Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Ex Vivo optogenetic Dissektion af Frygt Kredsløb i Brain Skiver

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

Optogenetic tilgange er meget udbredt til at manipulere neurale aktivitet og vurdere konsekvenserne for hjernens funktion. Her er en teknik, skitseret, at ved in vivo-ekspression af det optiske aktivator Channelrhodopsin, giver mulighed for ex vivo analyse af synaptiske egenskaber af særlig lang rækkevidde og lokale neurale forbindelser i frygt-relaterede kredsløb.

Abstract

Optogenetic tilgange nu almindeligt anvendt til at studere funktionen af ​​neurale populationer og kredsløb ved at kombinere målrettet ekspression af lysaktiveret proteiner og efterfølgende manipulation af neurale aktivitet af lys. Channelrhodopsins (Chrs) er lys-gatede kationer kanaler og når fusioneret til et fluorescerende protein deres ekspression muliggør visualisering og samtidig aktivering af specifikke celletyper og deres axonale projektioner i definerede områder af hjernen. Via stereotaktisk injektion af virale vektorer, kan CHR fusionsproteiner konstitutivt eller betinget udtrykt i specifikke celler af et defineret område af hjernen, og deres axonale projektioner kan efterfølgende undersøges anatomisk og funktionelt via ex vivo optogenetic aktivering i hjernen skiver. Dette er af særlig betydning, når der sigtes for at forstå synaptiske egenskaber forbindelser, der ikke kunne løses med konventionelle elektrisk stimulering tilgange, eller at identificere roman affehusleje og efferente tilslutningsmuligheder, der tidligere var dårligt forstået. Her, et par eksempler viser, hvordan denne teknik kan anvendes til at undersøge disse spørgsmål til belysning af frygt-relaterede kredsløb i amygdala. Amygdala er en vigtig region for erhvervelse og udtryk for frygt, og opbevaring af frygt og følelsesmæssige erindringer. Mange linjer af beviser tyder på, at den mediale præfrontale cortex (mPFC) deltager i forskellige aspekter af frygt erhvervelse og udslettelse, men dets præcise tilslutningsmuligheder med amygdala er lige begyndt at blive forstået. Først er det vist, hvorledes ex vivo optogenetic aktivering kan anvendes til at undersøge aspekter af synaptisk kommunikation mellem mPFC afferenter og målceller i den basolaterale amygdala (BLA). Endvidere er det vist, hvorledes denne ex vivo optogenetic metode kan anvendes til at vurdere nye tilslutningsmuligheder mønstre ved hjælp en gruppe af GABAerge neuroner i amygdala, den paracapsular indskudte celle klynge (mpITC), som et eksempel.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Præcise værktøjer til visualisering og samtidig aktivering af specifikke forbindelser mellem hjernens områder og specifikke typer af neuroner bliver mere og mere vigtigt at forstå de funktionelle tilslutningsmuligheder underliggende sunde hjernens funktion og sygdomstilstande. Ideelt set medfører dette fysiologiske undersøgelse af præcise synaptiske egenskaber, som identificerede neuroner kommunikere. Dette gælder især for forbindelser mellem hjerneområder, der ikke kan opbevares i en enkelt akut hjerne skive. I fortiden, er dette i høj grad opnået i separate forsøg. På den ene side, injiceret neurale sporstoffer in vivo er blevet anvendt i kombination med efterfølgende lys eller elektronmikroskopisk analyse af præ- og postsynaptiske partnere. På den anden side, når fiber skrifter fra hjemregionen bevares og tilgængelige i skive forberedelse, elektrisk stimulering blevet anvendt til at vurdere synaptiske kommunikationsmekanismer med celler i målområdet.

Med fremkomsten af optogenetics, den målrettede ekspression af lys-gatede kationer kanaler, såsom Channelrhodopsins (Chrs) fusioneret til fluorescerende proteiner, nu muliggør aktivering af neuroner og deres axonale baner samtidig med at deres visualisering og post-hoc anatomisk analyse 1- fire. Fordi CHR-udtrykkende axoner kan stimuleres, selv når adskilt fra forældre somata 5, er det muligt i hjernen skiver til: 1) at vurdere input fra hjerneområder, der ikke var tilgængelige med konventionel elektrisk stimulering, da fiber skrifter ikke kan adskilles eller den særlige bane er ikke kendt; 2) entydigt identificere oprindelsesområdet for specifikke input, der blev postuleret, men ufuldstændigt forstået; og 3) at undersøge den funktionelle forbindelse mellem definerede celletyper, både lokalt og i langtrækkende fremskrivninger. På grund af en række fordele, har denne optogenetic kortlægning af kredsløb i hjernen skiver bliver bredly anvendt i de sidste år, og en række virale vektorer til ekspression af fluorescens-mærkede Chrs er let tilgængelige fra kommercielle leverandører. Nogle af de vigtigste fordele ved optogenetic aktivering i forhold til konventionel elektrisk stimulation er ingen skader på vævet på grund af placering af stimulation elektroder, specificitet fiber stimulation fordi elektrisk stimulation også kan rekruttere fibre af passage eller andre nærliggende celler, og en lige så hurtig og tidsligt præcis stimulation. Desuden kan stereotaktisk injektion af virale vektorer let målrettes til specifikke hjerneområder 6 og betinget eller celletypespecifik ekspression kan opnås ved anvendelse Cre-afhængig ekspression og / eller specifikke promotorer 7. Her er denne teknik anvendes til kortlægning af langtrækkende og lokale kredsløb i frygt systemet.

Amygdala er en vigtig region for erhvervelse og udtryk for frygt, og opbevaring af frygt og følelsesmæssige erindringer 8,9. Bortset from amygdala, den mediale præfrontale cortex (mPFC) og hippocampus (HC), strukturer, der er gensidigt forbundet med amygdala, er impliceret i aspekter af erhvervelse, konsolidering og genfinding af frygt og udryddelse erindringer 10,11. Aktivitet i underopdelinger af mPFC synes at spille en dobbelt rolle i at kontrollere både høj og lav frygt hedder 12,13. Dette kunne til dels være medieret af direkte forbindelser fra mPFC til amygdala, som ville styre amygdala aktivitet og output. Derfor, i de seneste år, flere undersøgelser startede i ex vivo slice eksperimenter for at undersøge synaptiske interaktioner mellem mPFC afferente og specifikke målceller i amygdala 14-17.

Under frygt læring, sensorisk information om betinget og ubetinget stimuli når amygdala via fremskrivninger fra bestemte thalamiske og kortikale regioner. Plasticitet disse indgange til neuroner i den laterale del (LA) i basolateral amygdala (BLA) er en vigtig mekanisme underliggende frygt condition 9,18. Stigende tyder på, at parallelle plastik processer i amygdala involverer hæmmende elementer til at styre frygt hukommelse 19. En gruppe af klynger hæmmende neuroner er de GABAerge mediale paracapsular indskudt celler (mpITCs), men deres præcise tilslutning og funktion er ufuldstændigt forstået 20-22. Her er optogenetic kredsløb mapping anvendes til at vurdere afferente og efferente konnektivitet af disse celler og deres indvirkning på mål neuroner i amygdala, hvilket viser, at mpITCs modtager direkte sensorisk input fra thalamiske og kortikale relæstationer 23. Specifikt udtryk for CHR i mpITCs eller BLA neuroner tillader kortlægning af lokale interaktioner, der afslører, at mpITCs hæmmer, men er også indbyrdes aktiveret af, BLA vigtigste neuroner, placere dem i nye feed-forward og feedback hæmmende kredsløb, der effektivt styrer BLA aktivitet23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik erklæring: Alle eksperimentelle procedurer var i overensstemmelse med EU-direktivet om anvendelse af dyr til forskning og blev godkendt af den lokale Animal Care og brug Udvalg (Regierungspräsidium Tübingen, delstat Baden-Württemberg, Tyskland) med ansvar for universitetet i Tübingen.

1. stereotaktisk injektion Procedure

  1. Forbered sterile værktøjer (saks, skalpel, klemmer, bore, nåle, suturmateriale) ved hjælp af en sterilisator. Arrangere sterile redskaber og andre nødvendige løsninger og kirurgi forsyninger såsom sterile bomuld swaps, desinfektionsmiddel, steril phosphatbufret saltvand (PBS, pH 7,4), og H 2 O 2 på en steril kirurgisk afdækningsstykke.
  2. Træk glas mikropipetter til injektioner (Figur 1A, indsat) under anvendelse af en 3 mm bred filament boks på en vandret mikroelektrode aftrækker ifølge producentens anvisninger.
    Bemærk: For dybe injektioner, bør elektroden taper være tilstrækkeligtlang tid at nå de ventrale fleste koordinater (ca. 5 mm. for koordinater, se 1.10).
  3. Premix 1 pi virus løsning og 0,2 pi 0,1% hurtigt grøn løsning i sterilt PBS (for bedre synlighed af løsning i glasset pipette). Fyld glaspipetter med blanding af virus-opløsning og fast green anvendelse af en mikroliter pipette med fin spids (Figur 1A, indsat).
    Bemærk: At arbejde med rekombinante adenoassocierede virale vektorer (rAAV) betragtes biosikkerhed niveau 1 (BSL 1) arbejde og skal udføres i en BSL 1 laboratorium. rAAVs anvendt i denne undersøgelse (figur 1C) var: 1) mPFC: rAAV-hSyn-CHR2 (H134R) -eYFP (serotype 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-CHR2 (H134R) -mCherry (serotype 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotype 2/1) 23
  4. Bedøver en mus under anvendelse af et lille dyr anæstesiapparat (Isofluran: 3% i oxygen til induktion).
    Bemærk: Mus anvendt i denne undersøgelse var 4 -7 uger gamle og af følgende stammer og genotyper: C57BL6 / J vildtype (eksperiment i figur 2A og 3A-D); GAD67-GFP 24 (eksperiment i figur 2B og 3E-H); Tac2-Cre 25 (eksperiment i figur 2C og 3I-J).
  5. Shave hoved mellem ører og øjne. Anvend desinfektionsmiddel (providon-jod baseret) til barberet hoved ved hjælp vatpinde.
  6. Påfør et øje salve for at forhindre udtørring af øjne under bedøvelse. Subkutant injicere mus med analgetiske (meloxicam-baseret, 0,1 ml 5 mg / ml opløsning).
  7. Placer musen i stereotaktisk ramme (figur 1A) og opretholde anæstesi via en gas anæstesi masken (Isofluran: 2% i oxygen til vedligeholdelse). Check anæstesi dybde ved hjælp tilbagetrækning lemmer refleks, før du fortsætter.
    Bemærk: Oprethold sterile forhold så godt som muligt under hele kirurgiske procedure; slid engangs ansigtsmaske, kirurgisk gown, og handsker.
  8. Gør huden indsnit på toppen af ​​hovedet med en saks. Træk forsigtigt huden til siden ved hjælp af stumpe pincet, fix med klemmer til at eksponere kraniet overflade, og ren kranium med H 2 O 2.
  9. Mark injektionssteder på kraniet ved en fin spids permanente markør og bore huller for begge halvkugler (Figur 1B). Koordinater til injektioner i denne undersøgelse er (fra Bregma (mm)): mPFC: anterior 1.9, lateral ± 0,3, ventral 2.1; MGM / PIN: posterior 3,0, lateral ± 1,8, ventral 3,8; mpITC / BLA: posterior 1.45, lateral ± 3,35, og ventral 4,75.
  10. Mount fyldt glaspipette på stereotaktisk ramme forbundet til et tryk injektionsanordning og bringe pipetten til Bregma position.
  11. Bræk spidsen af ​​glaspipette hjælp fine straight-tip pincet. Gør dette forsigtigt for at forhindre aerosol generation af virus løsning. Sørg for, at pipettespids er åben ved at anvende et par tryk pulser og observere ekstrudering af dråber af Virus opløsning.
  12. Gå til den ønskede injektion koordinater og injicere halvdelen af ​​pipetten indhold (~ 0,5 ul) ved hjælp af følgende indstillinger på tryk indsprøjtning enhed: Tryk: 20 psi, gennemsnitlig puls længde: 30 ms, gennemsnitlige antal impulser: 50.
  13. Efterlad pipette på plads til ~ 1 min før langsomt (1 mm / min) tilbagetrækning den.
    Bemærk: Sørg for pipette ikke er blokeret, før du gentager proceduren med samme pipette på anden halvkugle. I tilfælde af blokerede spids, ren eller brække spidsen og nul pipette stilling ved Bregma igen.
  14. Clean kraniet med PBS (pH 7,4), fjerne klemmer, træk forsigtigt huden sammen, og sutur snittet med individuel knap sutur (3 - 4 knob). Påfør desinfektionsmiddel (providon-iod baseret) omkring såret.
  15. Stop anæstesi og ikke forlader musen uden opsyn, indtil det er helt vågen. Hold enkelt huses eller vende tilbage til selskab af andre dyr, når fuldt tilbagebetalt. Postoperativt, fortsat overvåge sundhedstilstanden, og administraanalgetisk ter om nødvendigt. Følg procedurerne i henhold til regler, fremsat af den lokale Animal Care og brug Udvalg.

2. Fremstilling af Akutte Skiver

  1. Forbered ACSF, opskæring opløsning, værktøjer (saks, skalpel, pincet, spatel, Pasteur pipette), og agar blokke.
    Bemærk: 1 l kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) er påkrævet per eksperiment, og fremstilles ved at opløse kemikalier i dobbelt-destilleret H2O som tidligere offentliggjort 16,23. Skæring opløsning fremstilles ved at supplere 200 ml ACSF med 0,87 ml 2 M MgSO4 stamopløsning.
  2. Oxygenat ACSF og skæring opløsning under hele forsøget med 95% O2 og 5% CO2.
  3. Dybt bedøver musen med en lille dyr anæstesi maskine ved hjælp af isofluran (3% i ilt). Check anæstesi dybde ved hjælp tilbagetrækning lemmer refleks, før du fortsætter.
  4. Halshugge musen ved hjælp af store saks og straks chillhovedet i iskold skæring løsning.
  5. Åbn kraniet af en enkelt midtlinjeincision fra kaudalt for rostralt og skub forsigtigt stykker af kraniet til siderne ved hjælp af pincet. Hurtigt fjerne hjerne ved forsigtigt at løfte det ud af kraniet ved en lille afrundet spatel. Skær lillehjernen med skalpel. Placer hjerne i iskold skæring løsning.
  6. For mPFC injektionssteder: afskåret forreste del af hjernen (indeholdende mPFC) ved hjælp af en skalpel og sat i iskold skæring løsning indtil udskæring.
  7. Fjern overskydende skæring løsning med et filter papir og lim den bageste del af hjernen på vibratome scenen.
  8. For skrå amygdala skiver, lim hjernen på en agar blok (4%) snit ved en 35 ° vinkel (figur 1 D, midten). For koronale amygdala skiver, MGM / PIN injektionssteder og mPFC injektionssteder, lim hjernen direkte på scenen (figur 1D, venstre og højre). Placer en ekstra agar blok bag hjerne for stabilitet, mens udskæring.
  9. place fase i skærekammeret med iskold oxygeneret skæring løsning, der holdes ved 4 ° C under anvendelse af en køleenhed. Forbered akutte skiver af amygdala (320 um) ved anvendelse af en safir klinge. Placer skiver i en grænseflade kammer forsynes med oxygeneret ACSF ved stuetemperatur.
  10. Efter fremstilling af akutte amygdala skiver, placere grænsefladekammer i vandbad ved 36 ° C for at inddrive skiver i 35 - 45 min. Efterfølgende returnere grænsefladekammer til stuetemperatur. Til optagelse af disse skiver, fortsæt med trin 3.2.
  11. Under påbegyndelsen af ​​trin 2.10, skæres skiver af injektionsstedet, som beskrevet før for akutte amygdala skiver (trin 2,8-2,9). Inddrivelse af skiver i vandbadet er ikke påkrævet her. Valgfrit: Hvis du hurtigt estimere injektionsstedet placering, observere skiver på en Stereoskopet udstyret med et lysstofrør og passende filtersæt.
  12. Fix skiver indeholdende injektionssteder for post-hoc analyse af sandwich dem mellem to filter papirer og submerging dem i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS-opløsning O / N. Til analyse af injektionssteder Fortsæt med trin 4.1.

3. Visualisering og Stimulering af Præsynaptiske Fibers

  1. Forbered patch mikroskop for optogenetic aktivering af fibre og celler:
    1. Centrere monterede lysdiode (LED) på lyset levering pathway.
    2. Mål LED lysintensitet på bagsiden brændplanet og på udgangen af ​​hvert mål med en effektmåler vælge den passende bølgelængde 470 nm.
    3. Beregn lysintensiteten i mW / mm2 og skabe en kalibreringskurve (LED intensitet (%) versus lyseffekt (mW / mm2)) for hvert mål for værdier målt for 470 nm bølgelængde.
  2. Hent en akut amygdala skive fra grænsefladen kammer og plads i skive kammer monteret på opretstående mikroskop udstyret med et lysstofrør. Sørge for at placere skive, således at SLICe overflade vender opad i grænsefladen kammer også vender opad i optagelsen kammer. Perfundere skive med frisk, oxygeneret ASCF med en hastighed af 1 - 2 ml / min ved en temperatur på ~ 31 ° C.
  3. Observere præsynaptiske fibre i skive ved hjælp af lysstofrør i kombination med passende filtersæt for det specifikke fluorescerende protein udtrykkes. Brug 5x mål at få overblik (figur 1E), og 60x mål for vurdering af fiber tæthed i målområdet.
    Bemærk: For GFP og YFP, bruge Filter sæt "grønne" (Excitation 472/20, beamsplitteren 495, Emission 490 LP) for mCherry bruge filter sæt "røde" (Excitation 560/40, beamsplitteren 585, Emission 630/70) som specificeret i materialer / udstyr tabellen.
  4. Åbne eller begrænse åbningen i mikroskop lys pathway som ønsket til forsøget (figur 2D).
  5. For at opnå en patch optagelse, udfylde en patch pipette med intern løsning, og montere in elektrode holder. Påfør positivt tryk til patch-pipetten og langsomt sænke det først i badopløsningen og derefter under visuel kontrol ind i udsnit ved hjælp af mikromanipulator.
    1. Tilgang neuron af interesse med patch pipette fra siden og toppen. Slip positivt tryk, når pipetten er på overfladen af ​​cellen (dimple synlig på celleoverfladen) og opnå en "gigaseal" ved at påføre negativt tryk.
    2. Påfør yderligere sugning til at sprænge membranen patch til opnåelse helcelle-optagelse. Efterfølgende stimulere mærkede fibre med den tilsluttede LED ved hjælp af den passende bølgelængde til aktivering CHR (470 nm), mens du optager elektriske svar fra cellen.
    3. For synaptisk stimulering begynde med en lav LED intensitet og stige indtil den ønskede synaptiske strømamplitude er nået. Trigger LED ved at konfigurere digitale udgange i datafangst software til at styre tidspunktet og puls længde (eksempler i figur3).
      Bemærk: andet software og / eller TTL-genererende enheder kan bruges til at udløse LED.
  6. Gentag stimulering med åbnet eller begrænsede åbning (trin 3.4) i mikroskopet lys vej som ønsket til den næste optaget celle og / eller i nærværelse af specifikke lægemidler.
  7. Efter optagelsen fastsætte skiver for post-hoc analyse af sandwich dem mellem to filter papirer og nedsænke dem i 4% PFA O / N.
  8. Analyser elektrofysiologiske data.
    Bemærk: Brug passende software til at visualisere optagede sweep data for hver enkelt stimulation offline. Når man analyserer effekter af narkotika, brug peak afsløring rutiner for at opnå tidsforløbet for narkotika effekt på synaptiske strømamplituder for alle individuelle sweeps. Bestem når lægemidlet effekt når steady state. For at forberede repræsentative gennemsnitlige svar for tal, bruge software til de gennemsnitlige ≥10 individuelle fejer pr eksperimentel tilstand (jf figur 3B-D, FH, J højre panel).
    Bemærk: flere alternative softwarepakker kan anvendes til dataanalyse.

4. Post-hoc analyse af injektionssteder

  1. Vask skiver af injektionssteder (fra trin 2.12) og optagelse sites (hvis der ønskes re-imaging, fra trin 3.7) tre gange i PBS. Dette gøres ved gentagne gange at erstatte opløsning med frisk PBS på en roterende rysteapparat tre gange i 10 min.
  2. Forbered 2% agar-agar løsning i PBS, og lad det køle ned til ~ 65 ° C. Placer skiver fladt på bunden af ​​en lille 30 mm petri diameter parabol, integrere skiver i agar-agar og lad den køle ned, indtil fast.
  3. Lim en agar blok med indlejret skive eller skiver til den fase af en vibratome og placere scenen i at skære kammer med PBS.
  4. Resektion indlejrede skiver til 70 um tykkelse. Valgfrit: Efter resektion, kan skiver farves, dvs. med Neurotrace at afsløre cytoarchitecture (figur 3A, C), og / eller by immunofluorescens farvning for YFP eller mCherry at forstærke signalet fra CHR fusionsproteinet.
  5. Mount skiver på dias og dækglas med montering medier. Billede injektionssteder og om ønsket, også billedudsnit indeholdende fibre i projektion områder ved hjælp et fluorescensmikroskop eller et konfokalt laser-scanning-mikroskop (Figur 2A-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dette afsnit viser arbejdsgangen af en ex vivo optogenetic tilgang og repræsentative resultater fra forskellige eksperimentelle strategier til at undersøge de fysiologiske egenskaber af sensoriske og modulerende langtrækkende fremskrivninger til BLA og mpITC neuroner samt egenskaber for lokal forbindelse mellem mpITC og BLA.

Efter stereotaktisk injektion af den valgte virusvektor på de ønskede koordinater i musen hjernen (figur 1A-C, viral ekspressionstiden 2 - 6 uger, afhængig af eksperimentet), akut hjerne skiver af injektionsstederne og projektions områder i amygdala fremstilles på et passende vinkel for patch-clamp-forsøg og fra den injicerede hjerne region for post-hoc analyse af injektionssteder (figur 1D). Før du starter optagelser og den optogenetic stimulation, fluorescensmærkede celler eller axonal profremskrivninger i målområdet (amygdala), bør kontrolleres på opretstående mikroskop for patch-clamp optagelser ved hjælp af vedlagte lysstofrør (figur 1E). Ved opnåelse af en patch-clamp optagelse fra en formodet target celle i fremskrivningen region af skive, er lys stimulation indledes, mens tidspunkt, interval, og puls længde styres via patch software, der udløser lysdiode (LED). Afhængigt af den eksperimentelle strategi (figur 2A-C, højre) åbningen i fluorescerende lysabsorptionsstrækningen enten helt åbnet eller begrænset (figur 2D). Samtidig med at impulslængden konstant og så kort som mulig (ideelt ≤1 ms), er LED output intensitet langsomt øget til vurdere, hvilke intensitet er nødvendig for at opnå den ønskede amplitude af den synaptiske respons i et bestemt eksperiment (Figur 2E). Efter optagelsen amygdala skiver er post-fikseret. Efter resektion og valgfritfarvning, injektion og optagelse steder er afbildet på en konfokal mikroskop for at kontrollere indsprøjtning placering og udelukke data fra malplacerede injektioner. Billeder af injektionssteder og de ​​tilknyttede aksonal fremskrivninger i amygdala for de tre eksperimentelle strategier (mPFC input til BLA, thalamiske indgange til mpITCs og lokal mpITC aktivering) er vist i figur 2A-C.

Figur 3 viser repræsentative registrering af resultater opnået fra BLA vigtigste neuroner, lokale BLA interneuroner og mpITC neuroner illustrerer egenskaberne af lys-fremkaldte reaktioner for de forskellige eksperimentelle strategier, der anvendes (figur 3A, E, I). For at målrette GABAerge neuroner (lokale interneuroner og mpITCs) til optagelse, var GAD67-GFP reporter mus anvendt 24. For mPFC og sensoriske thalamiske fremskrivninger, kan flere aspekter af synaptisk transmission undersøges. Den tidsmæssige præcision activationen og de kinetiske egenskaber af Chrs anvendt i denne undersøgelse muliggøre pålidelig stimulering med parrede pulser ved en inter-stimulus-interval på 50 msek. Dette giver mulighed for analyse af parrede-puls forhold (PPR) af postsynaptiske strømme (PSC), som enten kan være lette eller deprimerende afhængigt projektion og målcelletype, og tjener som indikatorer for frigivelse sandsynlighed præsynaptiske (figur 3B, F, H) . Derudover analyse af synaptiske latenstider muliggør dissektion af forskellige postsynaptiske respons komponenter.

I dette eksempel længere latenstider af den inhibitoriske PSC (IPSC) versus excitatorisk PSC (EPSC) komponent indikerer en disynaptic og monosynaptisk input, henholdsvis (figur 3C). I andre tilfælde kan være behov for en mere grundig analyse af yderligere EPSC egenskaber som reaktion jitter eller koefficienten af ​​varians af respons størrelse at drage konklusioner om dens mono- eller disynaptic natur 17,23. Endvidere kan anvendelsen af farmakologiske blokkere for specifikke receptorer kendskab til arten af PSC (dvs. glutamaterge EPSC og GABAerge IPSC, figur 3C-D). Som forventet, den tidlige del af mPFC input var glutamaterge, mens den sene komponent var GABAerge. Den komplette blok af både EPSC og IPSC med glutamatreceptorblokeringsmiddel CNQX understøtter endvidere, at IPSC er disynaptic. Til undersøgelse modulering af synaptisk transmission ved optogenetically aktiverede fibre, kan virkningerne af agonister og antagonister til metabotrope receptorer (her GABAB-receptorer) på amplitude og PPR vurderes for at evaluere indflydelser på præ- og postsynaptiske steder. I dette eksempel er den ledsagende fald af amplitude med en stigning i PPR indikerer en præsynaptisk modulation af lys-aktiverede fibre (3G, H). Endelig kan de lokale interaktioner af celler i amygdala vurderes, for eksempel,når mus, der udtrykker Cre under kontrol af Tac2 promotoren 25 injiceres med en dobbelt-floxet CHR udtrykkende viral vektor (figur 1C). Fordi Tac2 og dermed er CHR udtrykt i mpITC og centrale amygdala (figur 2C), blev let aktivering begrænset til mpITC ved at lukke fluorescerende lys stien blænde (figur 2D). Under disse betingelser, kan lys-fremkaldte aktionspotentialer fremkaldes i inficerede mpITCs. Korte ventetid hæmmende synaptiske reaktioner i BLA indikerer tilstedeværelsen af ​​en funktionel hæmmende forbindelse mellem mpITC og BLA vigtigste neuroner.

figur 1
Figur 1. stereotaktisk Injektioner, Udarbejdelse af akut Brain Skiver, og visualisering af Præsynaptiske Fibers. (A, B) Stereotaktisk virus injektion. A) Billede af bedøvede mus placeret i en stereotaktisk ramme med kraniet udsatte oginjektion pipette. Indsat: Zoom ind billede af injektion pipette fyldt med virus løsning blandet med hurtig grøn. Målestok: 3 mm. (B) Skematisk af en mus kranium med markante holdninger bore huller til forskellige injektion områder. (C) Scheme viser forskellige virale konstruktioner anvendt i denne undersøgelse. Mørk grå: promotorsekvens; blå: Channelrhodopsin2 (CHR2 (H134R)); grøn / rød: fluorescerende protein. Expression tid var 2 uger til lokale amygdala fremskrivninger og 4 - 6 uger for fremskrivninger fra mPFC og MGM / PIN-kode. (D) Udarbejdelse af akutte hjernen skiver: Ordning viser placering af musehjerne på slicer scenen for at opnå skiver fra forskellige indsprøjtning og projektion områder. (E) Visualisering af fibre i akutte hjernen skiver fra en GAD67-GFP mus injiceret med CHR2-mCherry virus i MGM / PIN-kode. Billeder er taget på opretstående patch mikroskop med forskellige filtersæt: GAD67-GFP udtryk, mellemledere; MGM / PIN fibre mærket med mCHerry, højre. Målestok: 200 um. mPFC, mediale præfrontale cortex; mpITC, mediale paracapsular indskudte celler; BLA, basolaterale amygdala; MGM, mediale geniculate kerne, mediale del; PIN-kode, posterior intralaminære thalamus kerne; LA, lateral amygdala; BA, basal amygdala; CEA, central kerne af amygdala. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. injektionssteder, projektion områder og optogenetic Stimulering af axon Fremskrivninger. (AC) Konfokal billeder af repræsentative injektionssteder og projektion områder i BLA, og ordninger for de eksperimentelle strategier. (A) Venstre: mPFC injektionsstedet i en C57BL / 6 mus farvet med Neurotrace. Målestok:500 um. I midten: tilsvarende fremskrivninger i BLA i skrå amygdala skive. Målestok: 200 um. Til højre: Skematisk af hele området belysning af mPFC fremskrivninger og registrering af neuron i BLA. (B) Venstre: MGM / PIN injektionsstedet i et GAD67-GFP mus. Målestok: 500 um. I midten: Tilsvarende fremskrivninger i mpITC og LA i en koronal amygdala skive. Målestok: 200 um. Til højre: Skematisk af hele området belysning af MGM / PIN fremskrivninger og registrering af en mpITC neuron. (C) Venstre: Lokal udtryk for CHR2-YFP i en Neurotrace farves amygdala skive af en Tac2-Cre mus. Målestok: 200 um. Indsat: Zoom ind af mpITCs udtrykker CHR2-YFP. Scale bar: 20 pm. Til højre: Skematisk af begrænset belysning af mpITC klynge og optagelse af en BLA neuron. (D) Billeder optage kammer under lys levering og billede af neuroner i akutte hjernen skiver (mpITC klynge) i et GAD67-GFP mus med åben og begrænset apertur. Målestok: 30 um. (E) Stimulerende postsynaptiske strømme (EPSCs) fremkaldt af forskellige LED intensiteter (øverst) og plot af lys magt versus fremkaldt EPSC amplitude (nederst) fra et repræsentativt mpITC neuron på optogenetic aktivering af fibre fra MGM / PIN. Scale bar: 100 pA / 10 msek.
Bemærk:. Figur 2A er modificeret fra henvisning # 16 og figur 2C fra henvisning # 23 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Eksempler på resultater fra optogenetic Aktivering af Long Range og Lokale Fremskrivninger. (A) ordningen for eksperimentel strategi for (BD). (B) Repræsentative EPSCs optaget fra en BLA principal neuron ogBLA interneuron på optogenetic parret-puls stimulation (50 msek inter-stimulus-interval) af fibre fra mPFC fremkalde parret puls facilitering og parret puls depression, hhv. Scale bar: 100 pA / 25 msek. (C) optogenetic aktivering af fibre fra mPFC fremkalder feed-forward inhibering. Venstre: Repræsentativ EPSC (ved -70 mV) og hæmmende postsynaptiske strøm (IPSC, ved 0 mV) i en BLA principal neuron. IPSC har en længere synaptisk latens sammenlignet med EPSC. Scale barer: 200 PA / 10 msek og 200 Pa / 2 ms. Højre: Lys fremkaldte tofaset EPSC / IPSC sekvens (ved -50 mV) bliver blokeret af AMPA / kainat-antagonist CNQX (10 um), yderligere underbygger disynaptic karakter IPSC. Scale bar: 50 pA / 5 msek. (D) Virkninger af efterfølgende blok af EPSC / IPSC sekvens (ved -50 mV) ved Cl - kanal blokker picrotoxin (PTX, 100 uM) og PTX + CNQX. Den IPSC er blokeret af PTX og de resterende EPSC af CNQX. Scale barer: 50 PA / 5 ms. (E) ordningen for eksperimentel strategi for (FH). F) Repræsentative EPSCs optaget fra en mpITC og en BLA principal neuron på optogenetic parret-puls stimulation af fibre fra MGM / PIN. Scale bar: 50 PA / 20 msek. (G) EPSCs i en anden mpITC neuron blokeres af natriumkanalblokker Tetrodotoxin (TTX, 0,5 uM), hvilket indikerer, at de er afhængige af natriumkanalaktivitet. Scale bar: 50 PA / 20 msek. (H) thalamiske input til mpITC neuroner moduleres af præsynaptiske GABAB-receptorer. EPSCs under kontrol tilstand, reduktion af EPSC amplitude og samtidig stigning i den parrede puls forholdet under anvendelse af GABA B-agonist Baclofen (2 uM), og inddrivelse af både amplitude og indledende parret puls ration ved samtidig anvendelse af GABA B antagonisten CGP55845 (10 uM). Disse ændringer er indikative for en præsynaptisk modulation af GABA B-receptorer. Målestok: 50 pA / 20 ms. (I) Ordning af eksperimentel strategi for (J). (J) Light-fremkaldte aktionspotentialer optaget fra en CHR2-YFP udtrykker mpITC neuron. Light-fremkaldte IPSCs optaget fra en BLA principal neuron ved forskellige bedrift potentialer (-90, -70, -50, -20 og 0 mV) vende rundt den beregnede ligevægt potentialet for Cl -. Scale barer: 20 mV / 100 msek og 10 pA / 10 ms. Bemærk:. Figur 3B-D er modificeret fra reference # 16, og figur 3H og J fra henvisning # 23 Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol beskriver en metode til ex vivo optogenetic undersøgelse af neurale kredsløb og lokal tilslutningsmuligheder, der let kan implementeres på de fleste, hvis ikke alle, opretstående skive patch-clamp optagelse opsætninger ved at udstyre dem med en ~ 470 nm LED ved epifluorescens lys port. En stor fordel ved optogenetic stimulering af axonal fremskrivninger i skiver er, at det giver mulighed for specifik aktivering og efterforskning af egenskaberne af forbindelser, der ikke var tilgængelige med konventionel elektrisk stimulering, fordi de tilsvarende fiber skrifter ikke var kendt, ikke klart defineret, eller ikke bevaret i en enkelt hjerne skive. Som et vigtigt eksempel relevant for frygt kredsløb, det er illustreret, hvordan dette kan anvendes til at dissekere egenskaber mPFC indgange til amygdala.

Selv i tilfælde, hvor elektrisk fiber tarmkanalen stimulation er blevet grundigt anvendt i tidligere undersøgelser, disse skrifter ofte bærer fibre fra forskellige regioner i oprindelses-. For eksempel, i kredsløb relateret til at frygte læring, fremskrivninger fra forskellige sensoriske thalamiske kerner eller kortikale regioner køre blandet gennem de interne og eksterne kapsler hhv. Fordelen ved optogenetic stimulation er, at den muliggør selektiv aktivering af en delmængde af fibre fra et defineret område. Dette er illustreret for specifikke thalamiske input fra PIN og MGM til interkalerede celler og lateral amygdala vigtigste celler. Endvidere kan overvindes problemerne med elektrisk stimulering, dvs. aktivering af andre fibre af passage eller celler i nærheden af stimulerende elektroder og kan gøre lokale forbindelser i målområdet. Men mens optogenetic stimulation er lige så hurtig som elektrisk stimulation, kan der være begrænsninger med hensyn til stimulering frekvens, der på pålidelig vis kan anvendes. Dette afhænger af inaktivering og deinactivation kinetik og af varianten af CHR, der bliver brugt, 4 samt expression niveauer og metoder, og lette stimulering metoder 26.

Når der anvendes en LED monteret på fluorescens port til lys stimulation, typisk hele synsfeltet for et givet mål belyst, hvilket resulterer i aktivering af alle fibre eller celler i marken og i en vis dybde. Dette kan kun delvis begrænses til et mindre område eller et sæt af mærkede celler (i dette eksempel mpITC) under anvendelse af en åbning i fluorescerende lys sti 23,27. Med LEDs, lys magt er ikke et problem, da høj effekt blå lysdioder er nu tilgængelig fra mange producenter. Men emission spektre har fuld bredde halv maksimale værdier af tocifrede nanometer. Derfor lysdioder udgør begrænsninger, når enten rumligt præcis stimulation for subcellulær kortlægning af tilslutningsmuligheder og / eller monokromatisk stimulering ønskes. Begge kan forbedres ved anvendelse af blå lasere som lyskilder, typisk i kombination med mere avancerede opsætninger, der muliggør tjæregeting og / eller scanning af strålen i små områder og definerede væv dybder (fx se 28).

Med ex vivo optogenetic fremgangsmåde beskrevet her, kan flere egenskaber af synaptisk transmission undersøges. For at vurdere monosynapticity af den tidlige synaptisk respons komponent, grundig analyse af ventetid og deres jitter, samt responsamplituden varians bør anvendes på et repræsentativt udsnit af indspillede neuroner (f.eks se 16,17,23). I tilfælde, hvor aktivering af netværksaktivitet kan spille en rolle, den foretrukne fremgangsmåde er at isolere den direkte monosynaptiske komponent ved at anvende en kombination af tetrodotoxin (TTX) for at blokere aktionspotentialer i kombination med K + -kanal blokker 4-aminopyridin (4- AP) for at forhindre repolarisering 14,28,29. Receptorerne medierer mono- og disynaptic komponenter af input kan identificeres ved hjælp af farmakologiske blokkere. Furthermore, er det muligt at studere aspekter af præsynaptisk modulering af optogenetically-aktiverede indgange i amygdala 23,30. En potentiel advarsel er, at CHR2 har nogle calcium permeabilitet 1,4 og dets aktivering i præsynaptiske fibre og terminaler er blevet foreslået at ændre release sandsynlighed ved forskellige mekanismer 26,31. Ikke desto mindre er flere undersøgelser, herunder eksempler vist her med held anvendt CHR2 udtryk for at identificere input og målrette celle-specifikke forskelle i parret-puls nøgletal i amygdala og andre hjerneområder 16,23,26,32 og desuden demonstreret modulering af frigivelse sandsynlighed ved aktivering af specifikke signalveje i præsynaptiske terminaler, der ikke blev udelukket af Chr aktivering 23,30. Yderligere støtte kommer fra data i hippocampus og cerebellum, der viser, at med den rette chr udtryk metode og lys stimulation teknik, fysiologiske aspekter, herunder effekten af ​​frigivelse og troskab of synaptisk transmission kan opgøres pålideligt studeres 26. Endelig optogenetic aktivering fiberen er også med succes blevet anvendt til at påføre stimuleringsprotokoller der inducerer synaptisk plasticitet 31,33,34.

Flere aspekter er afgørende for succesen af ​​denne metode. Den ene er præcisionen af ​​stereotaktisk målretning af virale vektorer. Derfor er det nyttigt til hurtigt at vurdere injektionsstedet placering før opnå optagelser og derefter udføre en mere detaljeret post-hoc analyse. Ud over rumlig præcision, levedygtigheden af ​​neuroner på injektionsstedet er en afgørende faktor for en vellykket eksperiment og afhænger af injektionsteknik. Den fremlagte valgmuligheder, der bruges lange og tynde tilspidsede glaselektroder, tjener dette formål godt for både overfladiske og dybere hjerneområder, men kan have den ulempe, at tilspidsning er meget fleksibel. Et alternativ er at bruge mikroliter sprøjter specielt udviklet til stereotaktisk levering i neurovidenskab (neuro-syringes) med mere stive nåle, der kan dispensere små volumener. Specificiteten af målretning CHR-udtryk til definerede celletyper og regioner kan forbedres yderligere ved hjælp af betinget udtryk 7, for eksempel med Cre-systemet som illustreret for amygdala indskudt celler. Dette tillader også anvendelsen af ​​stærke promotorer i Cre-afhængige virale vektorer.

Et andet kritisk aspekt er valget af den virale vektor. For at udtrykke chr blev rekombinante adenoassocierede vira (rAAVs) anvendes der har den fordel af at være en biosikkerhedsniveauet 1 vektorer sammenlignet med andre populære virale systemer. rAAVs har været brugt i nogen tid og er generelt sikre og pålidelige vektorer med god neural tropisme og lidt eller ingen immunogen potentiale, men deres emballage volumen er begrænset (ca.. 4-5 kb) 35. I disse specifikke eksperimenter, serotype 2/9 og 2/1 blev brugt til allestedsnærværende og betingede udtryk, hhv. I overensstemmelse med litteraturen, denSE serotyper transducere celler i målområdet, men synes ikke at blive taget op af axoner til retrograd label celler, i modsætning serotyper 2/5 og 2/6 36,37. Dog bør indledende forsøg udelukke, at der er CHR-mærkede celle organer i områder, der rager til injektionsstedet, hvilket er særligt vigtigt, når man studerer gensidigt forbundne områder af hjernen som mPFC og amygdala. Adskillige nyere undersøgelser sammenlignet effekten af rAAV serotyper i forskellige hjerneområder hos rotter og mus 36,38,39. En spirende tema er at nyere serotyper (f.eks 2/1, 2/8 og 2/9) er generelt mere effektive end den oprindelige 2/2 serotype. Også at bemærke, rAAV-medieret udtryk for CHR i modsætning til andre metoder, ikke har skadelige virkninger på at udtrykke celler eller mærkede axoner 40. Den krævede ekspression tid til at opnå aktivering effektiv fiber ex vivo synes at afhænge af afstanden af det undersøgte projektion. Her og i overensstemmelse med literatur, til mærkning og aktivering af langtrækkende forbindelser i musen (mPFC og sensoriske inputs), et udtryk på 4 - 8 uger er nødvendig, mens der for at studere den lokale forbindelse i amygdala, kortere udtryk gange af 2 - 3 uger er tilstrækkelig 14-17,23,30,34.

Til optagelse af optogenetically-fremkaldte reaktioner i målområdet, to faktorer er afgørende: 1) den akutte hjerne skive skal være af god kvalitet og 2) en betydelig mængde af levedygtige mærkede fibre skal bevares. Kvaliteten af ​​skiver kan forbedres ved hjælp af safir knive til udskæring. Bevarelse af axoner og således, størrelse og stabilitet af lette reaktioner kan forbedres ved at skære skiver i en bestemt vinkel, som illustreret for mPFC-amygdala fremspring (Figur 1D og 2A) 16,34. Men denne stærkt afhængig af orienteringen af ​​afferenter i målområdet og skal bestemmes for hver kombination af projektion område og tarFå region. I denne henseende kan post-hoc analyse af fremspring i målregionen være nyttig. For at forbedre afsløring fiber og omgå blegning, der kan være opstået under skive stimulation, immunfarvning mod fluorescerende tag på Chr fusionsproteinet kan anvendes.

Samlet set er for nylig ikke kun blevet anvendt denne metode til optogenetic kredsløb mapping til at frygte kredsløb, men mange andre systemer i hjernen. I fremtiden vil målretning af subnuclei og specifikke celletyper ved at kombinere et voksende udbud af genetisk modificerede mus linjer og betingede virale vektorer giver en endnu mere detaljeret forståelse af mangfoldigheden af ​​funktionelle synaptiske egenskaber af specifikke lokale og langtrækkende kredsløb. Endvidere kunne post-hoc immunmærkning af fluorescens-mærkede CHR i undersøgte funktionelle sammenhænge kombineres med ultrastrukturelle analyse (dvs. ved brug elektronmikroskopiske metoder) at give indsigt i præcis morphological egenskaber af tidligere aktiverede synapser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  5. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, (5), 663-668 (2007).
  6. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  7. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  8. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  9. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90, (2), 419-463 (2010).
  10. Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12, (2), 120-150 (2007).
  11. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33, (1), 56-72 (2008).
  12. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13, (6), 728-733 (2006).
  13. Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36, (2), 529-538 (2011).
  14. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80, (6), 1491-1507 (2013).
  15. Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34, (47), 15601-15609 (2014).
  16. Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
  17. Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10, (9), 1435-1442 (2015).
  18. Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52, (1), 215-227 (2007).
  19. Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62, (6), 757-771 (2009).
  20. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247, (2), 246-271 (1986).
  21. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31, (13), 5131-5144 (2011).
  22. Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
  23. Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86, (2), 541-554 (2015).
  24. Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467, (1), 60-79 (2003).
  25. Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
  26. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34, (22), 7704-7714 (2014).
  27. Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16, (3), 332-339 (2013).
  28. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, (7233), 1142-1145 (2009).
  29. Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79, (4), 658-664 (2013).
  30. Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32, (42), 14815-14820 (2012).
  31. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4, (2), 139-141 (2007).
  32. Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76, (4), 790-803 (2012).
  33. Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14, (11), 1413-1415 (2011).
  34. Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31, (1), 339-345 (2011).
  35. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4, (5), 353-364 (2003).
  36. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8, (9), (2013).
  37. Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20, (3), 348-352 (2013).
  38. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
  39. McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109, (3), 838-845 (2009).
  40. Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
<em>Ex Vivo</em> optogenetic Dissektion af Frygt Kredsløb i Brain Skiver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter