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Neuroscience

뇌 조각의 공포 회로의 예 생체 Optogenetic 해부

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

Optogenetic 방법이 널리 신경 활동을 조작하고 뇌 기능에 대한 영향을 평가하기 위해 사용된다. 여기서, 기술은 광학 활성 Channelrhodopsin의 생체 내 발현에 두려움 관련 회로의 특정 장거리 및 지역 신경 연결의 시냅스 속성의 생체 분석을 위해 수 있다는 설명이다.

Abstract

Optogenetic 방법이 널리 빛에 의해 빛 활성화 단백질과 신경 활동의 후속 조작의 대상으로 표현을 결합하여 신경 인구 및 회로의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. Channelrhodopsins (CHRS)는 빛 문이 양이온 채널이며 형광 단백질에 융합 할 때 자신의 표현은 시각화 및 특정 세포 유형의 동시 활성화와 뇌의 정의 된 영역에서의 축삭 돌기 수 있습니다. 바이러스 벡터의 정위 주사 통해 CHR 융합 단백질을 구성 적 또는 조건 적으로 정의 된 뇌 영역의 특정 세포에서 발현 될 수 있고, 자신의 축삭 돌기이어서 뇌 조각의 생체 optogenetic 활성화를 통해 해부학 적 및 기능적으로 연구 될 수있다. 종래의 전기 자극 방법으로 해결 될 수없는 시냅스 연결의 특성을 이해하는 것을 목표로 할 때, 또는 새로운 원숭이를 식별하는데 특히 중요임대 및 이전에 제대로 이해하고 원심성 연결. 여기 몇 가지 예는이 기술이 편도체에 공포 관련 회로를 해명에 이러한 질문을 조사하기 위해 적용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 편도체는 공포와 감정적 인 기억의 수집 및 두려움의 표현 및 저장을위한 핵심 영역이다. 증거의 많은 라인은 내측 전두엽 피질 (mPFC)이 두려움 수집 및 멸종의 다양한 측면에 참여하지만, 편도선과의 정확한 연결은 단지 이해되기 시작하는 것이 좋습니다. 생체 활성화 optogenetic 편도는 기저 (BLA)에 mPFC 구심과 목표 셀 간의 통신 시냅스의 양상을 연구하기 위해 사용하는 방법 먼저, 도시된다. 또한,이 생체 optogenetic 접근법 편도선에 GABA 성 뉴런의 그룹을 사용하여 신규 접속 패턴을 평가하기 위해 적용 할 수있는 방법을 도시하고, 예로서 paracapsular 인터 셀 클러스터 (mpITC).

Introduction

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시각화 및 뇌 영역 및 신경 세포의 특정 유형과 특정 연결의 동시 활성화를위한 정확한 도구는 기능 연결 기본 건강한 뇌 기능과 질병 상태를 이해하는 데 더 중요 해지고있다. 이상적으로,이 신경 세포 통신 확인되는 정확한 시냅스 속성의 생리 학적 조사를 수반한다. 이는 단일 급성 뇌 조각에 보존 할 수없는 뇌 영역 간의 연결에 특히 사실이다. 과거에는 주로 별도 실험에서 달성되었다. 한편, 신경 추적자 주입 생체 후속 광 또는 사전 및 시냅스 파트너 전자 현미경 분석과 함께 사용되어왔다. 원래 영역에서 섬유 책자가 보존되고, 슬라이스 조제에서 액세스하는 경우 한편, 전기 자극은 대상 영역의 세포와 시냅스 통신 메커니즘을 평가하기 위해 사용되어왔다.

자신의 시각화 및 사후 해부학 적 분석 1을 허용하면서 optogenetics의 출현으로, 같은 형광 단백질에 융합 Channelrhodopsins (CHRS)와 같은 빛 문이 양이온 채널의 대상으로 표현, 지금은 신경과 축삭 궤적의 활성화를 가능하게 4. 섬유 책자가 특정 궤도를 분리하지 않거나 때문에, 1) 기존의 전기 자극에 액세스 할 수 없다는 뇌 영역에서의 입력을 평가 : 부모 인 somata 5에서 절단 할 때 CHR 발현 축색 돌기도 자극 할 수 있기 때문에 뇌 조각에서 가능하다 불명이고; 2) 명백하게 가정하지만 불완전하게 이해하고 특정 입력에 대한 기원의 영역을 식별; 3) 로컬 및 장거리 예측에 정의 된 세포 유형 사이의 기능적 연결을 조사합니다. 이 때문에 다수의 장점의 뇌 슬라이스 회로 optogenetic이 매핑은 전체되었다LY은 지난 몇 년 동안 사용하고, 형광 태그 CHRS의 발현에 대한 바이러스 벡터의 다양한 상용 공급 업체에서 쉽게 사용할 수 있습니다. 전기 자극은 또한 통로 또는 주변의 다른 세포와 똑같이 신속하고 일시적으로 정확한 자극의 섬유를 보충 할 수 있기 때문에 기존의 전기 자극을 통해 optogenetic 활성화의 일부 주요 장점으로 인해 자극 전극, 섬유 자극의 특이성의 배치로 조직에 손상이 없습니다. 또한, 바이러스 벡터의 정위 주사 용이 Cre 호텔 의존성 발현 및 / 또는 특이 적 프로모터 (7)을 이용하여 달성 될 수있는 특정 뇌 영역 (6) 조건 또는 세포 타입 특이 적 발현을 타겟팅 할 수있다. 여기,이 기술은 두려움 시스템에서 장거리의 매핑 및 로컬 회로에 적용된다.

편도체는 공포와 감정적 인 기억 8,9의 수집 및 두려움의 표현 및 저장을위한 핵심 영역이다. 외에도 이리저리편도을 해요, 내측 전두엽 피질 (mPFC)와 해마 (HC)는 왕복 편도에 연결되어있는 구조는, 공포와 멸종 메모리 10, 11의 수집, 통합 및 검색의 측면에 연루되어있다. mPFC의 하위 활동은 12, 13를 말한다 높고 낮은 두 두려움을 제어 이중 역할을 할 것으로 보인다. 이것은 부분적으로 편도체의 활동과 출력을 제어 할 편도체에 mPFC에서 직접 연결에 의해 매개 될 수있다. 따라서, 최근 몇 년 동안, 여러 연구에서 편도 14-17 mPFC 구심 특정 대상 세포와 시냅스 상호 작용을 조사하기 위해 생체 슬라이스 실험을 시작했다.

공포 학습하는 동안, 에어컨과 무조건 자극에 대한 감각 정보는 특정 시상과 대뇌 피질의 영역에서 전망을 통해 편도에 도달한다. basol의 측면 부분 (LA)에있는 뉴런이 입력의 소성ateral 편도체 (BLA)는 공포 조건화 9,18의 기초가 중요한 메커니즘이다. 증가 증거는 편도에 평행 플라스틱 프로세스가 공포 메모리 (19)를 제어 할 저해 요소를 포함 할 것을 제안합니다. 클러스터 억제 뉴런의 그룹은 GABA 성 중간 paracapsular 인터 셀 (mpITCs)하지만 자신의 정확한 연결 및 기능은 불완전 20-22을 알 수있다. 여기에, optogenetic 회로 매핑은 mpITCs가 시상과 대뇌 피질의 중계국 (23)에서 직접 감각 입력을받을 것으로 보여, 구 심성 및 원심성 이러한 세포의 연결 및 편도의 대상 신경 세포에 미치는 영향을 평가하는 데 사용됩니다. mpITCs 또는 BLA 뉴런에 CHR의 특이 적 발현을 효과적으로 BLA 활동을 제어하는​​ 새로운 피드 포워드와 피드백 억제 회로에 배치, mpITCs이 억제 것을 공개, 로컬 상호 작용의 매핑을 할 수 있습니다뿐만 아니라, 상호 BLA 교장 뉴런에 의해 활성화된다23.

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Protocol

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윤리 문 : 모든 실험 절차는 연구에 동물의 사용에 대한 EU 지침에 따라이었고, 지역 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (Regierungspräsidium 튀빙겐, 바덴 뷔 르템 베르크, 독일의 상태) 튀빙겐 대학에 대한 책임.

1. 정위 주입 절차

  1. 멸균기를 사용하여 멸균 도구 (가위, 메스, 클램프, 드릴, 바늘, 봉합 재료)를 준비합니다. 이러한 무균 수술 드레이프에 멸균면 교환, 소독, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS, pH를 7.4), 및 H 2 O 2와 같은 살균 도구 및 기타 필요한 솔루션 및 수술 용품을 정리하십시오.
  2. 제조업체의 지침에 따라 수평 미세 전극 풀러에 3 mm 폭 상자 필라멘트를 사용하여 주사에 대한 유리 Micropipette과 (그림 1A, 삽입)을 당깁니다.
    주 : 깊은 주사제, 전극 테이퍼가 충분히 있어야복부 대부분의 좌표에 도달 할 길이 (약 5mm;. 좌표를 들면, 1.10 참조).
  3. 프리믹스 바이러스 솔루션의 1 μL 멸균 PBS에서 0.1 % 빠른 그린 솔루션의 0.2 μL (유리 피펫의 솔루션의 더 나은 가시성). 좋은 팁 (그림 1A, 삽입)와 마이크로 리터 피펫을 사용하여 바이러스 솔루션과 빠른 녹색의 혼합물로 유리 피펫을 입력합니다.
    참고 : 재조합 아데노 관련 바이러스 성 벡터 (rAAV)와 협력은 바이오 안전성 레벨 1 (BSL 1) 작업으로 간주하고 BSL (1) 실험실에서 수행 될 필요가있다. 이 연구 (그림 1C)에 사용 rAAVs이 있었다 : 1) mPFC : rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (혈청 형 2/9) (16) 2) MGM / PIN : rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (혈청 형 2/9) (23); 3) mpITC / BLA : rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (혈청 형 2/1) (23)
  4. 작은 동물의 마취 기계 (: 유도 산소 3 % 아이소 플루 란)를 사용하여 마우스를 마취.
    참고 :이 연구에 사용 된 마우스를 4이었다 -7 주 다음과 같은 균주 및 유전자형 (도 2A3A-D에서 실험) C57BL6 / J 야생형; GAD67-GFP (24) (도 2b3E-H의 실험); Tac2-Cre 호텔 (25) (도 2C3I-J에서 실험).
  5. 귀와 눈 사이의 머리를 면도. 면봉을 사용하여 면도 헤드 살균제 (기반 프로 비돈 요오드)를 적용합니다.
  6. 마취 동안 눈의 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 적용합니다. 피하 진통로 (멜 록시 캄 계, 0.1 ml의 5 ㎎ / ㎖ 용액)를 주입 마우스.
  7. (: 유지 보수를 위해 산소의 2 % 아이소 플루 란) 정위 프레임 (그림 1A)에 마우스를 올려 놓고 가스 마취 마스크를 통해 마취를 유지한다. 계속하기 전에 사지 철수 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다.
    참고 : 전체 수술시 무균 조건뿐만 아니라 수를 유지; 일회용 안면 마스크를 착용, 수술 이동, 장갑 WN.
  8. 가위를 사용하여 머리의 상단에 피부 절개를합니다. 부드럽게 H 2 O 2와 두개골 표면, 청소 두개골을 노출 클램프로 고정, 무딘 집게를 사용하여 옆으로 피부를 당기십시오.
  9. 두 반구 (그림 1B)에 대한 좋은 팁 영구 마커 및 드릴 구멍을 사용하여 두개골에 마크 주사 부위. mPFC :이 연구에서 주사 (브레 그마 (mm)에서)입니다 좌표 전방 1.9, 0.3 ± 측면, 복부 2.1; MGM / PIN : 1.8 ± 측면, 3.0 뒤, 복부 3.8; mpITC / BLA : 3.35, 및 4.75 복부 ± 측면, 1.45 후방.
  10. 가압 주입 장치에 접속 정위 프레임에 채워진 유리 피펫 마운트 정수리 위치로 피펫을 가져온다.
  11. 미세 스트레이트 팁 집게를 사용하여 유리 피펫의 팁을 끊다. 바이러스 솔루션의 에어로졸 발생을 방지하기 위해 부드럽게이 작업을 수행합니다. 피펫 팁 몇 압력 펄스를 적용하고 비루 한 방울의 압출을 관찰하여 열려 있는지 확인합니다의 솔루션입니다.
  12. 원하는 주입 좌표로 이동하여 압력 분사 장치에서 다음 설정을 사용하여 피펫 콘텐츠 (~ 0.5 μL)의 절반을 주입 : 압력 : 20 psi의 평균 펄스 길이 : 30 밀리 초, 펄스의 평균 : 50.
  13. 를 후퇴 천천히 (1mm / 분) 전 ~ 1 분 동안 장소에서 피펫을 둡니다.
    참고 : 확인 피펫 다른 반구에 같은 피펫 절차를 반복하기 전에 차단되지되어 있는지 확인합니다. 차단 된 팁의 경우 청소하거나 다시 브레 그마에 팁과 제로 피펫 위치를 끊다.
  14. PBS (산도 7.4) 청소 두개골, 부드럽게, 클램프를 제거 함께 피부를 당겨, 개별 버튼 봉합과 절개 봉합 (3-4 노트). 상처 주위에 살균제 (기반 프로 비돈 요오드)를 적용합니다.
  15. 마취를 중지하고 완전히 깨어 때까지 무인 마우스를 두지 마십시오. 단일 보관되어 유지 또는 완전히 회복 만 다른 동물의 회사에 반환합니다. 수술 후는 건강 상태를 지속적으로 모니터링하고, adminis터 진통 필요한 경우. 지역 동물 관리 및 사용위원회가 제시 규칙에 따라 절차를 따르십시오.

급성 조각 2. 준비

  1. ACSF, 절단 솔루션, 도구 (가위, 메스, 집게, 주걱, 파스퇴르 피펫), 한천 블록을 준비합니다.
    참고 : 인공 뇌 - 척수 (ACSF)의 1 L 실험마다 필요하며, 이전에 16,23을 발표 한 두 번 증류 H 2 O에 화학 물질을 용해시켜 제조한다. 절단 용액을 2 M 황산 원액 0.87 ㎖로 ACSF 200 ㎖를 보충하여 제조된다.
  2. 네이트 ACSF와 95 % O 2 5 % CO 2와 실험을 통해 절단 솔루션입니다.
  3. 깊이 이소 플루 란을 이용하여 작은 동물 마취기 (산소 3 %)를 사용하여 마우스를 마취. 계속하기 전에 사지 철수 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인합니다.
  4. 큰 가위를 사용하여 마우스를 목을 벨 즉시 진정얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 머리.
  5. 꼬리에서 주동이와 하나의 중간 선 절개를 엽니 다 두개골 부드럽게 집게를 사용하여 측면에 두개골 조각을 밀어 넣습니다. 빠르게 부드럽게 작은 둥근 주걱을 사용하여 두개골 밖으로 들어 올려 머리를 제거합니다. 메스와 소뇌를 잘라. 얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 머리를 놓습니다.
  6. mPFC 주입 사이트 (mPFC 포함) 메스를 사용하여 뇌의 앞쪽 부분을 잘라 슬라이스 때까지 얼음처럼 차가운 절단 솔루션에 넣어.
  7. 여과지로 과잉의 절단 용액을 제거하고 vibratome 스테이지 상 뇌의 후방 부를 접착제.
  8. 기울어 진 편도 슬라이스를 들어, 35 ° 각도 (그림 1D, 중간)에 한천 블록 (4 %) 인하에 뇌 접착제. 관상 편도 조각, MGM / PIN 주입 사이트 및 mPFC 주입 사이트의 경우 (그림 1D가, 왼쪽 및 오른쪽) 무대에서 직접 뇌를 붙입니다. 슬라이스 동안 안정성을 위해 뇌 뒤에 추가 한천 블록을 배치합니다.
  9. PLAC냉각 장치를 사용하여 39 ° C로 유지 빙냉 산소 절단 용액 챔버 절삭 E 단계. 사파이어 블레이드를 사용하여 편도체 (320 μm의)의 급성 슬라이스를 준비합니다. 실온에서 산소 ACSF와 함께 제공되는 인터페이스 챔버에서 슬라이스를 놓습니다.
  10. 45 분 - 급성 편도 조각의 준비를 한 후, 35 조각을 복구하기 위해 36 ° C에서 수조의 인터페이스 챔버를 배치합니다. 이어서, RT에 인터페이스 챔버를 반환한다. 이 조각에서 녹화를 들어, 단계 3.2를 진행합니다.
  11. 급성 편도 슬라이스 (- 2.9 2.8 단계)에 대해 전술 한 바와 같이 단계 2.10의 시작 동안, 주사 부위의 조각을 잘라. 수조에서 조각의 복구는 여기에 필요하지 않습니다. 선택 사항 : 빠르게 주사 부위의 위치를​​ 추정 형광등 적절한 필터 세트를 구비 입체경에 조각을 관찰.
  12. 이 필터 서류 및 submer 사이를 끼워 혹 사후 분석을 위해 주사 부위를 포함하는 슬라이스를 수정PBS 용액에서 O / N의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)에서 그들을 카. 주사 부위의 분석을 위해 단계 4.1를 진행합니다.

시냅스 섬유 3. 시각화 및 자극

  1. 섬유와 세포의 optogenetic 활성화를위한 패치 현미경을 준비 :
    1. 빛 전달 경로 상에 장착 된 발광 다이오드 (LED)를 중심으로.
    2. 후 초점면에서 470 nm의 적절한 파장을 선택하는 전력 측정기와 각 목적의 출력에서​​의 LED의 광 강도를 측정한다.
    3. mW의 / mm 2의 빛의 세기를 계산하고 470 nm 파장에 대한 측정 값에 대한 각각의 목적에 대해 (광 출력 (MW / mm 2) 대 LED 강도 (%)) 검량선을 작성합니다.
  2. 형광 램프를 구비 한 수직 현미경에 장착 슬라이스 챔버 내의 인터페이스 챔버 장소에서 급성 편도선 슬라이스 검색. SLIC가 같은 조각의 위치를​​주의하십시오인터페이스 챔버 위로 향하게 E면은 상기 기록 챔버 내에서 위로 향하게된다. ~ 31 ° C의 온도에서 2 ㎖ / 분 - 1의 비율로 신선한 산소 ASCF와 슬라이스 관류.
  3. 발현 특정 형광 단백질에 적합한 필터 세트와 함께 상기 형광 램프를 사용하여 슬라이스 내의 연접 섬유를 관찰한다. 개요 (그림 1E), 대상 지역 내의 섬유 밀도의 평가를위한 60 배 목표를 얻기 위해 5 배 목표를 사용합니다.
    GFP 및 YFP를 들어, 사용 필터는 지정된 mCherry는 "빨간색"(여진 40분의 560, 빔 스플리터 (585), 배출 70분의 630)를 설정 필터를 사용하기위한 "녹색"(여진 20분의 472, 빔 스플리터 (495), 배출 (490) LP)로 설정 : 참고 재료 / 장비 테이블입니다.
  4. 열거 나 실험 (그림 2D)에 대해 원하는대로 현미경 빛의 경로에서 조리개를 제한 할 수 있습니다.
  5. 패치 녹음을 얻으려면, 내부 솔루션 패치 피펫을 작성하고 난 마운트n 개의 전극 홀더. 패치 피펫에 긍정적 인 압력을 적용 천천히 미세 조작기를 사용하여 슬라이스로 시각적 통제하에 먼저 목욕 솔루션으로 다음을 낮 춥니 다.
    1. 측면과 상단에서 패치 피펫 관심의 신경 세포에 접근. 피펫 (세포 표면에 딤플 표시) 세포의 표면 상에있을 때 양의 압력을 해제하고 부압을 적용하여 "기가 시일"를 얻었다.
    2. 전 세포 기록을 얻기 위해, 막 패치 파열 상기 흡입을 적용한다. 이어서, 셀의 전기 응답을 기록하는 동안 CHR (470 나노 미터)를 활성화시키기위한 적절한 파장을 사용하여 접속 된 LED 표지 섬유를 자극한다.
    3. 시냅스 자극 낮은 LED 휘도 시작하여 원하는 시냅스 전류 진폭에 도달 할 때까지 증가한다. 상기 타이밍 펄스 길이를도에서 (예를 제어하기 위해 상기 데이터 수집 소프트웨어에 디지털 출력을 구성하여, LED 트리거3).
      주의 : 다른 소프트웨어 및 / 또는 TTL 발생 장치는 LED 트리거 할 수있다.
  6. 및 / 또는 특정 약물의 존재 하에서 그 다음에 기록 된 셀에 대한 원하는 현미경 광 통로의 개방 또는 제한 개구 (단계 3.4)을 반복 자극.
  7. 기록 후,이 필터 종이 사이를 사이에두고 4 % PFA O / N에서 그들을 잠수하여 혹 사후 분석을위한 슬라이스를 수정합니다.
  8. 전기 생리 데이터를 분석 할 수 있습니다.
    참고 : 사용하여 해당 소프트웨어는 각각의 자극 오프라인 기록 된 스윕 데이터를 시각화 할 수 있습니다. 약물의 효과를 분석 할 때, 모든 개별 스윕에 대한 시냅스 전류 진폭에 약물 효과의 시간 경과를 얻기 위해 피크 검출 루틴을 사용합니다. 약물의 효과는 정상 상태에 도달 할 때 결정합니다. 실험 조건 당 평균 ≥10 개별 스윕에 소프트웨어를 사용, 인물에 대한 대표적인 평균 응답을 준비하는 CF (그림 3B-D, FH, J 오른쪽 패널).
    주 : 여러 대안적인 소프트웨어 패키지가 데이터 분석에 사용될 수있다.

사출 사이트 4. 사후 분석

  1. 및 (재 이미징 단계 3.7에서, 원하는 경우) PBS에 세 번 사이트를 기록한다 (단계 2.12에서) 주사 부위의 조각을 씻으십시오. 이 반복을 10 분 동안 회전 진탕 기에서 신선한 PBS로 3 회 용액을 대체함으로써 수행된다.
  2. PBS의 2 % 한천 솔루션을 준비하고 ~ 65 ° C로 냉각 할 수 있습니다. 작은 30mm 직경의 페트리 접시의 바닥에 평평하게 배치 조각, 한천 슬라이스를 포함하고 고체까지 냉각 할 수 있습니다.
  3. vibratome의 무대에 내장 된 조각 또는 조각으로 한천 블록 접착제 및 PBS와 실을 절단 무대를 놓습니다.
  4. 절제술 70 μm의 두께로 슬라이스를 포함. 옵션 : resectioning 후, 조각은 cytoarchitecture (그림 3A, C)를 공개 Neurotrace으로, 즉, 스테인드 할 수 및 / 또는 bYFP 또는 mCherry에 대한 y를 면역 형광 염색은 CHR 융합 단백질의 신호를 증폭한다.
  5. 설치 미디어 슬라이드와 커버 슬립에 산 조각. 이미지 주사 부위와 원하는 경우, 형광 현미경 또는 공 초점 레이저 주사 현미경 (도 2A-C)를 이용하여 투영 영역에있는 섬유를 함유 또한 이미지 조각.

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Representative Results

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이 섹션에서는 감각과 조절 성 BLA에 대한 장기 계획과 mpITC 신경 세포뿐만 아니라 mpITC와 BLA 사이의 로컬 연결의 속성의 생리 학적 특성을 조사하기 위해 체외 optogenetic 접근 방법과 다른 실험적인 전략에서 대표적인 결과의 워크 플로우를 보여줍니다.

마우스의 뇌에 원하는 좌표 선택된 바이러스 벡터의 정위 주사 후 (도 1A-C 바이러스 발현 시간 2~6주은 실험에 따라), 편도의 주사 부위와 투영 영역의 급성 뇌 조각은 제조 패치 클램프 실험 및 주사 부위 (그림 1D)의 혹 사후 분석을 위해 주입 된 뇌 영역에서 적절한 각도로. 녹음 및 optogenetic 자극, 형광 표지 된 세포 또는 축삭 프로를 시작하기 전에대상 영역 (편도선)에서 용 돌기가 부착 된 형광 램프 (도 1E)를 이용하여 패치 클램프 기록을위한 직립 현미경 검사한다. 시점, 기간, 및 펄스 길이는 발광 다이오드 (LED)를 트리거 패치 소프트웨어를 통해 제어하면서, 슬라이스의 투영 영역에서의 추정 대상 셀로부터 기록 패치 클램프를 획득하면, 광 자극이 개시된다. 실험 전략에 따라 (도 2A-C는 오른쪽) 형광 경로의 개구가 완전히 개방되거나 (도 2D) 제한하거나. 펄스의 길이가 일정하고 가능한 한 짧게 유지하면서 (이상적 ≤1 밀리 초), LED 출력 강도는 서서히 특정 실험 (도 2E)의 시냅스 반응의 원하는 진폭을 얻기 위해 요구되는 강도를 평가하기 위해 증가된다. 녹화 후, 편도 슬라이스 후 고정합니다. resectioning 및 선택시염색 주입 및 기록 위치가 주입 위치를 확인하고 잘못 주사 데이터를 제외하는 공 초점 현미경에 이미징된다. 주사 부위의 이미지 세 가지 실험 전략 편도의 관련 축삭 돌기 (BLA에 mPFC 입력, mpITCs에 시상 입력, 지역 mpITC 활성화) 그림 2A-C에 표시됩니다.

그림 3은 사용 된 다른 실험적인 전략 광 유발 반응의 특성 (그림 3A, E, I)을 설명 BLA 주요 신경 세포에서 얻은 대표적인 기록 결과, 지역 BLA의의 interneurons 및 mpITC 뉴런을 보여줍니다. 기록 GABA 성 신경 세포 (지방의 interneurons 및 mpITCs)을 대상으로, GAD67-GFP 기자 마우스 (24)를 사용 하였다. mPFC 감각 시상 돌기를 들어, 시냅스 전달의 여러 측면을 연구 할 수있다. 교류의 시간 정밀도tivati​​on 본 연구에 사용 된 CHRS의 운동 특성은 50 밀리의 간 자극 간격으로 한 쌍의 펄스로 안정적인 자극을 가능하게한다. 이 투영 및 표적 세포 유형에 따라 용이하게하거나 누름 수 및 시냅스 전 방출 확률의 지표 (도 3b, F, H)이 될 수 어느 시냅스 전류 (PSC를)의 한 쌍의 펄스 비율 (PPR)의 분석을 허용 . 또한 시냅스 지연 분석 다른 시냅스 반응 성분의 박리 가능하다.

이 예에서, 흥분성 PSC (EPSC) 구성 요소에 비해 억제 PSC (IPSC)의 긴 대기 시간은 disynaptic 및 monosynaptic 입력 각각 (그림 3C)를 나타냅니다. 다른 경우, 이러한 응답 지터 또는 응답 크기의 분산 계수와 같은 추가 EPSC 속성의보다 철저한 분석의 모노 또는 disyna에 결론을 도출하는 데 필요한 수있다PTIC 자연 17,23. 또한, 특정 수용체에 대한 약리학 적 차단제의 응용 프로그램이 PSC를의 본질을 식별 할 수 있습니다 (즉, 글루타메이트의 EPSC 및 GABA 성 IPSC, 그림 3C-D). 예상대로 늦은 성분 GABA 성이었다 반면 상기 mPFC 입력의 초기 성분 글루타메이트이었다. 글루타메이트 수용체 차단제 CNQX와 모두 EPSC 및 IPSC의 전체 블록은 또한 IPSC는 disynaptic 것을 지원합니다. optogenetically 활성화 섬유에서 시냅스 전달의 변조를 조사하기 위해, 진폭 및 PPR에 대사성 수용체 작용제와 길항제의 효과 (여기에서 GABA의 B 수용체는) 사전 및 시냅스 사이트에의 영향을 평가하기 위해 평가 될 수있다. 이 예에서, PPR의 증가에 수반하는 진폭의 감소는 광 활성화 섬유 (3G, H)의 연접 변조를 나타낸다. 마지막으로, 편도 세포의 국소 작용을 평가할 수있다, 예를 들면,Tac2 프로모터 (25)의 제어하에 CRE 명시 마우스를 더블 floxed CHR 발현하는 바이러스 벡터 (그림 1C)를 주입 할 때. Tac2 따라서는, CHR는 mpITC 중앙 편도 (도 2C)로 표현되기 때문에, 광 활성화는 형광 통로 개구 (도 2D)를 닫아 mpITC 제한되었다. 이러한 조건 하에서, 광 유발 활동 전위 감염된 mpITCs에서 유도 될 수있다. BLA에서 짧은 대기 시간을 억제 시냅스 응답은 mpITC 및 BLA 주요 신경 세포들 사이의 기능 억제 연결의 존재를 나타냅니다.

그림 1
그림 1. 정위 주사, 급성 뇌 조각의 준비, 그리고 시냅스 섬유의 시각화. (A, B) 정위 바이러스 주입입니다. 두개골와 정위 프레임에 배치 마취 된 마우스의) 사진은 노출과주입 피펫. 삽입 : 빠른 그린과 혼합 바이러스 솔루션으로 가득 주입 피펫의 그림에서 확대합니다. 스케일 바 : 3mm. 다른 주입 영역에 대한 드릴 구멍의 표시 위치와 마우스 두개골의 (B) 도식. (C) 방식이 연구에 사용 된 다른 바이러스의 구조를 도시. 어두운 회색 : 프로모터 서열; 블루 : Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); 빨강, 녹색 / : 형광 단백질. mPFC와 MGM / PIN의 전망에 대한 육주 - 발현 시간은 현지 편도 예측을위한 이주와 4이었다. 급성 뇌 조각의 (D) 준비 : 계획은 다른 주사와 투사 영역에서 조각을 얻기 위해 슬라이서 무대에서 마우스 뇌의 배치를 보여주는. (E) MGM / PIN에 ChR2-mCherry 바이러스에 주입 된 GAD67-GFP 마우스에서 급성 뇌 조각에서 섬유의 시각화. 사진은 다른 필터 세트와 수직 패치 현미경 촬영 : GAD67-GFP 발현, 중간; MGM / PIN 섬유 MC로 표지herry, 맞다. 스케일 바 : 200 μm의. mPFC, 내측 전두엽 피질; mpITC, 중간 paracapsular 인터 셀; BLA, 기저 편도; MGM, 중간 geniculate 핵, 중간 부; PIN, 시상 핵 intralaminar 후방; LA, 측면 편도; BA, 기초 편도; CEA, 편도의 중심 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 사출 사이트, 프로젝션 분야 및 축삭 계획의 Optogenetic 자극. (AC)를 BLA 대표 주사 부위 및 투영 영역의 공 초점 이미지 및 실험 전략 계획. 왼쪽 (A) : Neurotrace 물들 C57BL / 6 마우스에서 mPFC 주입 사이트. 스케일 바 :500 μm의. 중동 : 기울어 진 편도 슬라이스에서 BLA의 돌기에 대응. 스케일 바 : 200 μm의. 오른쪽 : mPFC 예측 및 BLA에서 신경 세포의 녹음의 전체 필드 조명의 도식. 왼쪽 (B)하십시오 GAD67-GFP 마우스의 MGM / PIN 주입 사이트. 스케일 바 : 500 μm의. 중동 : 코로나 편도 슬라이스의 mpITC과 LA에 대응 전망. 스케일 바 : 200 μm의. 우 버튼 : mpITC 신경 세포의 MGM / PIN의 계획과 기록의 전체 필드 조명의 도식. 왼쪽 (C)하십시오 Tac2-Cre 호텔 마우스의 Neurotrace 스테인드 편도 슬라이스에서 ChR2 - YFP의 로컬 식입니다. 스케일 바 : 200 μm의. 삽입 : 줌 ChR2 - YFP을 표현 mpITCs의입니다. 스케일 바 : 20 μm의. 오른쪽하십시오 BLA 신경 세포의 mpITC 클러스터 및 기록의 제한 조명의 도식. 개방적이고 제한 조리개와 GAD67-GFP 마우스의 급성 뇌 조각에서 뉴런의 빛 전달 및 이미지 (mpITC 클러스터) 동안 챔버를 기록 (D) 사진진짜야. 스케일 바 : 30 μm의. 다른 LED 강도 (위)와 광 전력의 음모에 의해 유발 (E) 흥분성 시냅스 후 전류 (EPSCs)는 대 MGM / PIN에서 섬유의 optogenetic 활성화시 대표 mpITC 신경 세포에서 EPSC 진폭 (아래)을 유발. 스케일 바 : 100 PA / 10 밀리 초.
참고 :.도 2a를 참조 # 23 참조 # 16 및도 2c에서 수정 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
에 대한 실험적인 전략의 그림 장거리 및 지역 계획의 Optogenetic 활성화 3. 실시 결과. (A) 계획 (BD). (B)는 BLA 주요 신경 세포에서 기록 대표 EPSCs 및mPFC에서 섬유의 optogenetic 쌍 펄스 자극 (50 밀리 초 간 자극 간격)에 따라 BLA의 interneuron는 각각 펄스 촉진 및 쌍 펄스 우울증 짝을 유도. 스케일 바 : 100 PA / 25 밀리 초. mPFC에서 섬유의 (C) Optogenetic 활성화는 피드 포워드 억제를 유도한다. BLA 교장 신경 세포에서 (-70 MV에서) 대표 EPSC 및 (0 MV에서 IPSC) 억제 시냅스 전류 : 왼쪽. IPSC는 EPSC에 비해 더 긴 시냅스 대기 시간이 있습니다. 스케일 바 : 200 PA / 10 밀리 초 200 PA / 2 밀리 초. 오른쪽 : 빛은 더 IPSC의 disynaptic 성격을 지원의 AMPA / 발생한 kainate 길항제 CNQX (10 μm의)에 의해 차단 (-50 MV에서) 이상성 EPSC / IPSC 순서를 유발. 스케일 바 : 50 PA / 5 밀리 초. 채널 차단제 피크로 톡신 (PTX, 100 μM) 및 PTX + CNQX - Cl 획득하여 (-50 MV에서) EPSC / IPSC 시퀀스의 후속 블록 (D) 효과. IPSC는 PTX 및 CNQX에 의해 나머지 EPSC에 의해 차단된다. 스케일 바 : 50 PA / 5 밀리 초. (에 대한 실험적인 전략의 E) 제도 (FH). F)를 mpITC 및 MGM / PIN에서 섬유의 optogenetic 쌍 펄스 자극시 BLA 주요 신경 세포에서 기록 대표 EPSCs. 스케일 바 : 50 PA / 20 밀리 초. 다른 mpITC 신경 세포에서 (G) EPSCs 그들이 나트륨 채널 활동에 의존하는 것을 나타내는, 나트륨 채널 차단제 복어 독 (TTX, 0.5 μM)에 의해 차단된다. 스케일 바 : 50 PA / 20 밀리 초. (H) mpITC 뉴런에 시상 입력은 시냅스 GABA의 B 수용체에 의해 조절된다. 제어 상태에서 EPSCs의 GABA의 B 작용제 인 바클로 펜 (2 μM)의 적용시 한 쌍의 펄스 비율 EPSC 진폭 및 동반 증가의 감소, 두 진폭의 회복과 GABA의 B 길항제 CGP55845의 공동 응용 프로그램에 한 쌍의 펄스 배급 초기 (10 μM). 이러한 변화는 GABA B 수용체에 의해 시냅스 변조를 표시합니다. 스케일 바 : 50 PA / 20 밀리 초. (J)에 대한 실험 전략 (I) 제도. (J) mpITC 신경을 표현하는 ChR2 - YFP에서 기록 된 활동 전위를 빛 유발. 다른 유지 전위에서 BLA 교장 신경 세포에서 기록 된 빛 유발 IPSCs (-90, -70, -50, -20, 0 MV) (CL)에 대한 계산 된 평형 전위 주위 역 -. 스케일 바 : 20 MV / 100 밀리 초 10 PA / 10 밀리 초. 참고 :. 그림 3B-D는 참조 번호 16에서 수정도 3H 및 J 참조 번호 (23)로부터 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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이 프로토콜은 모든 경우 쉽게, 가장에 구현 될 수있는 신경 회로와 지역 연결의 생체 optogenetic 조사하는 방법을 설명은 표면 형광 빛 포트에서 LED가 ~ 470 nm의 그들을 무장하여 수직 조각 패치 클램프 기록 설정. 조각의 축삭 돌기의 optogenetic 자극의 가장 큰 장점은 해당 섬유 책자는 알려져 있지 명확하게 정의되지 않은, 또는에서 보존되지 않은 있기 때문에, 특정 활성화 및 기존의 전기 자극에 접근하지 않았다 연결의 특성 조사를 위해 수 있다는 것입니다 하나의 뇌 조각. 공포 회로에 대한 중요한 열쇠 예로서,이가 편도선에 mPFC 입력의 특성을 해부에 적용 할 수있는 방법이 도시되어있다.

비록 전기 섬유 요로 자극 광범위 이전 연구에 사용 된 경우, 이러한 책자가 종종 원래 상이한 영역으로부터의 섬유를 운반. 예를 들어, 학습을 두려워 관련 회로에서, 시상 핵 또는 대뇌 피질의 영역을 서로 다른 감각의 돌기는 각각 내부 및 외부 캡슐을 통해 혼합 된 실행합니다. optogenetic 자극의 장점은 한정된 영역에서의 섬유의 부분 집합의 선택적인 활성화를 가능하게한다는 것이다. 이것은 인터 셀 및 측면 편도 주요 세포 PIN 및 MGM에서 특정 시상 입력에 대해 설명한다. 또한, 전기 자극, 즉, 대상 영역의 로컬 연결을 할 수있는 자극 전극 근방의 통로 또는 셀의 다른 섬유의 활성화로 인한 문제를 극복 할 수있다. optogenetic 자극 전기 자극 똑같이 빠른 반면 그러나, 확실하게 적용 할 수있는 자극의 주파수에 관한 제한이있을 수있다. 이 expressio뿐만 아니라 불 활성화 및 deinactivation 반응 속도와 사용되는 CHR의 변형, (4)의 좌우N 수준과 방법, 가벼운 자극 방법 26.

광 자극 형광 포트에 장착 된 LED를 사용하는 경우, 특정 목적의 관점 전형적 전체 필드는 필드의 모든 섬유 또는 세포의 활성화 및 특정 깊이에서 얻어진, 조명된다. 이것은 부분적으로 작은 영역에 제한되거나 표지 된 세포를 설정할 수있다 (이 예에서, mpITC) 형광 경로 (23,27)의 개구를 사용. 고출력 청색 LED는 현재 많은 제조 업체에서 사용할 수 있습니다로 LED가 빛 전력은 문제가되지 않습니다. 그러나, 발광 스펙트럼은 수십 나노 미터의 반치 전폭 값을 갖는다. 연결 및 / 또는 단색 자극의 세포 내 매핑을위한 공간적으로 정확한 자극 하나가 원하는 경우 따라서, LED는 한계를 포즈. 모두 타르 있도록 더 정교한 설정 전형적으로 조합하여, 광원으로 청색 레이저를 사용함으로써 개선 될 수있다에 geting 및 / 또는 작은 영역에서 빔의 주사와 정의 조직 깊이 (예 28 참조).

전 생체 optogenetic 방법은 여기에 설명과 함께, 시냅스 전달의 여러 가지 특성을 연구 할 수있다. 초기 시냅스 반응 성분, 지연의 철저한 분석 및 지터 monosynapticity뿐만 아니라 응답 진폭 변동을 평가하기 위해 기록 된 신경 세포 (예를 들어, 16,17,23 참조)의 대표적인 샘플을 사용해야한다. 네트워크 활동의 활성화가 역할을 할 경우, 선택 방법은합니다 (K + 채널 차단제 인 4- 아미노 피리딘과 조합 활동 전위를 차단 테트로도톡신 (TTX)의 조합을 적용함으로써 직접 monosynaptic 성분을 분리 4- 인 AP는) 재분극의 14,28,29를 방지합니다. 입력 및 모노 disynaptic 성분 중개 수용체 차단제 약물을 사용하여 식별 될 수있다. Furthermor즉, 이는 편도 23,30에 optogenetically 활성화 입력의 연접 조절의 양상을 연구 할 수있다. 잠재적주의해야 ChR2 일부 칼슘 투과성 1,4- 가지며 시냅스 섬유 및 단말기에서의 활성화는 다양한 메커니즘에 의해 26,31 방출 확률을 변경하는 제시되었다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 편도체에서 쌍을 이루는 펄스 비율에 셀 별 차이와 다른 뇌 영역 16,23,26,32을 입력 - 확인 대상에 여기에 성공적으로 사용 ChR2 식을 표시 사례 및 활성화에 의해 릴리스 확률 또한 입증 변조 등 여러 가지 연구 CHR 활성화 23,30에 의해 배제되지 않은 시냅스 단말기의 특정 신호 전달 경로의. 또한 지원 보여주는 해마와 소뇌의 데이터에서 오는 적절한 CHR의 표현 방법과 광 자극 기법, 자료 및 충실도 오의 효능을 포함하여 생리 학적 측면에F 시냅스 전달은 확실하게 (26)를 공부하실 수 있습니다. 마지막 optogenetic 섬유 활성화는 성공적 시냅스 가소성 31,33,34 유도 자극 프로토콜을 적용하는 데 사용되어왔다.

여러 가지 측면이 방법의 성공을 위해 중요하다. 하나는 바이러스 벡터의 정위 타겟팅의 정밀도입니다. 따라서, 신속하게 기록을 얻기 전에 주사 부위의 위치를​​ 평가하고 자세한 사후 분석을 수행하는 것이 유용하다. 공간 정밀도뿐만 아니라, 주사 부위에서의 신경 세포의 생존 능력은 성공적인 실험의 주요 결정 요인이며, 주입 기술에 의존한다. 길고 얇은 테이퍼 유리 전극을 사용하여 제시된 옵션은, 표면과 깊은 뇌 영역 모두에 대해 잘 목적을 제공하지만, 테이퍼가 매우 유연 단점이있을 수 있습니다. 대안은 특히 신경 (신경의 정위에 전달하기 위해 개발 ㎕의 주사기를 사용하는yringes) 작은 볼륨을 분배 할 수 있습니다 더 엄격한 바늘. 편도선 인터 셀에 도시 한 바와 같이 정의 된 유형의 세포 및 지역 CHR 표현 타겟팅의 특이성은 상기 Cre 호텔 시스템과 예를 들어, 조건식 (7)을 사용하여 개선 될 수있다. 이것은 또한 Cre 호텔 의존 바이러스 벡터의 강력한 프로모터를 사용할 수있다.

또 다른 중요한 측면은 바이러스 벡터의 선택입니다. CHR을 표현하기 위해, 재조합 아데노 - 관련 바이러스 (rAAVs)는 다른 대중 바이러스 시스템에 비하여 생물 안전도 1 벡터 있다는 장점이있는 사용 하였다. rAAVs은 몇 시간 동안 사용 된 좋은 신경 친 화성 및 거의 또는 전혀 면역 원성 가능성이있는 안전하고 신뢰할 수있는 벡터는 일반적으로, 그러나 그들의 포장 볼륨 (약. 4-5킬로바이트) (35) 제한됩니다. 이러한 특정 실험에서, 2/9 및 2/1 각각 유비쿼터스 조건식 혈청 형을 사용 하였다. 문헌에 따라,SE 혈청 대상 영역의 세포를 형질 도입하지만, 혈청 2/5 및 2/6 (36, 37)과 달리, 레이블 세포를 역 행성 축삭 의해 흡수되지 나타난다. 그러나, 초기 실험은 mPFC 및 편도체 같은 상호 접속 뇌 영역을 연구 할 때 특히 중요하다 주사 부위에 돌출하는 영역에서 CHR 표지 된 세포 기관이 있다는 것을 제외한다. 몇 가지 최근의 연구는 쥐와 생쥐 36,38,39 다른 뇌 영역에서 rAAV의 혈청 형의 효능을 비교했다. 신흥 주제는 새로운 혈청 형이 (예, 2/1, 2/8 및 2/9)이 일반적으로 더 효율적으로 원래의 2/2 혈청 형보다 점이다. 또한 노트, 다른 방법과 달리 CHR의 rAAV 중재 식,의, 세포 또는 표시 축색 돌기 (40)를 표현에 해로운 영향을 유발하지 않았다. 필요한 발현 시간이 효과적인 광 활성화를 달성하기 위해 생체 외 연구 투영 거리에 의존하는 것으로 보인다. 여기 라이트와 일치rature, 라벨 및 장거리 연결의 활성화 마우스에서 (mPFC 감각 입력), (4)의 발현 시간 - 삼주이다 - (2), 편도체에 짧은 발현 시간을 로컬 연결을 공부하는 반면, 필요 팔주 14-17,23,30,34 충분합니다.

대상 지역 optogenetically - 유도 반응의 기록을 위해, 두 요소가 중요하다 : 1) 급성 뇌 슬라이스 양질 2) 가능한 표지 섬유의 상당 부분이 유지되어야 될 필요가있다. 조각의 품질에 대한 슬라이싱 사파이어 블레이드를 사용하여 향상시킬 수있다. 광 응답 축삭 보존하므로, 크기와 안정성 mPFC-편도체 돌기 (도 1D 및 2A) 16,34 대해 도시 된 바와 같이 소정 각도로 슬라이스 절단함으로써 개선 될 수있다. 그러나이 강하게 대상 영역의 구 심성 신경의 방향에 의존하고, 투영 영역 (TA)의 각 조합에 대해 결정되어야 할 것이다rget 지역. 이러한 관점에서, 상기 대상 지역의 돌기 사후 분석에 유용 할 수있다. 광 검출 및 이용 될 수 CHR 융합 단백질에 대해 면역 염색, 형광 태그, 슬라이스 자극 중에 발생할 수있는 우회하기 표백을 향상.

전체적으로 optogenetic 회로 매핑이 방법은 단지 최근 뇌 회로하지만, 많은 다른 시스템을 두려워 적용되지 않았다. 미래에, 유전자 변형 마우스 선 및 조건부 바이러스 벡터의 증가 배열을 조합하여 subnuclei 특정 세포 유형 타겟팅 특정 로컬 및 장거리 회로 기능 시냅스 특성의 다양성의 더욱 상세한 이해를 제공 할 것이다. 또한, 조사 기능 연결에서 찬란 태그가 CHR의 사후 immunolabeling는 미세 구조 분석과 결합 될 수있다 (즉, 전자 현미경 방법을 사용하여) 정확한 MOR에 대한 통찰력을 제공하기 위해이전에 활성화 된 시냅스의 phological 속성.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

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References

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뇌 조각의 공포 회로의 <em>예 생체</em> Optogenetic 해부
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Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

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