Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Ex Vivo optogenetische Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

Optogenetische benaderingen worden wijd gebruikt om neurale activiteit te manipuleren en de gevolgen voor hersenfunctie beoordelen. Hier, wordt een techniek beschreven die bij in vivo expressie van het optische activator Channelrhodopsin, maakt de ex vivo analyse van synaptische eigenschappen specifieke lange afstand en lokale neurale verbindingen in angst gerelateerde circuits.

Abstract

Optogenetische benaderingen worden nu op grote schaal gebruikt om de functie van neurale populaties en circuits te bestuderen door het combineren van gerichte expressie van licht geactiveerd eiwitten en daaropvolgende manipulatie van neurale activiteit door licht. Channelrhodopsins (CHR) zijn licht-gated kation-kanalen en wanneer gefuseerd aan een fluorescerend eiwit hun expressie maakt visualisatie en gelijktijdige activering van specifieke celtypen en hun axonale uitsteeksels in bepaalde hersengebieden. Via stereotactische injectie van virale vectoren, kunnen chr fusie-eiwitten constitutief of voorwaardelijk worden uitgedrukt in specifieke cellen van een bepaald hersengebied, en hun axonale projecties kan vervolgens anatomisch en functioneel worden bestudeerd via ex vivo optogenetic activatie in de hersenen plakjes. Dit is van bijzonder belang wanneer gericht op synaptische eigenschappen van verbindingen die niet met gebruikelijke elektrische stimulatie benaderingen kunnen worden aangepakt begrijpen of kunnen nieuwe affehuurprijs en efferente connectiviteit die eerder was slecht begrepen. Hier enkele voorbeelden hoe deze techniek kan worden toegepast op deze vragen ophelderen angst-gerelateerde circuits in de amygdala onderzoeken. De amygdala is een belangrijke regio voor het verwerven en expressie van angst, en de opslag van angst en emotionele herinneringen. Vele lijnen van bewijs suggereren dat de mediale prefrontale cortex (mPFC) neemt deel aan verschillende aspecten van angst acquisitie en extinctie, maar de precieze connectiviteit met de amygdala is net begonnen te begrijpen. Ten eerste wordt getoond hoe ex vivo optogenetic activering kan worden gebruikt om aspecten van synaptische communicatie tussen mPFC afferenten en target cellen te bestuderen in de basolaterale amygdala (BLA). Verder wordt geïllustreerd hoe dit ex vivo optogenetic benadering kan worden toegepast op nieuwe connectiviteitspatronen behulp van een groep van GABAerge neuronen in de amygdala beoordelen, de paracapsular geïntercaleerde celcluster (mpITC) als voorbeeld.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nauwkeurige instrumenten voor visualisatie en gelijktijdige activering van specifieke verbindingen tussen hersengebieden en specifieke typen neuronen worden steeds belangrijker in het begrijpen van de functionele connectiviteit onderliggende gezonde hersenfunctie en ziektebeelden. Idealiter dit met zich meebrengt fysiologisch onderzoek naar nauwkeurige synaptische eigenschappen waarmee geïdentificeerde neuronen communiceren. Dit geldt met name voor verbindingen tussen hersengebieden die in één enkele plak acute hersenen kan worden behouden. In het verleden is dit grotendeels bereikt in afzonderlijke experimenten. Enerzijds, neurale tracers geïnjecteerd in vivo zijn gebruikt in combinatie met daaropvolgende licht- of elektronenmicroscopische analyse van pre- en postsynaptische partners. Anderzijds, wanneer zenuwbanen van het gebied van herkomst bewaard en toegankelijk in de slice voorbereiding, elektrische stimulatie is gebruikt om synaptische communicatiemechanismen ervan met cellen in het doelgebied.

Met de komst van optogenetics, de gerichte expressie van licht-gated kation-kanalen, zoals Channelrhodopsins (CHR) gefuseerd aan fluorescerende eiwitten, zodat nu activatie van neuronen en hun axonale trajecten terwijl voor de visualisatie en post-hoc analyse anatomische 1- 4. Omdat CHR-expressie axonen ook kan worden gestimuleerd wanneer gescheiden van ouder somata 5, kan in de hersenen plakjes: 1) beoordelen input van hersengebieden die niet toegankelijk zijn met gebruikelijke elektrische stimulatie genoemd, omdat zenuwbanen niet splitsbaar of specifieke traject is niet bekend; 2) ondubbelzinnig de regio van herkomst voor specifieke inputs die werden vooropgesteld, maar onvolledig begrepen te identificeren; en 3) het onderzoeken van de functionele connectiviteit tussen gedefinieerde celtypes, zowel lokaal als in de lange-afstands projecties. Door een aantal voordelen, heeft deze optogenetic mapping circuits in hersenplakken breed gewordenly gebruikt in de afgelopen jaren, en verschillende virale vectoren voor expressie van fluorescent-gelabeld CHRS zijn verkrijgbaar bij commerciële leveranciers. Enkele belangrijke voordelen van optogenetic activering via conventionele elektrische stimulatie geen schade aan het weefsel door de plaatsing van de stimulatie-elektroden, specificiteit vezels stimulatie omdat elektrische stimulatie ook vezels van doorgang of andere nabijgelegen cellen, en een even snelle en temporeel precieze stimulatie werven. Bovendien kan stereotactische injectie van virale vectoren gemakkelijk worden gericht op specifieke hersengebieden 6 en voorwaardelijke of celtype specifieke expressie kan worden verkregen door Cre-afhankelijke expressie en / of specifieke promoters 7. Hier, wordt deze techniek toegepast voor het in kaart brengen van de lange afstand en de plaatselijke omlopen in de vreze systeem.

De amygdala is een belangrijke regio voor het verwerven en expressie van angst, en de opslag van angst en emotionele herinneringen 8,9. Apart weerm de amygdala, de mediale prefrontale cortex (mPFC) en hippocampus (HC), structuren die onderling zijn verbonden met de amygdala, zijn betrokken bij aspecten van acquisitie, consolidatie en ophalen van angst en extinctie geheugens 10,11. Activiteit in de deelsectoren van de mPFC lijkt een dubbele rol te spelen bij de bestrijding van zowel hoge als lage angst verklaart 12,13. Dit kan voor een deel worden veroorzaakt door rechtstreekse verbindingen vanuit mPFC naar de amygdala dat de amygdala-activiteit en de output zou controleren. Daarom is in de afgelopen jaren hebben verschillende studies begonnen in ex vivo experimenten slice synaptische interacties tussen mPFC afferenten en specifieke doelcellen te onderzoeken in de amygdala 14-17.

Tijdens angst leren, sensorische informatie over airconditioning en ongeconditioneerde stimuli bereikt de amygdala via projecties van specifieke thalamische en corticale gebieden. Plasticiteit van deze ingangen neuronen in het laterale deel (la) van de Basolateral amygdala (BLA) is een belangrijk mechanisme dat ten grondslag vreesconditionering 9,18. Steeds meer bewijs suggereert dat parallelle plastic processen in de amygdala te betrekken remmende elementen om angst geheugen 19 te controleren. Een groep van geclusterde remmende neuronen zijn de GABAergic mediale paracapsular ingelast cellen (mpITCs), maar hun precieze verbinding en de functie is onvolledig begrepen 20-22. Hier wordt optogenetic circuit mapping gebruikt om afferente en efferente connectiviteit van deze cellen en hun impact op de doelgroep neuronen in de amygdala te beoordelen, waaruit blijkt dat mpITCs ontvangen directe zintuiglijke input van thalamus en corticale relay stations 23. Specifieke expressie van CHR in mpITCs of BLA neuronen maakt het in kaart brengen van de lokale interacties, waaruit blijkt dat mpITCs remmen, maar ook onderling geactiveerd door, BLA opdrachtgever neuronen, ze te plaatsen in de roman van feed-forward en feedback remmende circuits die effectief BLA activiteit te controleren23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ethiek statement: Alle experimentele procedures waren in overeenstemming met de EU-richtlijn over het gebruik van dieren in onderzoek en werden goedgekeurd door de lokale Animal Care en gebruik Comite (Regierungspräsidium Tübingen, deelstaat Baden-Württemberg, Duitsland), die verantwoordelijk is voor de Universiteit van Tübingen.

1. stereotactische injectie Procedure

  1. Bereid steriele instrumenten (schaar, scalpel, klemmen, boren, naalden, hechtmateriaal) met behulp van een sterilisator. Regelen steriele instrumenten en andere benodigde oplossingen en chirurgische benodigdheden zoals steriele katoenen swaps, ontsmettingsmiddel, steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) en H 2 O 2 op een steriele chirurgische doek.
  2. Pull glazen micropipetten voor injectie (Figuur 1A, bijvoegsel) met een 3 mm brede box filament op een horizontale micro-elektrode trekker volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Voor diepe injecties, moet de elektrode taper voldoende zijnlang om de ventrale meest coördinaten te bereiken (ca. 5 mm. voor coördinaten, zie 1.10).
  3. Premix 1 pl virusoplossing en 0,2 pl 0,1% snelle groene oplossing in steriele PBS (voor een betere zichtbaarheid van de oplossing in de glazen pipet). Vul het glas pipetten met een mengsel van het virus oplossing en snel groen met behulp van een microliter pipet met een fijne tip (figuur 1A, inzet).
    Opmerking: Het werk met recombinant adeno-geassocieerde virale vectoren (rAAV) wordt beschouwd bioveiligheidsniveau 1 (BSL 1) werk moet worden uitgevoerd in een laboratorium BSL 1. rAAVs gebruikt in deze studie (figuur 1C) waren: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotype 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (serotype 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotype 2/1) 23
  4. Verdoven een muis met behulp van een klein dier anesthesieapparaat (Isofluraan: 3% in zuurstof voor inductie).
    Opmerking: De muizen gebruikt in deze studie waren 4 -7 weken oud en de volgende stammen en genotypes: C57Bl6 / J wildtype (experiment in Figuren 2A en 3A-D); GAD67-GFP 24 (experiment in figuren 2B en 3E-H); Tac2-Cre 25 (experiment in de figuren 2C en 3I-J).
  5. Scheren hoofd tussen de oren en ogen. Solliciteer ontsmettingsmiddel (providon jodium-based) aan geschoren hoofd met behulp van wattenstaafjes.
  6. Breng een oogzalf om uitdroging van de ogen tijdens de anesthesie te voorkomen. Subcutaan injecteren muis met analgetische (meloxicam-based, 0,1 ml van 5 mg / ml oplossing).
  7. Plaats de muis in stereotactische frame (Figuur 1A) en anesthesie te onderhouden via een gas verdoving masker (Isofluraan: 2% in zuurstof voor onderhoud). Controleer anesthesie diepte met behulp van ledemaat terugtrekking reflex alvorens verder te gaan.
    Opmerking: aanvullen steriele omstandigheden en mogelijk gedurende de gehele chirurgische procedure; slijtage disposable gezichtsmasker, chirurgische gown, en handschoenen.
  8. Maken de huid incisie boven op het hoofd met een schaar. Trek de huid aan de kant met behulp van stompe tang, bevestig met klemmen om de schedel oppervlak, en schone schedel bloot te leggen met H 2 O 2.
  9. Mark injectieplaatsen op de schedel met behulp van een fijne punt permanent marker en boor gaten voor beide hemisferen (Figuur 1B). Coördinaten voor injecties in deze studie zijn (van Bregma (mm)): mPFC: anterior 1.9, laterale ± 0,3, ventrale 2,1; MGM / PIN: posterior 3.0, laterale ± 1,8, ventrale 3,8; mpITC / BLA: posterior 1,45, laterale ± 3.35 en ventrale 4.75.
  10. Monteer gevulde glazen pipet op stereotactische kader verbonden met een druk injectie-inrichting en breng de pipet Bregma positie.
  11. Breek het topje van de glazen pipet met behulp van fijne straight-tip tang. Doe dit zachtjes om aerosol generatie van het virus oplossing te voorkomen. Zorg ervoor dat de pipet tip is geopend door het toepassen van een paar drukpulsen en het observeren van de extrusie van druppels Virus oplossing.
  12. Ga naar de gewenste injectie coördinaten en injecteer de helft van de pipet inhoud (~ 0,5 ul) met de volgende instellingen van de druk injectie apparaat: Druk: 20 psi, gemiddelde hartslag lengte: 30 ms, gemiddelde aantal pulsen: 50.
  13. Laat pipet in de plaats voor ~ 1 min voor langzaam (1 mm / min) het terugtrekken.
    Opmerking: Zorg ervoor pipet niet wordt geblokkeerd voordat herhalen procedure met dezelfde pipet op andere halfrond. In het geval van geblokkeerde tip, reinigen of afbreken tip en nul pipet positie Bregma weer.
  14. Clean schedel met PBS (pH 7,4), verwijder klemmen, trek de huid samen, en hechtdraad de incisie met individuele toets hechtdraad (3-4 knopen). Solliciteer ontsmettingsmiddel (providon jodium-based) rond de wond.
  15. Stop de anesthesie en hoeft de muis niet onbeheerd achter te laten tot het helemaal wakker. Houd enkele gehuisveste of terug te keren naar gezelschap van andere dieren alleen als volledig hersteld. Postoperatief, blijven de gezondheidstoestand bewaken, en administrater pijnstillende indien nodig. Volg de procedures volgens de regels voorgesteld door de lokale Animal Care en gebruik Comite zetten.

2. Voorbereiding van de Acute Slices

  1. Bereid ACSF, snij oplossing instrumenten (scharen, scalpel, tang, spatel, Pasteur pipet) en agar blokken.
    Opmerking: 1 L van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) vereist per experiment, en wordt bereid door chemicaliën in tweemaal gedestilleerd H2O als eerder gepubliceerd 16,23. Snijden wordt bereid door toevoeging van 200 ml ACSF met 0,87 ml 2 M MgSO4 voorraadoplossing.
  2. Oxygenaat ACSF en snijden oplossing gedurende het experiment met 95% O2 en 5% CO2.
  3. Diep verdoven muis met behulp van een klein dier anesthesieapparaat met behulp van isofluraan (3% zuurstof). Controleer anesthesie diepte met behulp van ledemaat terugtrekking reflex alvorens verder te gaan.
  4. Onthoofden muis met behulp van grote schaar en onmiddellijk chillhoofd in ijskoude snijden oplossing.
  5. Open schedel door een enkele middellijn incisie van caudaal naar rostraal en duw stukken van de schedel aan de zijkanten met behulp van een tang. Snel verwijderen hersenen door het voorzichtig uit de schedel met behulp van een kleine afgeronde spatel tillen. Snijd cerebellum met scalpel. Plaats de hersenen in ijskoude snijden oplossing.
  6. Voor mPFC injectieplaatsen: afgesneden voorste deel van de hersenen (met mPFC) met een scalpel en zet in ijskoude cutting-oplossing tot het snijden.
  7. Verwijder overtollig snij-oplossing met een filter papier en lijm het achterste deel van de hersenen op de vibratome podium.
  8. Voor gekantelde amygdala plakken, lijm de hersenen op een agar blok (4%) gesneden op een 35 ° hoek (figuur 1D, midden). Voor coronale amygdala plakjes, MGM / PIN injectieplaats en mPFC injectieplaatsen, lijm de hersenen direct op het podium (figuur 1D, links en rechts). Plaats een extra agar blok achter de hersenen voor stabiliteit tijdens het snijden.
  9. Place stadium snijkamer met ijskoude zuurstofrijke snijden oplossing wordt gehandhaafd op 4 ° C met een koeleenheid. Bereid acute plakken van de amygdala (320 pm) met behulp van een saffier mes. Leg plakjes in een met zuurstofrijk ACSF bij RT geleverd-interface kamer.
  10. Na bereiding van acute amygdala segmenten, plaatst de interface kamer in een waterbad bij 36 ° C plakjes herstellen gedurende 35 - 45 min. Vervolgens, de terugkeer van de interface van kamer naar RT. Voor het opnemen van deze segmenten, verder met stap 3.2.
  11. Tijdens het begin van de stap 2,10, snijd plakken van de injectieplaats zoals eerder beschreven voor acute amygdala plakjes (stappen 2,8-2,9). Herstel van segmenten in het waterbad is hier niet nodig. Optioneel: Als u snel inschatten injectieplaats locatie, in acht plakken op een stereoscoop uitgerust met een tl-lamp en de juiste filter sets.
  12. Fix schijfjes bevatten injectieplaatsen voor post-hoc analyse door ze sodat tussen twee filter papers en submerGing ze in 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS oplossing O / N. Voor de analyse van injectieplaatsen verder met stap 4.1.

3. Visualisatie en stimulering van Presynaptische Fibers

  1. Bereid patch microscoop voor optogenetic activering van vezels en cellen:
    1. Centreren gemonteerd licht emitterende diode (LED) op het licht levering route.
    2. Meet de LED lichtintensiteit aan de achterkant brandvlak en aan de uitgang van elke doelstelling met een vermogensmeter kiezen van de geschikte golflengte van 470 nm.
    3. Bereken de lichtsterkte in mW / mm2 en een kalibratiecurve (LED intensiteit (%) versus lichtopbrengst (mW / mm 2)) voor elke doelstelling waarden gemeten 470 nm golflengte.
  2. Ophalen van een acute amygdala segment van het grensvlak kamer en plaats in het segment kamer gemonteerd op de rechtopstaande microscoop uitgerust met een fluorescentielamp. Zorg ervoor dat de slice, zodanig dat de slic positionerene oppervlak naar boven in de interface kamer wordt ook naar boven in de opname kamer. Perfuseren slice met verse, zuurstofrijke ASCF met een snelheid van 1-2 ml / min bij een temperatuur van ~ 31 ° C.
  3. Observeren presynaptische vezels in het segment met de fluorescentielamp in combinatie met geschikte filtersets voor specifieke fluorescerende eiwit tot expressie. Gebruik 5x doel om een overzicht (figuur 1E) en 60x objectief voor de beoordeling van de vezeldichtheid binnen het doelgebied te verkrijgen.
    Opmerking: Voor GFP en YFP, gebruik filter instellen "groene" (excitatie 472/20, bundelsplitser 495, Emission 490 LP) voor mCherry gebruiken filter instellen 'rood' (excitatie 560/40, bundelsplitser 585, Emission 630/70), zoals gespecificeerd in de tabel materialen / apparatuur.
  4. Open of opening in de microscoop lichte route beperken als gewenst voor het experiment (figuur 2D).
  5. Om een ​​patch opname te verkrijgen, vult een patch pipet met interne oplossing en monteren in elektrodehouder. Solliciteer positieve druk om de patch pipet en laat het langzaam eerst in het bad oplossing en vervolgens onder visuele controle in het segment met behulp van de micromanipulator.
    1. Benader het neuron van belang met de patch pipet uit de zijkant en bovenkant. Los positieve druk wanneer de pipet op het oppervlak van de cel (kuiltje zichtbaar celoppervlak) en verkrijgen een "gigaseal" door het toepassen van onderdruk.
    2. Toepassen verder zuigkracht de membraanplaat scheuren te whole-cell opname te verkrijgen. Vervolgens stimuleren gelabeld vezels met de aangesloten LED met de geschikte golflengte voor het activeren CHR (470 nm) tijdens het opnemen elektrische reacties van de cel.
    3. Voor synaptische stimulatie beginnen met een lage intensiteit LED en verhogen totdat het gewenste synaptische stroom amplitude bereikt. Leiden tot de LED door het configureren van digitale uitgangen in de data-acquisitie software om de timing en pulslengte controle (voorbeelden in figuur3).
      Noot: andere software en / of TTL-genererende apparaten worden gebruikt te triggeren LED.
  6. Herhaal stimulatie met geopende of beperkte opening (stap 3,4) in de microscoop lichte route als gewenst voor het volgende opgenomen cel en / of de aanwezigheid van specifieke drugs.
  7. Na het opnemen, fix plakken voor post-hoc analyse door ze sodat tussen twee filter papers en onder te dompelen ze in 4% PFA O / N.
  8. Analyseer elektrofysiologische gegevens.
    Opmerking: Gebruik de juiste software om opgenomen sweep gegevens te visualiseren voor elke individuele stimulatie offline. Bij de analyse van effecten van drugs, gebruiken piek detectie routines om tijdsverloop van de drug effect te verkrijgen over de synaptische huidige amplitudes voor alle individuele veegt. Bepalen wanneer de drug effect steady state bereikt. Om representatieve gemiddelde antwoorden voor te bereiden op de cijfers, gebruiken software om de gemiddelde ≥10 individuele veegt per experimentele conditie (zie figuur 3B-D, FH, J rechter paneel).
    Opmerking: verschillende alternatieve softwarepakketten kunnen worden gebruikt voor gegevensanalyse.

4. Post-hoc analyse van Injection Sites

  1. Wassen plakjes injectieplaatsen (uit stap 2,12) en opname (zo her-beeldvorming gewenst is, vanaf stap 3,7) driemaal in PBS. Dit gebeurt door herhaaldelijk vervangen oplossing met verse PBS op een roterende schudinrichting drie keer gedurende 10 min.
  2. Bereid 2% agar-agar-oplossing in PBS, en laat het afkoelen tot ~ 65 ° C. Plaats plakjes plat op de bodem van een kleine 30 mm diameter petrischaal, insluiten plakjes in agar-agar en laat het afkoelen tot solide.
  3. Lijm een ​​agar blok met ingebedde slice of plakken op het podium van een vibratome en plaats het podium in maaikamer met PBS.
  4. Resectie ingebedde plakjes 70 urn dik. Optioneel: Na resectioning, kan segmenten worden gebeitst, dwz met Neurotrace tot cytoarchitecture (Figuur 3A, C) tonen, en / of by immunofluorescentiekleuring voor YFP of mCherry om het signaal van de CHR fusie-eiwit te stimuleren.
  5. Mount plakjes op dia's en dekglaasje met montage media. Afbeelding injectieplaatsen en desgewenst ook afbeeldingschijven bevattende vezels in de projectiegebieden met een fluorescentiemicroscoop of een confocale laser scanning microscoop (Figuur 2A-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In dit gedeelte wordt de workflow van een ex vivo optogenetic aanpak en representatieve resultaten van verschillende experimentele strategieën om de fysiologische eigenschappen van sensorische en modulerende lange afstand projecties BLA en mpITC neuronen evenals eigenschappen van de lokale verbinding tussen mpITC en BLA onderzoeken.

Na stereotactische injectie van de geselecteerde virale vector op de gewenste coördinaten in de hersenen van muizen (Figuur 1A-C, viraal expressiesysteem tijd 2-6 weken, afhankelijk van het experiment), acute hersenen plakjes van de injectieplaatsen en projectiegebieden in de amygdala bereid op de juiste hoek voor patch-clamp experimenten en van de geïnjecteerde hersengebied voor post-hoc analyse van de injectieplaats (figuur 1D). Voordat u begint met opnamen en de optogenetic stimulatie, fluorescent gelabelde cellen of axonale proprognoses in het doelgebied (amygdala) moet worden gecontroleerd op de rechtopstaande microscoop voor patch-clamp opnamen met behulp van de bijgevoegde fluorescentielamp (figuur 1E). Zodra hij een patch-clamp opneemt van een vermoedelijke doelcel in het projectiegebied van het deel, is lichtstimulatie ingeleid terwijl tijdstip, interval en pulslengte worden via de patch software die de lichtuitzendende diode (LED) activeert. Afhankelijk van de experimentele strategie (Figuur 2A-C, rechts) de opening in de fluorescerende lichtpad ofwel volledig open of beperkt (figuur 2D). Terwijl de pulslengte constant en zo kort mogelijk (bij voorkeur ≤1 msec), wordt LED outputintensiteit langzaam verhoogd om te beoordelen welke intensiteit vereist is om de gewenste amplitude van de synaptische respons in een bepaald experiment (figuur 2E) bereiken. Na de opname amygdala plakjes zijn post-gefixeerd. Bij resectioning en optionelekleuring, injectie en opname sites worden afgebeeld op een confocale microscoop om injectieplaats verifiëren en gegevens van misplaatste injecties sluiten. Beelden van injectieplaatsen en de bijbehorende axonale uitsteeksels in de amygdala voor de drie experimentele strategieën (mPFC ingangen BLA, thalamische input naar mpITCs en lokale mpITC activatie) getoond in Figuur 2A-C.

Figuur 3 toont representatieve opname resultaten van BLA voornaamste neuronen, lokale BLA interneuronen en mpITC neuronen ter illustratie van de eigenschappen van het licht-reacties van de consument voor de verschillende experimentele strategieën gebruikt (figuur 3A, E, I). Om te richten GABAergic neuronen (lokale interneuronen en mpITCs) voor het opnemen, werden GAD67-GFP reporter muizen gebruikt 24. Voor mPFC en sensorische thalamus projecties, kan verschillende aspecten van synaptische transmissie worden bestudeerd. De temporele precisie van acactivatie en de kinetische eigenschappen van de CHR die in deze studie mogelijk betrouwbare stimulatie met gepaarde pulsen op een inter-stimulus-interval van 50 msec. Dit maakt analyse van gepaarde-puls ratio (PPR) van postsynaptische stroom (PSC), die ofwel kan worden vergemakkelijkt of depressief afhankelijk projectie en doelceltype, en dienen als indicatoren van waarschijnlijkheid presynaptische afgifte (figuur 3B, F, H) . Daarnaast analyse van synaptische latencies maakt dissectie van verschillende postsynaptische reactie componenten.

In dit voorbeeld langer latenties van de remmende PSC (IPSC) versus prikkelende PSC (EPSC) component geven een disynaptic en monosynaptic ingang, respectievelijk (figuur 3C). In andere gevallen kan een meer grondige analyse van extra EPSC eigenschappen, zoals reactie jitter of de coëfficiënt van variantie van de respons maat die u nodig zijn om conclusies te trekken over zijn mono- of disynaptic natuur 17,23. Bovendien, de toepassing van farmacologische blokkers voor specifieke receptoren kunnen de aard van de PSC's te identificeren (dwz glutamaat EPSC en GABAergic IPSC, Figuur 3C-D). Zoals verwacht, de eerste component van het mPFC ingang was glutamaat, terwijl de late component was GABAerge. De volledige blok van zowel EPSC en IPSC met de glutamaat receptor blokker CNQX ondersteunt verder dat de IPSC is disynaptic. Modulatie van synaptische transmissie bij optogenetically geactiveerde vezels te onderzoeken, kunnen de effecten van agonisten en antagonisten voor metabotrope receptoren (hier GABAB-receptoren) voor amplitude en PPR worden beoordeeld invloeden op pre- en postsynaptische plaatsen evalueren. In dit voorbeeld is de gelijktijdige verlaging van de amplitude met een toename van PPR wijst op een presynaptische modulatie van licht-geactiveerde vezels (3 G, H). Tenslotte kan lokale interacties van cellen in de amygdala worden beoordeeld, bijvoorbeeld,bij muizen die uitdrukken Cre onder controle van de promoter Tac2 25 worden geïnjecteerd met een dubbele floxed chr expressie virale vector (Figuur 1C). Omdat Tac2 en dus CHR wordt uitgedrukt in mpITC en centrale amygdala (figuur 2C), werd lichtactivering beperkt tot de mpITC door het sluiten van de tl-licht pad diafragma (figuur 2D). Onder deze omstandigheden, kan licht opgeroepen actiepotentialen worden opgewekt in geïnfecteerde mpITCs. Korte latency remmende synaptische responsen in de BLA de aanwezigheid van een functionele remmende verbinding mpITC en BLA OG neuronen.

Figuur 1
Figuur 1. stereotactische injecties, Voorbereiding van de Acute Brain Slices en Visualisatie van Presynaptische Fibers. (A, B) stereotactische virus injectie. A) Foto van verdoofde muis geplaatst in een stereotactische frame met schedel blootgelegd en deinjectiepipet. Inzet: Zoom in beeld van de injectie pipet gevuld met virus-oplossing gemengd met een snelle green. Schaal bar: 3 mm. (B) Schematische voorstelling van een muis schedel met gemarkeerde posities van boorgaten voor verschillende injectie gebieden. (C) Scheme tonen verschillende virale constructen gebruikt in deze studie. Donkergrijs: promotorsequentie; blauw: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); groen / rood: fluorescerend eiwit. Expression tijd was 2 weken voor de lokale amygdala projecties en 4-6 weken voor de projecties van mPFC en MGM / PIN. (D) Bereiding van acute hersenen plakjes: Scheme toont de plaatsing van de muis hersenen op snijmachine podium voor het verkrijgen van segmenten van verschillende injectie en projectie gebieden. (E) Visualisatie van vezels in acute hersenen plakjes van een GAD67-GFP muis geïnjecteerd met ChR2-mCherry virus in MGM / PIN. Foto's zijn genomen op de staander patch microscoop met verschillende filter sets: GAD67-GFP expressie, midden; MGM / PIN vezels gelabeld met mCherry, rechts. Schaal bar: 200 pm. mPFC, mediale prefrontale cortex; mpITC, mediale paracapsular geïntercaleerde cellen; BLA, basolaterale amygdala; MGM, mediale geniculate nucleus, mediale deel; PIN, posterior intra-laminaire thalamische nucleus; LA, laterale amygdala; BA, basale amygdala; CEA centrale kern van de amygdala. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. Injectie Sites, Projectie gebieden, en optogenetische Stimulering van Axonal Projecties. (AC) confocale beelden van representatieve injectieplaats en projectie gebieden in de BLA en schema's van de experimentele strategieën. (A) Linker: mPFC injectieplaats in een C57BL / 6 muizen gekleurd met Neurotrace. Schaalbalk:500 urn. Midden: overeenkomstige prognoses van het BLA in een gekantelde amygdala slice. Schaal bar: 200 pm. Rechts: Schema van hele veld verlichting van mPFC projecties en de registratie van neuron in de BLA. (B) Links: MGM / PIN injectieplaats in een GAD67-GFP muis. Schaal bar: 500 pm. Midden: Overeenkomstige projecties in mpITC en LA van een coronale amygdala slice. Schaal bar: 200 pm. Rechts: Schema van hele veld verlichting van MGM / PIN projecties en het opnemen van een mpITC neuron. (C) Linker: Lokale expressie van ChR2-YFP in een Neurotrace gekleurd amygdala stukje van een Tac2-Cre muis. Schaal bar: 200 pm. Inzet: Zoom in van mpITCs uitdrukken ChR2-YFP. Schaal bar: 20 pm. Rechts: Schema van beperkte verlichting van de mpITC cluster en het opnemen van een BLA neuron. (D) Foto's van de opname kamer tijdens lichte levering en het imago van neuronen in acute hersenen plakjes (mpITC cluster) in een GAD67-GFP muis met open en beperkte apertuur. Schaal bar: 30 micrometer. (E) prikkelende postsynaptische stromingen (EPSCs) opgeroepen door verschillende LED intensiteiten (boven) en de plot van het licht de macht versus opgeroepen EPSC amplitude (onder) van een representatieve mpITC neuron bij optogenetic activering van vezels van MGM / PIN. Schaal bar: 100 Pa / 10 msec.
Let op:. Figuur 2A is gewijzigd ten opzichte van referentie # 16 en figuur 2C van referentie # 23 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Voorbeelden van Resultaten van optogenetische Activering van Long Range en lokale Projecties. (A) Regeling van de experimentele strategie voor (BD). (B) Vertegenwoordiger EPSCs opgenomen van een BLA principal neuron enBLA interneuron upon optogenetic gepaarde-pulse stimulatie (50 msec inter-stimulus-interval) van vezels uit mPFC uitlokken gepaarde puls facilitatie en gepaarde puls depressie, respectievelijk. Schaal bar: 100 Pa / 25 msec. (C) optogenetische activering van vezels uit mPFC lokt feed-forward inhibitie. Links: Representative EPSC (bij -70 mV) en remmende postsynaptische stroom (IPSC, bij 0 mV) in een BLA principal neuron. De IPSC heeft een langere synaptische vertraging ten opzichte van de EPSC. Schaal bars: 200 Pa / 10 msec en 200 Pa / 2 msec. Rechts: Lichte opgeroepen bifasische EPSC / IPSC sequentie (at -50 mV) wordt geblokkeerd door de AMPA / kaïnaat antagonist CNQX (10 um), de aard van de disynaptic IPSC verder ondersteunende. Schaal bar: 50 Pa / 5 msec. (D) de gevolgen van de latere blok EPSC / IPSC sequentie (bij -50 mV) door de Cl - kanaal blokker picrotoxine (PTX, 100 uM) en PTX + CNQX. De IPSC wordt geblokkeerd door PTX en de resterende EPSC door CNQX. Schaal bars: 50 Pa / 5 msec. (E) Regeling van de experimentele strategie voor (FH). F) Vertegenwoordiger EPSCs opgenomen vanaf een mpITC en een BLA principal neuron bij optogenetic gepaarde-pulse stimulatie van vezels van MGM / PIN. Schaal bar: 50 Pa / 20 msec. (G) EPSCs in een andere mpITC neuron worden geblokkeerd door de natriumkanaalblokker Tetrodotoxin (TTX, 0,5 uM), waaruit blijkt dat zij afhankelijk zijn van natrium kanaal activiteit. Schaal bar: 50 Pa / 20 msec. (H) Thalamic ingangen mpITC neuronen worden gemoduleerd door presynaptische GABA receptoren. EPSCs onder controle conditie, vermindering van EPSC amplitude en de daarmee gepaard gaande stijging van de gepaarde puls verhouding tijdens het aanbrengen van de GABA B-agonist Baclofen (2 pm), en het herstel van zowel de amplitude en de eerste gepaarde puls rantsoen op co-toepassing van de GABAB antagonist CGP55845 (10 uM). Deze veranderingen zijn indicatief voor een presynaptische modulatie van GABA receptoren. Schaal bar: 50 Pa / 20 msec. (I) Regeling van de experimentele strategie voor (J). (J) licht opgewekte actiepotentialen opgenomen van een ChR2-YFP tot expressie mpITC neuron. Light-opgeroepen iPSCs opgenomen van een BLA principal neuron op verschillende Holding potentials (-90, -70, -50, -20 en 0 mV) achteruit rond de berekende evenwicht potentieel voor Cl -. Schaal bars: 20 mV / 100 msec en 10 pA / 10 msec. Let op:. Figuur 3B-D is gewijzigd ten opzichte van Reference # 16, en Figuur 3 H en J van referentie # 23 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor ex vivo optogenetic onderzoek van neurale circuits en lokale verbindingen die gemakkelijk kunnen worden toegepast op de meeste, zo niet alle, rechte segment patch-clamp setups door hen uit te rusten met een ~ 470 nm LED op epifluorescentie lichtpoort. Een groot voordeel van optogenetic stimulatie van axonale uitsteeksels in plakjes is dat het specifieke activatie en onderzoeken van eigenschappen van verbindingen die niet toegankelijk zijn met gebruikelijke elektrische stimulatie genoemd, omdat de overeenkomstige zenuwbanen niet bekend waren, niet duidelijk gedefinieerd, indien bewaard een enkel sneetje hersenen. Als belangrijk voorbeeld relevant angst circuits, is geïllustreerd hoe dit kan worden toegepast om eigenschappen van mPFC inputs ontleden de amygdala.

Zelfs wanneer elektrische stimulatie fiber tract is uitgebreid gebruikt in eerdere studies, deze stukken dragen vaak vezels uit verschillende regio's van herkomst. Bijvoorbeeld, in circuits met betrekking tot leren vrezen projecties van verschillende sensorische thalamuskernen of corticale gebieden run vermengd door de interne en externe capsules, respectievelijk. Het voordeel van optogenetic stimulatie is dat daardoor selectief inschakelen van een subset van vezels uit een bepaald gebied. Dit wordt geïllustreerd voor specifieke thalamische input van PIN en MGM om geïntercaleerde cellen en laterale amygdala opdrachtgever cellen. Bovendien kunnen problemen met elektrische stimulatie, dat wil zeggen, activering van andere vezels van passage of cellen in de nabijheid van de stimulerende elektrode die lokale verbindingen kunnen maken in het doelgebied worden overwonnen. Echter, terwijl optogenetic stimulatie is even snelle als elektrische stimulatie, er gelden beperkingen ten aanzien van de stimulatie frequentie die betrouwbaar kan worden toegepast zijn. Dit is afhankelijk van inactivatie en deinactivation kinetiek en de variant van CHR die wordt gebruikt, 4 en expression niveaus en methoden, en het licht stimulatie methoden 26.

Bij gebruik van een LED aangebracht om de fluorescentie poort lichtstimulatie wordt gewoonlijk het gehele gezichtsveld van een bepaald doel wordt verlicht, wat resulteert in activering van alle vezels of cellen in het veld en op een bepaalde diepte. Dit kan slechts gedeeltelijk worden beperkt tot een kleiner gebied of een reeks gelabelde cellen (in dit voorbeeld de mpITC) door een opening in de fluorescerende lichtweg 23,27. Met LED's, licht macht is geen probleem, als high power blauwe LED's zijn nu verkrijgbaar bij vele fabrikanten. De emissiespectra volledige breedte half maximum waarden van enkele tientallen nanometers. Daarom LEDs vormen beperkingen wanneer een ruimtelijk nauwkeurige stimulatie voor subcellulaire in kaart brengen van connectiviteit en / of monochromatische stimulatie gewenst zijn. Beide kunnen worden verbeterd door blauwe lasers als lichtbron, gewoonlijk in combinatie met meer ingewikkelde opstellingen mogelijk dat teergeting en / of scannen van de bundel in kleine ruimtes en gedefinieerd weefsel diepten (zie bijvoorbeeld 28).

Met de ex vivo optogenetic aanpak hier beschreven, kunnen verschillende eigenschappen van synaptische transmissie worden bestudeerd. Om monosynapticity van het begin van de synaptische reactie component, grondige analyse van latencies en hun jitter, evenals responsamplitude variantie te beoordelen moet worden gebruikt op een representatieve steekproef van de opgenomen neuronen (zie bijvoorbeeld 16,17,23). Wanneer activatie netwerkactiviteit een rol kunnen spelen, de voorkeurswerkwijze is de directe monosynaptic te isoleren door toepassing van een combinatie van tetrodotoxine (TTX) met actiepotentialen blokkeren in combinatie met de K + kanaal blokker 4-aminopyridine (4- AP) om repolarisatie 14,28,29 voorkomen. De receptoren mediëren mono- en disynaptic componenten ingangen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van farmacologische blokkers. VOORTSe, is het mogelijk om aspecten van presynaptische modulatie van optogenetically geactiveerde inputs bestuderen in de amygdala 23,30. Een mogelijk nadeel is dat ChR2 heeft een aantal calcium permeabiliteit 1,4 en de activering in presynaptische vezels en terminals is voorgesteld om vrijlating waarschijnlijkheid door verschillende mechanismen 26,31 veranderen. Toch een aantal studies waaronder getoond hier met succes ingezet ChR2 expressie input te identificeren en te richten op de cel-specifieke verschillen in gepaarde-pulse verhoudingen in de amygdala en andere hersengebieden 16,23,26,32 voorbeelden en bovendien toonde modulatie van vrijgave waarschijnlijkheid door activering specifieke signaalwegen in presynaptische terminals die niet werd uitgesloten door Chr activering 23,30. Verdere ondersteuning komt van data in hippocampus en het cerebellum, waaruit blijkt dat met de juiste methode CHR meningsuiting en licht stimulatie techniek, fysiologische aspecten, waaronder de werkzaamheid van de introductie en trouw of synaptische transmissie betrouwbaar worden onderzocht 26. Tenslotte optogenetic vezel activering is ook met succes gebruikt voor stimulatie protocollen synaptische plasticiteit 31,33,34 induceren toepassing.

Diverse aspecten cruciaal zijn voor het succes van deze werkwijze. Een daarvan is de nauwkeurigheid van stereotactische richten van virale vectoren. Daarom is het nuttig om een ​​snelle beoordeling injectieplaats locatie voor het verkrijgen opnames en voer een gedetailleerdere post-hoc analyse. Naast ruimtelijke nauwkeurigheid, de levensvatbaarheid van neuronen op de injectieplaats is een belangrijke factor voor een geslaagd experiment en afhankelijk injectietechniek. De gepresenteerde optie, het gebruik van lange en dunne conische glaselektroden, dient dit doel goed voor zowel oppervlakkige als diepere hersengebieden, maar kan het nadeel dat de tapsheid is zeer flexibel zijn. Een alternatief is om microliter spuiten speciaal ontwikkeld voor stereotaxische levering in de neurowetenschappen (neuro-s gebruikenyringes) met meer rigide naalden die kleine volumes kunnen afzien. De specificiteit targeting CHR-expressie bepaalde celtypen en gebieden kunnen verder worden verbeterd middels voorwaardelijke expressie 7, bijvoorbeeld met de Cre-systeem zoals geïllustreerd voor amygdala tussengevoegd cellen. Dit staat het gebruik van sterke promoters Cre-afhankelijke virale vectoren.

Een ander kritisch aspect is de keuze van de virale vector. CHR expressie werden recombinante adeno-geassocieerde virussen (rAAVs) gebruikt die het voordeel dat een bioveiligheidsniveau 1 vectoren in vergelijking met andere populaire virale systemen. rAAVs zijn enige tijd gebruikt en die in het algemeen veilig en betrouwbaar vectoren met goede neurale tropisme en weinig of geen immunogene potentieel, maar de verpakking volume beperkt (ong. 4-5 kb) 35. In deze specifieke experimenten, serotypen 2/9 en 2/1 werden respectievelijk gebruikt voor het alomtegenwoordige en voorwaardelijke expressie,. Volgens de literatuur, dese serotypen transduceren cellen in het doelgebied, maar lijken niet door axonen worden genomen om retrograde label cellen, in tegenstelling serotypen 2/5 en 2/6 36,37. Toch moet eerste experimenten uit dat er CHR-gelabelde cellichamen in gebieden projecteert de injectieplaats, wat vooral belangrijk is bij het bestuderen onderling verbonden hersengebieden zoals mPFC en amygdala. Verschillende recente studies vergeleken de werkzaamheid van rAAV serotypen in verschillende hersengebieden bij ratten en muizen 36,38,39. Een nieuwe thema is dat nieuwere serotypen (bijvoorbeeld 2/1, 2/8 en 2/9) in het algemeen efficiënter dan de oorspronkelijke 2/2 serotype. De meest opvallende rAAV gemedieerde expressie van CHR, in tegenstelling tot andere werkwijzen, geen nadelige effecten op expressie brengende cellen of gelabelde axonen 40 veroorzaken. De vereiste expressietijd daadwerkelijke vezel activering bereiken ex vivo blijkt af te hangen van de afstand van de projectie bestudeerd. Hier en in overeenstemming met de litetuur, voor de etikettering en de activering van lange-afstands-verbindingen in de muis (mPFC en zintuiglijke input), een uitdrukking tijd van 4-8 weken nodig is, terwijl voor het bestuderen van de lokale connectiviteit in de amygdala, kortere expressie tijden van 2-3 weken zijn voldoende 14-17,23,30,34.

Voor het opnemen van optogenetically-responsen opgewekt in het doelgebied, twee factoren zijn cruciaal: 1) de acute hersenplakje heeft goede kwaliteit en 2) een aanzienlijke hoeveelheid levensvatbare gelabelde vezels moet behouden worden. De kwaliteit van segmenten kan worden verbeterd door saffier messen voor het snijden. Behoud van axonen en dus omvang en stabiliteit van licht reacties kunnen worden verbeterd door te snijden plakken een bepaalde hoek zoals geïllustreerd voor mPFC amygdala-uitsteeksels (Figuur 1D en 2A) 16,34. Echter sterk afhankelijk van de oriëntatie van afferenten in het doelgebied en te bepalen voor elke combinatie van projectie stippellijn ta zalrGebruik regio. In dit opzicht kan post-hoc analyse van projecties in het doelgebied nuttig. Naar glasvezel detectie en omzeilen bleken dat tijdens slice stimulatie kan hebben voorgedaan, immunokleuring tegen de tl-tag op de Chr-fusie-eiwit kan worden toegepast te verbeteren.

Kortom, deze wijze van optogenetic circuit mapping onlangs niet alleen toegepast op circuits, maar veel andere systemen angst in de hersenen. In de toekomst, de gerichtheid van subnuclei en specifieke celtypen door de combinatie van een toenemende reeks van genetisch gemodificeerde muis lijnen en voorwaardelijke virale vectoren zal een nog meer gedetailleerd inzicht in de diversiteit van functionele synaptische eigenschappen van specifieke lokale en lange afstand circuits bieden. Bovendien kan post-hoc immunokleuring van fluorescent-gelabelde CHR in onderzochten functionele verbindingen worden gecombineerd met ultrastructurele analyse (dat wil zeggen, met behulp van elektronen microscopische methoden) om inzicht te krijgen in de precieze mor biedenmorfologische eigenschappen van eerder geactiveerde synapsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  5. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, (5), 663-668 (2007).
  6. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  7. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  8. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  9. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90, (2), 419-463 (2010).
  10. Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12, (2), 120-150 (2007).
  11. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33, (1), 56-72 (2008).
  12. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13, (6), 728-733 (2006).
  13. Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36, (2), 529-538 (2011).
  14. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80, (6), 1491-1507 (2013).
  15. Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34, (47), 15601-15609 (2014).
  16. Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
  17. Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10, (9), 1435-1442 (2015).
  18. Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52, (1), 215-227 (2007).
  19. Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62, (6), 757-771 (2009).
  20. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247, (2), 246-271 (1986).
  21. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31, (13), 5131-5144 (2011).
  22. Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
  23. Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86, (2), 541-554 (2015).
  24. Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467, (1), 60-79 (2003).
  25. Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
  26. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34, (22), 7704-7714 (2014).
  27. Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16, (3), 332-339 (2013).
  28. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, (7233), 1142-1145 (2009).
  29. Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79, (4), 658-664 (2013).
  30. Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32, (42), 14815-14820 (2012).
  31. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4, (2), 139-141 (2007).
  32. Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76, (4), 790-803 (2012).
  33. Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14, (11), 1413-1415 (2011).
  34. Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31, (1), 339-345 (2011).
  35. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4, (5), 353-364 (2003).
  36. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8, (9), (2013).
  37. Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20, (3), 348-352 (2013).
  38. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
  39. McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109, (3), 838-845 (2009).
  40. Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
<em>Ex Vivo</em> optogenetische Dissection of Fear Circuits in Brain Slices
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter