Optogenetic दृष्टिकोण व्यापक रूप से तंत्रिका गतिविधि में हेरफेर और मस्तिष्क समारोह के लिए परिणामों का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इधर, एक तकनीक को रेखांकित किया है कि ऑप्टिकल उत्प्रेरक channelrhodopsin के vivo अभिव्यक्ति पर, डर से संबंधित सर्किट में विशिष्ट लंबी दूरी की और स्थानीय तंत्रिका कनेक्शन की synaptic गुण के पूर्व vivo विश्लेषण के लिए अनुमति देता है।
Optogenetic दृष्टिकोण अब व्यापक रूप से प्रकाश से प्रकाश सक्रिय प्रोटीन और तंत्रिका गतिविधि के बाद गड़बड़ी की लक्षित अभिव्यक्ति के संयोजन से तंत्रिका आबादी और सर्किट के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। Channelrhodopsins (ChRs) प्रकाश-गेटेड केशन-चैनल हैं और जब एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए उनकी अभिव्यक्ति दृश्य और विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं की समवर्ती सक्रियण और मस्तिष्क क्षेत्रों में परिभाषित उनके axonal अनुमानों के लिए अनुमति देता है। वायरल वैक्टर स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन के माध्यम से, Chr संलयन प्रोटीन अनिवार्यता से या सशर्त एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र के विशिष्ट कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है, और उनके axonal अनुमानों बाद में मस्तिष्क स्लाइस में पूर्व vivo optogenetic सक्रियण के माध्यम से संरचनात्मक और कार्यात्मक रूप से अध्ययन किया जा सकता है। यह विशेष रूप से महत्व की जब कनेक्शन है कि पारंपरिक बिजली की उत्तेजना के दृष्टिकोण के साथ संबोधित नहीं किया जा सकता है की synaptic गुणों को समझने के लिए लक्ष्य है, या उपन्यास Affe की पहचान करने मेंकिराया और अपवाही कनेक्टिविटी है कि पहले से खराब समझ गया था। इधर, कुछ उदाहरण देकर स्पष्ट है कि कैसे इस तकनीक प्रमस्तिष्कखंड में भय से संबंधित सर्किट elucidating करने के लिए इन सवालों की जांच के लिए लागू किया जा सकता है। प्रमस्तिष्कखंड अधिग्रहण और भय की अभिव्यक्ति है, और डर और भावनात्मक यादें के भंडारण के लिए एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है। सबूत के कई लाइनों का सुझाव है कि औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (mPFC) डर के अधिग्रहण और विलुप्त होने के विभिन्न पहलुओं में भाग लेता है, लेकिन प्रमस्तिष्कखंड के साथ अपने सटीक कनेक्टिविटी सिर्फ समझा जाना शुरू कर रहा है। सबसे पहले, यह कैसे पूर्व vivo optogenetic सक्रियण basolateral प्रमस्तिष्कखंड (बीएलए) में mPFC afferents और लक्ष्य कोशिकाओं के बीच संचार की synaptic पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता दिखाया गया है। इसके अलावा, यह साफ है कि कैसे इस पूर्व vivo optogenetic दृष्टिकोण उपन्यास कनेक्टिविटी प्रमस्तिष्कखंड में GABAergic न्यूरॉन्स के एक समूह का उपयोग कर पैटर्न का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है, paracapsular intercalated सेल क्लस्टर (mpITC), एक उदाहरण के रूप में।
दृश्य और मस्तिष्क क्षेत्रों और न्यूरॉन्स के विशिष्ट प्रकार के बीच विशिष्ट कनेक्शन की समवर्ती सक्रियण के लिए सटीक उपकरण कार्यात्मक कनेक्टिविटी अंतर्निहित स्वस्थ मस्तिष्क समारोह और रोग राज्यों को समझने में और अधिक महत्वपूर्ण होते जा रहे हैं। आदर्श रूप में, यह सटीक synaptic संपत्तियों के साथ की पहचान न्यूरॉन्स संवाद की शारीरिक जांच पर जोर देता। यह मस्तिष्क क्षेत्रों है कि एक भी तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा में संरक्षित नहीं किया जा सकता है के बीच कनेक्शन के लिए विशेष रूप से सच है। अतीत में, यह काफी हद तक अलग प्रयोगों में हासिल किया गया है। एक तरफ, तंत्रिका ट्रेसर इंजेक्शन विवो बाद प्रकाश या पूर्व और postsynaptic भागीदारों की इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण के साथ संयुक्त नियोजित किया गया है। दूसरी ओर, जब मूल के क्षेत्र से फाइबर इलाकों संरक्षित और टुकड़ा तैयारी में पहुंच रहे हैं, बिजली की उत्तेजना लक्ष्य क्षेत्र में कोशिकाओं के साथ synaptic संचार तंत्र का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।
Optogenetics के आगमन के साथ, इस तरह के Channelrhodopsins (ChRs) फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े हुए के रूप में प्रकाश-गेटेड केशन-चैनलों के लक्षित अभिव्यक्ति, अब न्यूरॉन्स और उनके axonal trajectories की सक्रियता के लिए सक्षम बनाता है, जबकि उनके दृश्य और पोस्ट अस्थायी संरचनात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति 1- 4। क्योंकि Chr व्यक्त एक्सोन भी जब माता-पिता somata 5 से कटे प्रेरित किया जा सकता है, यह करने के लिए मस्तिष्क स्लाइस में संभव है: 1) मस्तिष्क क्षेत्रों है कि पारंपरिक बिजली की उत्तेजना के साथ सुलभ नहीं थे से जानकारी का आकलन, क्योंकि फाइबर इलाकों वियोज्य विशिष्ट प्रक्षेपवक्र नहीं हैं या ज्ञात नहीं है; 2) स्पष्ट विशिष्ट जानकारी है कि माने थे, लेकिन पूरी तरह से समझे के लिए मूल के क्षेत्र की पहचान; और 3) में परिभाषित प्रकार की कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक कनेक्टिविटी की जांच, दोनों को स्थानीय और लंबी दूरी के अनुमानों में। लाभ के एक नंबर की वजह से, मस्तिष्क स्लाइस में सर्किट के इस optogenetic मानचित्रण विस्तृत हो गया हैLy पिछले वर्षों में इस्तेमाल किया, और fluorescently टैग ChRs की अभिव्यक्ति के लिए वायरल वैक्टर की एक किस्म वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से आसानी से उपलब्ध हैं। बिजली की उत्तेजना भी पारित होने या अन्य आसपास की कोशिकाओं, और एक समान रूप से तेजी से और सटीक अस्थायी उत्तेजना के तंतुओं भर्ती सकता है क्योंकि पारंपरिक बिजली की उत्तेजना खत्म optogenetic सक्रियण के कुछ महत्वपूर्ण लाभ उत्तेजना इलेक्ट्रोड, फाइबर उत्तेजना की विशिष्टता के प्लेसमेंट के कारण ऊतक को कोई नुकसान कर रहे हैं। इसके अलावा, वायरल वैक्टर स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन आसानी से विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों 6 और सशर्त या सेल प्रकार विशिष्ट अभिव्यक्ति Cre पर निर्भर अभिव्यक्ति और / या विशिष्ट प्रमोटरों 7 का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता करने के लिए निशाना बनाया जा सकता है। इधर, इस तकनीक का डर प्रणाली में लंबी दूरी की मैपिंग और स्थानीय सर्किट के लिए लागू किया जाता है।
प्रमस्तिष्कखंड अधिग्रहण और भय की अभिव्यक्ति है, और डर और भावनात्मक यादें 8,9 के भंडारण के लिए एक महत्वपूर्ण क्षेत्र है। इसके अलावा इधर-उधरप्रमस्तिष्कखंड हूँ, औसत दर्जे का प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (mPFC) और हिप्पोकैम्पस (एचसी), संरचनाओं कि आपस में प्रमस्तिष्कखंड से जुड़े हैं, अधिग्रहण, समेकन और भय और विलुप्त होने यादें 10,11 की बहाली के पहलुओं में फंसा रहे हैं। MPFC के उपखंडों में गतिविधि दोनों उच्च और निम्न डर को नियंत्रित करने में एक डबल भूमिका निभाने के लिए प्रकट होता है कहा गया है 12,13। इस भाग में प्रमस्तिष्कखंड कि प्रमस्तिष्कखंड गतिविधि और उत्पादन को नियंत्रित करने के लिए होगा mPFC से सीधे कनेक्शन द्वारा मध्यस्थता जा सकता है। इसलिए, पिछले वर्षों में, कई अध्ययनों से पूर्व vivo टुकड़ा प्रयोगों में प्रमस्तिष्कखंड 14-17 में mPFC afferents और विशिष्ट लक्ष्य कोशिकाओं के बीच synaptic बातचीत की जांच करने के लिए शुरू कर दिया।
डर सीखने के दौरान, वातानुकूलित और असुविधाजनक उत्तेजनाओं के बारे में जानकारी संवेदी विशिष्ट thalamic और cortical क्षेत्रों से अनुमानों के माध्यम से प्रमस्तिष्कखंड तक पहुँचता है। basol के पार्श्व भाग (LA) में न्यूरॉन्स के लिए इन सूचनाओं के plasticityateral प्रमस्तिष्कखंड (बीएलए) अंतर्निहित डर कंडीशनिंग 9,18 एक महत्वपूर्ण तंत्र है। बढ़ती सबूत पता चलता है कि प्रमस्तिष्कखंड में समानांतर प्लास्टिक प्रक्रियाओं डर स्मृति 19 को नियंत्रित करने के निरोधात्मक तत्वों को शामिल करना। संकुल निरोधात्मक न्यूरॉन्स के एक समूह ने GABAergic औसत दर्जे का paracapsular intercalated कोशिकाओं (mpITCs) कर रहे हैं, लेकिन उनकी सटीक कनेक्टिविटी और समारोह अधूरे 20-22 समझा जाता है। इधर, optogenetic सर्किट मानचित्रण प्रदर्शन है कि mpITCs thalamic और cortical रिले स्टेशनों 23 से प्रत्यक्ष संवेदी इनपुट प्राप्त करते हैं, इन कोशिकाओं के अभिवाही और अपवाही कनेक्टिविटी और प्रमस्तिष्कखंड में लक्ष्य न्यूरॉन्स पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। mpITCs या बीएलए न्यूरॉन्स में Chr के विशिष्ट अभिव्यक्ति स्थानीय बातचीत की मैपिंग की अनुमति देता है कि खुलासा, mpITCs रोकती हैं, लेकिन यह भी परस्पर द्वारा, बीएलए प्रिंसिपल न्यूरॉन्स सक्रिय कर रहे हैं, उन्हें प्रभावी ढंग से कि बीएलए गतिविधि को नियंत्रित उपन्यास फ़ीड आगे और प्रतिक्रिया निरोधात्मक सर्किट में रखकर23।
इस प्रोटोकॉल तंत्रिका सर्किट और स्थानीय कनेक्टिविटी आसानी से अधिकांश पर लागू किया जा सकता है कि नहीं तो सब के पूर्व vivo optogenetic जांच के लिए एक विधि का वर्णन है, उन्हें एक ~ 470 एनएम epifluorescence प्रकाश बंदरगाह पर ए?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Cora Hübner and Andrea Gall for help in acquiring some of the representative results. This work was supported by the Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) at the University of Tuebingen, an Excellence Initiative funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the framework of the Excellence Initiative (EXC 307), and by funds from the Charitable Hertie Foundation.
Surgery | |||
Stereotactic frame | Stoelting, USA | 51670 | can be replaced by other stereotactic frame for mice |
Steretoxic frame mouse adaptor | Stoelting, USA | 51625 | |
Gas anesthesia mask for mice | Stoelting, USA | 50264 | no longer available, replaced by item no. 51609M |
Pressure injection device, Toohey Spritzer | Toohey Company, USA | T25-2-900 | other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used |
Kwik Fill glass capillaries | World Precision Instruments, Germany | 1B150F-4 | |
Anesthesia machine, IsoFlo | Eickemeyer, Germany | 213261 | |
DC Temperature Controler and heating pad | FHC, USA | 40-90-8D | |
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 | Sutter Instruments, USA | P-1000 | |
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 | Melag, Germany | 08754200 | |
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-26973P | |
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9) | Penn Vector Core, USA | AV-9-20938M | |
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1) | Penn Vector Core, USA | AV-1-20298P | |
fast green | Roth, Germany | 0301.1 | |
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) | CP Pharma, Germany | ||
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) | Purdure Products, USA | BSOL32 | can be replaced by other disinfectant |
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) | Boehringer Ingelheim, Germany | can be replaced by other analgesics | |
Bepanthen eye ointment | Bayer, Germany | 0191 | can be replaced by other eye ointment |
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) | Nouvag, Switzerland | ||
Sutranox Suture Needle | Fine Science Tools, Germany | 12050-01 | |
Braided Silk Suture | Fine Science Tools, Germany | 18020-60 | |
Recordings, light stimulation, and analysis | |||
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) | for composition see references #16 and #23 | ||
internal patch solutions | for composition see references #16 and #23 | ||
MagnesiumSulfate Heptahydrate | Roth, Germany | P027.1 | prepare 2M stock solution in purified water |
Slicer, Microm HM650V | Fisher Scientific, Germany | 920120 | |
Cooling unit for tissue slicer, CU65 | Fisher Scientific, Germany | 770180 | |
Sapphire blade | Delaware Diamond Knives | custom order, inquire with company | |
Stereoscope, SZX2-RFA16 | Olympus, Japan | ||
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) | Lumen Dynamics Group, Canada | 2012-12699 | |
Patch microscope, BX51WI | Olympus, Japan | ||
Multiclamp 700B patch amplifier | Molecular Devices, USA | ||
Digitdata 1440A | Molecular Devices, USA | ||
PClamp software, Version 10 | Molecular Devices, USA | used to control data acquisition and stimulation | |
Bath temperature controler, TC05 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 500 0145 | |
Three axis micromanipulator Mini 25 | Luigs & Neumann, Germany | 210-100 000 0010 | |
Micromanipulator controller SM7 | Luigs & Neumann, Germany | 200-100 900 7311 | |
glass capillaries for patch pipettes | World Precision Instruments, Germany | GB150F-8P | |
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber | Satorius Stedim Biotech, Germany | 13006–50—-ACN | |
LED unit, CoolLED pE | CoolLED, UK | 244-1400 | CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation |
CoolLED 100 Dual Adapt | CoolLED, UK | pE-ADAPTOR-50E | |
LED unit, USL 70/470 | Rapp Optoelectronic | L70-000 | |
Dual port adapter | Rapp Optoelectronic | inquire with company | |
Filter set red (excitation) | AHF, Germany | F49-560 | Filters can be bought as set F46-008 |
(beamsplitter) | AHF, Germany | F48-585 | |
(emission) | AHF, Germany | F47-630 | |
Filter set green (excitation) | AHF, Germany | F39-472 | Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission) |
(beamsplitter) | AHF, Germany | F43-495W | |
(emission) | AHF, Germany | F76-490 | |
LaserCheck, handheld power meter | Coherent, USA | 1098293 | |
IgorPro Software, Version 6 | Wavemetrics, USA | for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used | |
Neuromatic suite of macros for IgorPro | http://www.neuromatic.thinkrandom.com | ||
Post hoc analysis of injections and projections | |||
Paraformaldehyde powder (PFA) | Roth, Germany | 0335.2 | |
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain | Invitrogen | N-21479 | |
agar-agar for embedding and resectioning | Roth, Germany | 5210.3 | |
30 x 10 mm petri dishes for embedding | SPL Life Sciences | alternatives can be used | |
Slides, Super Frost | R. Langenbrinck, Germany | 61303802 | alternatives can be used |
cover slips | R. Langenbrinck, Germany | 3000302 | alternatives can be used |
Vecta Shield mounting medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | alternative mounting media can be used |
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation | Satorius Stedim Biotech, Germany | 11406–25——N | |
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 | Zeiss, Germany |