med tidigare rapporter 48. Det vanligaste sättet att infarktstorlek bedömning i en musmodell av hjärtinfarkt är av ex vivo trifenyl tetrazoliumklorid (TTC) färgning, den teknik som inte skulle tillåta längsgående övervakning av sjukdomen i samma djur. I samband med tidigare arbeten av al. Ashton et 22 och denna närvarande är det anmärkningsvärt att microCT i samband med joderat kontrastmedel kan ge ett alternativ och icke-förstörande metod för bestämning av infarktstorleken i längdled.
En ytterligare fördel med den microCT tekniken ligger i den mycket noggrann bestämning av regional ischemi. like hos människor den vänstra kransartären hos musen delar sig i en nedåtgående artär (LAD) och en septal gren (LCX). Men i möss, anatomi sido grenar av LAD och LCX skiljer sig avsevärt mellan djur 48. Stora grenar av LCX ibland noga parallellt LAD och eftersom kransartärerna hos möss är inom hjärtinfarkt och därför inte syns, sido hängslen i LCX är ibland misstag men oundvikligen ingår i krans ocklusion under mus-infarkt förfarande. Som sådan, kan circumferentional polära kartan erhålls efter microCT användas för att bestämma exakt vilka kransartärer var tilltäppta, eftersom perfusion och kontrastupptag i sektorer 2, 3, 8 och 9 påverkas av LCX medan sektorer 7, 10, 11, 12 , 13, 15, 16 och 17 tillhandahålls av LAD. Följaktligen är den polära kartan till stor nytta för noggrann bestämning av tilltäppta artärer och därmed hjälper viktigare i den korrekta tolkningen av effekterna av myocardial infarkt av hjärtfunktion och sjukdomsprogression.
Den hjärtinfarkt musmodell användes höggradigt härmar den humana kliniska situation där kranskärlen blir plötsligt tilltäppt på grund av en akut plackbristning och är som sådan till stor nytta för att studera sjukdomen utvecklingen av infarkt hjärtat 49. Även i den utvecklade västvärlden behandling av patienter som lider av hjärtinfarkt riktar sig snabbt återställa recirkulation av kranskärlet, vid många tillfällen, särskilt i mindre ekonomiskt utvecklade länder där förekomsten av hjärtinfarkt ökar snabbt, kan ocklusion inte annulerades i tid 1,50. Detta framkallar i stora kammarinfarkter som oftast leder till kronisk hjärtsvikt och är en enorm börda för folkhälsan. Följaktligen längsgående icke-invasiva diagnostiska metoder med hjälp av en hjärtinfarkt modell med en permanent kranskärls occlusion och en stor kammarinfarkt är av stor betydelse för att utveckla nya behandlingsstrategier mot denna sjukdom.
Myocardial CT perfusion imaging är en snabbt växande teknik som möjliggör kvantitativ bedömning av regionala koronarblodflödes avvikelser och deras relevans för hjärtats funktion och livsduglighet. Nyare små djurstudier minskade gapet mellan microCT och SPECT, modalitet valet för perfusion och livskraft bedömning 22. Med målet att utvärdera graden av regional njurfunktion blodflödet orsakas av LAD kransartärtilltäppning ades microCT uppgifterna utvärderades också för myokardial perfusion information. Det ligerade LAD artären är känt att förse blodtillförseln till den fria väggen, en del av skiljeväggen, och den apikala området av den vänstra ventrikeln. Myocardial perfusion (hypoenhanced områden) från mus 1 visas i ett polärt koordinatsystem och självklart i mitten av främre, mitten inferolateral, mid-anterolateralt, apikalfrämre och apikala sido segment, resultaten överensstämmer med samma krans utgåvan (Figur 3). Ingen skillnad mellan perfusion härrör från slutdiastoliska och slut systoliskt bilder hittades i homosegments. Slut diastoliska och slut-systolisk myocardial perfusion polära kartvisning av skenopererade djur visas i Figur 4. Små skillnader i myocardial blodflöde mellan segmenten i kontrolldjuret är obetydlig på båda slutdiastoliska och slut systoliskt representationer . Intressant nog kan områdena hypoenhancement visuellt sett på kort axiella tvärsektionsbilder (Figur 1) och kan lätt kvantifieras såsom visas i figur 3. Detta var inte möjligt i studien av Befeda et al., Och kan förklaras av större bullret från microCT instrument som används 22. I syfte att visuellt urskilja, måste de signalskillnader vara minst tre till fem gånger störreän buller (standardavvikelse) i bilden 51. Låg ljudnivå av microCT användes i denna studie tillåten detektering av en liten signal skillnad mellan nedsatt och normalt perfusion hjärtmuskeln (127HU ± 23HU vs 217HU ± 29HU), vilket möjliggör framgångsrik bedömning av myokardisk perfusion mönster defekter.
En av de stora fördelarna med att använda joderat kontrastmedel är förmågan att bedöma myokardviabilitet och ämnesomsättning på grund av kontrasten relaterade hjärtmuskelförbättring. Såvitt vi vet, var kontrasten förmåga att förbättra hjärtmuskulaturen som först beskrevs av et al. Detombe 23 och dess första användning för hjärtinfarkt avbildning rapporterades av Ashton et al. 22. Trots att gruppen indikerade att perfunderad hjärtmuskeln i möss med hjärtinfarkt visade förbättring liknar kontrollerna, och att infarkthjärtmuskeln visade ingen förbättring, kvantitativ bedömning av segment myocardial enhancement rapporterades inte. För att ytterligare undersöka om myocardial förbättring kan kvantitativt utvärderas, alla mössen återavbildas användning av samma avbildning protokoll 3 – 4 timmar efter kontrast administration, när myocardial förbättring i förhållande till håligheten var maximal.
Myocardial kontrast upptagnings defekter observerades visuellt på kort axiell ände-diastoliska och slut-systolisk tvärsnitt bilder av en mus hjärta med hjärtinfarkt (Figur 5), men inte i den skenopererade djur (Figur 6). Myocardial upptag kvantitativt utvärderas i varje myocardial segment från både slut diastoliska och slut systoliskt rekonstruktioner och presenteras i ett polärt koordinatsystem (figur 7 och 8). De slutdiastoliska och slutsystoliska homosegmental värden erhållna från samma djur var inte annorlunda. Men de perifera polära tomter visade segmentsspecifika avvikelser (Figure 7) med liknande mönster som de som visas på myokardisk perfusion kartor (Figur 2). Inga kontrastupptagnings defekter sågs på omkrets polära tomter av skenopererade mus (Figur 8). De hjärtupptagningsdata var av tillräcklig kvalitet för att utföra globala funktionsanalys och kvantitativ bedömning av LV hjärtmuskelmassan och infarktstorlek (ej visad). Även om det inte är relevant för den aktuella använda modellen med permanent LAD kranskärls ocklusion, tror vi att kontrasten myocardial extraktion kan relateras inte bara till förändringar i regional myocardial blodflöde, men också till status av hjärtmuskelceller (t.ex. ärrade, bedövas och ide myokardium) . För att testa denna hypotes, kommer det framtida arbetet använda modellen med tillfällig myokardischemi och reperfusion.
Aktiv sammandragning av hjärtmuskeln resulterar i hjärtinfarkt väggrörelse och förtjockning som är viktiga markörer för systoliskt fsmörjelse och myokardviabilitet. Bedömning av regional väggrörelse, förtjockning, och ejektionsfraktion hjälper till att urskilja passiva systoliska vägg rörelse från aktiv myocardial kontraktion. För att möjliggöra standardiserad kvantifiering av omfattningen och svårighetsgraden av skadan, väggrörelse, vägg förtjockning och regionala fraktioner utstötnings vanligen avbildas i polära kartor. Avvikelser i regional ventrikulära väggen rörelse är viktiga markörer för myokardischemi som oftast bedöms av MRI 52. De LV väggrörelse, förtjocknings-och regional Ejektionsfraktionen poängen för varje segment av en mus med och utan hjärtinfarkt presenteras i figur 9 och figur 10. Såsom förväntades, LAD kransartärligering resulterade i markerad minskning av LV regionala funktionella indexen ( figur 9), medan ingen effekt observerades i skenopererade mus (figur 10). Dessa resultat är i överensstämmelse medtidigare rapporterade data.
Sammanfattningsvis har detta arbete visat den första framgångsrika användningen av en höghastighets microCT system för omfattande bestämning av hjärt globala och regionala funktionella parametrar samt bedömning av myocardial perfusion och livskraft i friska och i en musmodell av hjärtinfarkt. Detta arbete kan förlängas ytterligare mot karakterisering av andra modeller av hjärt-kärlsjukdom, vilket möjliggör noggrann och icke-förstörande utvärdering av hjärt funktionella och patofysiologiska förändringar, och för utvärdering av nya preventiva och terapeutiska strategier.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Stichting Lijf en Leven, projekt utvidga kontra stenoserande arteriell sjukdom.
Quantum FX MicroCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA | Micro Computed Tomography System | |
XGI-8 Anesthesia System | PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA | Cat. No. 118918 | Gas Anesthesia System |
Analyze 12.0 Software | Analyze Direct, Overland Park, KS, USA | Visualization and Analysis Software for Imaging | |
eXIA160 MicroCT Contrast | Binitio Biomedical, Ottawa, ON, CANADA | Cat. No. eXIA160-01; eXIA160-02; eXIA160-03; eXIA160-04; eXIA160-05 | Iodine based Radiocontrast for MicroCT Imaging |
Isoflurane | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands |
Cat. No. 45.112.110 | inhalation anesthesia |
1/2CC U-100 28G1/2 Insulin Syringe | Becton Dickinson and Company, USA |
Cat. No. 329461 | Insulin syringes with sterile interior |
Leica microscope type M80 | Leica Microsystems BV, Eindhoven, Netherlands | Stereo zoom microscope |