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Neuroscience

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

enfoques Optogenética son ampliamente utilizados para manipular la actividad neuronal y evaluar las consecuencias para la función cerebral. Aquí, una técnica que se describe después de la expresión in vivo del activador óptico canalrodopsina, permite el análisis ex vivo de las propiedades sinápticas de largo alcance específico y conexiones neuronales locales en los circuitos relacionados con el miedo.

Abstract

enfoques Optogenética son ampliamente utilizados para estudiar la función de las poblaciones neuronales y los circuitos mediante la combinación de la expresión específica de proteínas activadas por la luz y la posterior manipulación de la actividad neural por la luz. Channelrhodopsins (CHRS) son cationes canales de luz cerrada y cuando se fusiona a una proteína fluorescente su expresión permite la visualización y la activación simultánea de los tipos de células específicas y sus proyecciones axonales en áreas definidas del cerebro. Via inyección estereotáctica de vectores virales, proteínas de fusión CHR pueden ser constitutivamente o condicionalmente expresan en células específicas de una región del cerebro definido, y sus proyecciones axonales posteriormente se pueden estudiar anatómica y funcionalmente a través de la activación ex vivo optogenético en rodajas de cerebro. Esto es de particular importancia cuando el objetivo de comprender las propiedades sinápticas de conexiones que no pueden ser tratados con los enfoques convencionales de estimulación eléctrica, o en la identificación de nuevos affealquiler y conectividad eferentes que fue previamente poco conocida. Aquí, algunos ejemplos ilustran cómo esta técnica se puede aplicar a investigar estas preguntas a la aclaración de los circuitos relacionados con el miedo en la amígdala. La amígdala es una región clave para la adquisición y expresión de miedo, y el almacenamiento de miedo y recuerdos emocionales. Muchas líneas de evidencia sugieren que la corteza prefrontal medial (córtex prefrontal medial) participa en diferentes aspectos de la adquisición del miedo y la extinción, pero su conectividad preciso con la amígdala está empezando a ser entendido. En primer lugar, se muestra cómo la activación ex vivo optogenético se puede utilizar para estudiar aspectos de la comunicación sináptica entre los aferentes mPFC y células diana en la amígdala basolateral (BLA). Además, se ilustra cómo este enfoque ex vivo optogenético se puede aplicar para evaluar nuevos patrones de conectividad utilizando un grupo de neuronas GABAérgicas en la amígdala, el clúster paracapsular intercalado celular (mpITC), como un ejemplo.

Introduction

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herramientas precisas para la visualización y la activación simultánea de conexiones específicas entre las áreas del cerebro y los tipos específicos de neuronas son cada vez más importante en la comprensión de la conectividad funcional subyacentes de la función cerebral y la enfermedad estados sanos. Idealmente, esto implica la investigación de las propiedades fisiológicas precisas sinápticas con la que se comunican las neuronas identificadas. Esto es particularmente cierto para las conexiones entre las áreas del cerebro que no pueden ser preservados en una sola rebanada cerebral agudo. En el pasado, esto se ha conseguido en gran parte en experimentos separados. Por un lado, los trazadores inyectados neuronales in vivo se han empleado en combinación con la luz posterior o el análisis con microscopio electrónico de socios de pre y postsinápticos. Por otro lado, cuando tractos de fibras de la región de origen se conservan y accesible en la preparación rebanada, la estimulación eléctrica se ha utilizado para evaluar los mecanismos de comunicación sinápticas con las células en la región de destino.

Con el advenimiento de la optogenética, la expresión selectiva de cationes-canales de luz-gated, como Channelrhodopsins (CHRS) fusionado a las proteínas fluorescentes, ahora permite la activación de las neuronas y sus trayectorias axonales permitiendo al mismo tiempo su visualización y post-hoc análisis anatómico 1- 4. Debido a que los axones CHR-expresan pueden ser estimulados incluso cuando separado de somata matriz 5, es posible en rodajas de cerebro a: 1) evaluar las aportaciones de las regiones del cerebro que no eran accesibles con la estimulación eléctrica convencional, ya tractos de fibras no son separables o la trayectoria específica no se sabe; 2) identificar inequívocamente la región de origen de los insumos específicos que fueron postuladas pero no del todo comprendidas; y 3) investigar la conectividad funcional entre los tipos de células definidos, tanto a nivel local y en las proyecciones de largo alcance. Debido a una serie de ventajas, este mapeo optogenético de circuitos en cortes de cerebro se ha convertido en ampliaLy utilizado en los últimos años, y una variedad de vectores virales para la expresión de CHRS fluorescentemente etiquetado están fácilmente disponibles de proveedores comerciales. Algunas de las ventajas clave de activación optogenético sobre la estimulación eléctrica convencional hay daño al tejido debido a la colocación de electrodos de estimulación, la especificidad de la estimulación de la fibra debido a la estimulación eléctrica también puede reclutar fibras de paso o de otras células cercanas, y una estimulación igualmente rápida y temporalmente precisa. Además, la inyección estereotáxica de vectores virales fácilmente puede dirigirse a áreas específicas del cerebro 6 y expresión específica condicional o de tipo celular se puede lograr utilizando la expresión de Cre-dependiente y / o promotores específicos 7. A continuación, se aplica esta técnica para el mapeo de largo alcance y los circuitos locales en el sistema del miedo.

La amígdala es una región clave para la adquisición y expresión de miedo, y el almacenamiento de miedo y recuerdos emocionales 8,9. Aparte lado a otrom la amígdala, la corteza prefrontal medial (córtex prefrontal medial) y el hipocampo (HC), estructuras que están conectados recíprocamente a la amígdala, están implicados en los aspectos de la adquisición, consolidación y recuperación de miedo y extinción de recuerdos 10,11. Actividad en las subdivisiones de la mPFC parece desempeñar un doble papel en el control tanto de alta como de baja temor estados 12,13. Esto podría ser debido en parte mediado por conexiones directas desde el córtex prefrontal medial a la amígdala que controlaría la actividad de la amígdala y de salida. Por lo tanto, en los últimos años, varios estudios comenzaron en experimentos ex vivo rebanada para investigar las interacciones sinápticas entre los aferentes mPFC y células diana específicas en la amígdala 14-17.

Durante el aprendizaje miedo, la información sensorial sobre los estímulos condicionado e incondicionado alcanza la amígdala a través de las proyecciones de las regiones talámicas y corticales específicas. La plasticidad de estas entradas de las neuronas en la parte lateral (LA) del Basolamígdala ateral (BLA) es un importante mecanismo que subyace en el condicionamiento del miedo 9,18. La evidencia creciente sugiere que los procesos paralelos de plástico en la amígdala implican elementos inhibidores para controlar la memoria del miedo 19. Un grupo de neuronas inhibidoras agrupados son los paracapsular intercalado células mediales GABAérgicas (mpITCs), pero su conectividad y función precisa se ​​entiende de manera incompleta 20-22. Aquí, la cartografía circuito optogenético se utiliza para evaluar la conectividad aferentes y eferentes de estas células y su impacto en las neuronas diana en la amígdala, lo que demuestra que mpITCs reciben información sensorial directa de estaciones de relevo talámicas y corticales 23. La expresión específica de la CDH en mpITCs o neuronas BLA permite representar las interacciones locales, revelando que mpITCs inhiben, sino que también están mutuamente activa, BLA neuronas principales, colocándolos en nuevos circuitos inhibitorios de alimentación directa y retroalimentación que controlan eficazmente la actividad BLA23.

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Protocol

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declaración de la ética: Todos los procedimientos experimentales fueron de acuerdo con la directiva de la UE sobre el uso de animales en la investigación y fueron aprobados por el Cuidado de Animales local y el empleo Comisión (Regierungspräsidium Tübingen, estado de Baden-Württemberg, Alemania) responsable de la Universidad de Tübingen.

1. Procedimiento de inyección estereotáctica

  1. Preparar herramientas estériles (tijeras, bisturí, pinzas, taladros, agujas, material de sutura) utilizando un esterilizador. Organizar herramientas estériles y otras soluciones necesarias y suministros quirúrgicos como el canje de algodón estéril, desinfectante, solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS, pH 7,4), y H 2 O 2 en un paño quirúrgico estéril.
  2. Tire micropipetas de vidrio para inyecciones (Figura 1A, inserción) utilizando un 3 mm de ancho filamento caja en un microelectrodo horizontal extractor de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    Nota: Para las inyecciones profundas, la forma cónica del electrodo debe ser lo suficientementelargo para llegar a la mayoría de las ventrales coordenadas (aproximadamente 5 mm;. para las coordenadas, véase 1.10).
  3. Premezcla 1 l de solución de virus y 0,2 l de solución de verde rápido 0,1% en PBS estéril (para una mejor visibilidad de la solución en la pipeta de vidrio). Llenar pipetas de vidrio con mezcla de solución de virus y verde rápido usando una pipeta de microlitro con una punta fina (Figura 1A, recuadro).
    Nota: El trabajo con vectores virales adeno-asociados recombinantes (rAAV) se considera nivel de bioseguridad 1 (BSL 1) de trabajo y debe ser realizado en un laboratorio BSL 1. rAAVs utilizados en este estudio (Figura 1C) fueron: 1) mPFC: rAAV-hsyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotipo 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (serotipo 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R)-YFP (serotipo 2/1) 23
  4. Anestesiar a un ratón utilizando una pequeña máquina de anestesia para animales (isoflurano: 3% de oxígeno para la inducción).
    Nota: Los ratones utilizados en este estudio fueron 4 -7 semanas de edad y de las siguientes cepas y genotipos: tipo salvaje C57Bl6 / J (experimento en las figuras 2A y 3A-D); GAD67-GFP 24 (experimento en las Figuras 2B y 3E-H); Tac2 Cre-25 (experimento en las figuras 2C y 3I-J).
  5. Afeitarse la cabeza entre las orejas y los ojos. Aplicar desinfectante (de povidona-iodo basada) a la cabeza afeitada usando hisopos de algodón.
  6. Aplique un ungüento para los ojos para evitar el secado de los ojos durante la anestesia. Por vía subcutánea inyectar ratón con analgésicos (, solución basada en meloxicam 0,1 ml de 5 mg / ml).
  7. Coloque el ratón en el marco estereotáxico (Figura 1A) y mantener la anestesia a través de una máscara de anestesia de gas (isoflurano: 2% en oxígeno para el mantenimiento). Comprobar la profundidad de anestesia utilizando reflejo de retirada del miembro antes de continuar.
    Nota: Mantener condiciones estériles, así como sea posible durante todo el procedimiento quirúrgico; llevar mascarilla desechable, ir quirúrgicawn y guantes.
  8. Hacer incisión en la piel en la parte superior de la cabeza con unas tijeras. Tire con cuidado de la piel a un lado el uso de fórceps romos, fijar con abrazaderas para exponer la superficie del cráneo, y el cráneo limpio con H 2 O 2.
  9. Marcar los puntos de inyección en el cráneo utilizando un fino agujeros de perforación y marcadores permanentes de punta para ambos hemisferios (Figura 1B). Coordenadas para inyecciones en este estudio son (de bregma (mm)): mPFC: 1.9 anterior, lateral ± 0,3, 2,1 ventral; MGM / PIN: 3.0 posterior, lateral ± 1,8, 3,8 ventral; mpITC / BLA: 1,45 posterior, lateral ± 3,35, y 4,75 ventral.
  10. Montar la pipeta de vidrio lleno en marco estereotáctico conectado a un dispositivo de inyección a presión y llevar la pipeta a la posición Bregma.
  11. Rompa la punta de la pipeta de vidrio usando pinzas finas recta de punta. Haga esto con cuidado para evitar la formación de aerosoles de solución de virus. Asegúrese de que la punta de la pipeta es abierta mediante la aplicación de un par de pulsos de presión y la observación de extrusión de gotas de virusolución de s.
  12. Ir a las coordenadas deseadas de inyección e inyectar la mitad del contenido de la pipeta (~ 0,5 l) usando los siguientes ajustes en el dispositivo de inyección a presión: Presión: 20 psi, la duración del pulso promedio: 30 ms, número medio de pulsos: 50.
  13. Deja pipeta en el lugar durante ~ 1 min antes lentamente (1 mm / min) retraer él.
    Nota: Asegúrese de que la pipeta no está bloqueado antes de repetir el procedimiento con la misma pipeta en otro hemisferio. En el caso de la punta bloqueado, limpie o romper la punta y la posición de la pipeta cero al bregma nuevo.
  14. cráneo limpia con PBS (pH 7,4), quitar las abrazaderas, tire suavemente de la piel juntos, y suturar la incisión con suturas botón individual (3 - 4 nudos). Aplicar desinfectante (de povidona-iodo basados) alrededor de la herida.
  15. Detener la anestesia y no deje desatendida del ratón hasta que esté completamente despierto. Mantenga alojamiento individual o volver a la compañía de otros animales sólo cuando se recuperó por completo. Después de la operación, seguirá de cerca el estado de salud, y administer analgésico si es necesario. Siga los procedimientos de acuerdo a las normas formuladas por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo local.

2. Preparación de cortes agudos

  1. Preparar ACSF, solución de corte, herramientas (tijeras, bisturí, pinzas, espátula, pipeta Pasteur) y bloques de agar.
    Nota: 1 L de artificial de fluido cerebro-espinal (ACSF) se requiere por experimento, y se prepara mediante la disolución de los productos químicos en H bidestilada 2 O como publicó anteriormente 16,23. Solución de corte se prepara completándolo 200 ml de ACSF con 0,87 ml de H MgSO4 solución madre 2.
  2. ACSF oxigenar y solución de corte durante todo el experimento con un 95% de O2 y 5% de CO2.
  3. Profundamente anestesiar ratón usando una pequeña máquina de anestesia en animales utilizando isoflurano (3% en oxígeno). Comprobar la profundidad de anestesia utilizando reflejo de retirada del miembro antes de continuar.
  4. Decapitar ratón usando tijeras grandes y desconectar inmediatamentela cabeza de corte en una solución enfriada con hielo.
  5. cráneo abierto por una sola incisión en la línea media del caudal a rostral y empuje suavemente trozos de cráneo a los lados con unas pinzas. Eliminar rápidamente el cerebro levantando suavemente hacia afuera del cráneo usando una pequeña espátula redondeada. Cortar el cerebelo con el escalpelo. Coloque cerebro en solución de corte enfriado con hielo.
  6. Para los sitios de inyección mPFC: cortar parte anterior del cerebro (que contiene el córtex prefrontal medial) utilizando un bisturí y poner en solución de corte en frío con hielo hasta el corte.
  7. Retire el exceso de solución de corte con un papel de filtro y la cola de la parte posterior del cerebro en el escenario vibratome.
  8. Para rebanadas amígdala inclinados, pegar el cerebro en un bloque de agar (4%) de corte en un ángulo de 35 ° (Figura 1D, medio). Para rebanadas coronales amígdala, sitios de inyección de MGM / PIN y sitios de inyección mPFC, pegar el cerebro directamente en el escenario (Figura 1D, izquierda y derecha). Colocar un bloque de agar adicional detrás del cerebro para la estabilidad, mientras que rebanar.
  9. Place etapa en la cámara de corte con solución de corte oxigenada enfriada en hielo que se mantiene a 4 ° C utilizando una unidad de refrigeración. Preparar rodajas agudas de la amígdala (320 micras) con una cuchilla de zafiro. Coloque las rebanadas en una cámara de interfaz suministrado con ACSF oxigenada a temperatura ambiente.
  10. Después de la preparación de las rebanadas de la amígdala agudas, coloque la cámara de interfaz en un baño de agua a 36 ° C para recuperar las rebanadas de 35 - 45 min. Posteriormente, el retorno de la cámara de interfaz a RT. Para la grabación de estos cortes, continúe con el paso 3.2.
  11. Durante el inicio de la etapa 2.10, cortar rodajas de los sitios de inyección como se ha descrito antes para los sectores de la amígdala agudas (pasos 2.8 a 2.9). No se requiere la recuperación de las rebanadas en el baño de agua aquí. Opcional: Para estimar rápidamente la ubicación del sitio de la inyección, observe las rebanadas en un estereoscopio equipado con una lámpara fluorescente y juego de filtros adecuados.
  12. Fijar las rebanadas contienen sitios de inyección para el análisis post-hoc intercalando ellos entre dos papeles de filtro y submerging en 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS solución de O / N. Para el análisis de los sitios de inyección de proceder con el paso 4.1.

3. Visualización y estimulación de fibras presinápticas

  1. Preparar microscopio parche para la activación optogenético de fibras y células:
    1. Centre el diodo emisor de luz montada (LED) en la vía de suministro de luz.
    2. Medir la intensidad de la luz LED en el plano focal posterior y en la salida de cada objetivo con un medidor de potencia de la elección de la longitud de onda apropiada de 470 nm.
    3. Calcular la intensidad de la luz en mW / mm 2 y crear una curva de calibración (intensidad del LED (%) frente a la salida de luz (mW / mm 2)) para cada objetivo para los valores medidos para 470 nm longitud de onda.
  2. Recuperar una rebanada amígdala aguda de la cámara de interfaz y lugar en la cámara de corte montado en el microscopio vertical equipado con una lámpara fluorescente. Tenga cuidado de colocar el trozo de tal manera que el SLICe superficie que mira hacia arriba en la cámara de interfaz también se coloca hacia arriba en la cámara de grabación. Perfundir rebanada con ASCF fresca, oxigenada, a razón de 1-2 ml / min a una temperatura de ~ 31 ° C.
  3. Observe fibras presinápticas en el corte utilizando la lámpara fluorescente en combinación con los conjuntos de filtro para la proteína fluorescente específico expresado. Utilice objetivo 5x para obtener una visión general (Figura 1E), y 60x objetivo para la evaluación de la densidad de las fibras dentro del área objetivo.
    Nota: Para GFP y YFP, el uso conjunto de filtros "verde" (excitación 472/20, Divisor de rayos 495, 490 Emisión LP) para mCherry uso conjunto de filtros "rojo" (excitación 560/40, Divisor de rayos 585, emisión 630/70) como se especifica en la tabla de materiales / equipos.
  4. Abra o restringir la abertura en la vía de luz del microscopio como se desee para el experimento (Figura 2D).
  5. Para obtener una grabación de parches, llenar un parche pipeta con solución interna y Mount In soporte del electrodo. Aplicar presión positiva a la pipeta de parche y baje lentamente que por primera vez en la solución del baño y luego bajo control visual en el sector mediante el micromanipulador.
    1. Acercarse a la neurona de interés con la pipeta parche desde el lado y la parte superior. Liberar la presión positiva cuando la pipeta está en la superficie de la célula (hoyuelo visible en la superficie celular) y obtener una "gigaseal" mediante la aplicación de presión negativa.
    2. Aplicar más de succión para romper el parche de membrana para obtener células enteras de grabación. Posteriormente, estimular fibras marcadas con el LED conectado con la longitud de onda apropiada para la activación de Chr (470 nm) durante la grabación de las respuestas eléctricas de la célula.
    3. Para la estimulación sináptica comenzar con una baja intensidad de LED y aumentar hasta que se alcanza la amplitud de la corriente sináptica deseada. Disparar el LED mediante la configuración de las salidas digitales en el software de adquisición de datos para controlar el tiempo y el pulso largo (ejemplos de la figura3).
      Nota: otro software y / o generadoras de TTL dispositivos se pueden utilizar para desencadenar LED.
  6. Repita la estimulación con la abertura abierta o restringida (etapa 3.4) en la vía de luz del microscopio como se desee para la próxima célula registrada y / o en presencia de fármacos específicos.
  7. Después de grabar, arreglar las rebanadas para el análisis post-hoc intercalando ellos entre dos papeles de filtro y sumergiéndolas en el 4% PFA O / N.
  8. Analizar datos electrofisiológicos.
    Nota: El uso de software adecuado para visualizar los datos de barrido registrados para cada línea estimulación individual. Al analizar los efectos de las drogas, usar rutinas de detección de picos para obtener curso temporal del efecto del fármaco sobre amplitudes de corriente sinápticas para todos los barridos individuales. Determinar cuando el efecto del fármaco alcanza el estado de equilibrio. Para preparar las respuestas medios representativos de las cifras, utilizar el software en un promedio de ≥10 barridos individuales por condición experimental (véase la figura 3B-D, FH, J panel derecho).
    Nota: varios paquetes de software alternativos pueden ser utilizados para el análisis de datos.

4. Análisis post-hoc de los puntos de inyección

  1. Lavar rebanadas de sitios de inyección (de la etapa 2.12) y el registro de los sitios (si se desea la re-formación de imágenes, de la etapa 3.7) tres veces en PBS. Esto se hace mediante la sustitución de varias veces la solución con PBS fresco en un agitador giratorio tres veces durante 10 min.
  2. Preparar solución al 2% de agar-agar en PBS, y dejar que se enfríe a ~ 65 ° C. Coloque las rebanadas planas en la parte inferior de una pequeña placa de Petri de 30 mm de diámetro, incrustar en rodajas agar-agar y dejar enfriar hasta que solidifique.
  3. Pegar un bloque de agar con el sector o sectores incorporado a la etapa de un vibratome y colocar etapa en la cámara de corte con PBS.
  4. Resección rebanadas a 70 micras de espesor incrustado. Opcional: Después de la resección, las rebanadas se pueden teñir, es decir, con NeuroTrace para revelar citoarquitectura (Figura 3A, C), y / o btinción de inmunofluorescencia y de YFP o mCherry para aumentar la señal de la proteína de fusión Chr.
  5. rebanadas de montaje en portaobjetos y cubreobjetos con medio de montaje. Sitios de inyección de la imagen y, si se desea, también cortes de imagen que contienen fibras en las áreas de proyección utilizando un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal de escaneo láser (Figura 2A-C).

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Representative Results

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En esta sección se muestra el flujo de trabajo de un enfoque optogenético ex vivo y los resultados representativos de diferentes estrategias experimentales para investigar las propiedades fisiológicas de las proyecciones sensoriales y moduladores de largo alcance a BLA y neuronas mpITC así como las propiedades de conectividad local entre mpITC y BLA.

Después de la inyección estereotáctica del vector viral seleccionado en las coordenadas deseadas en el cerebro del ratón (Figura 1A-C, el tiempo de expresión viral 2 - 6 semanas, dependiendo del experimento), se preparan cortes de cerebro agudos de los puntos de inyección y áreas de proyección en la amígdala en el ángulo apropiado para experimentos de patch-clamp y desde la región del cerebro inyectado para el análisis post-hoc de puntos de inyección (Figura 1D). Antes de iniciar las grabaciones y la estimulación optogenética, células marcadas con fluorescencia o pro axonalinyecciones en la zona objetivo (la amígdala) se deben comprobar en el microscopio vertical de patch-clamp grabaciones mediante el uso de la lámpara fluorescente unido (Figura 1E). Tras la obtención de una grabación de una célula diana putativo en la región de proyección de la rebanada de patch-clamp, la estimulación de luz mientras se está realizando punto de tiempo, intervalo y duración del pulso se controlan a través del software parche que desencadena el diodo emisor de luz (LED). Dependiendo de la estrategia experimental (Figura 2A-C, derecha) de la abertura en la trayectoria de la luz fluorescente se sea completamente abierta o restringida (Figura 2D). Mientras se mantiene la longitud del impulso constante y lo más corto posible (idealmente ≤1 ms), la intensidad de salida del LED se aumenta lentamente para evaluar qué intensidad se requiere para alcanzar la amplitud deseada de la respuesta sináptica en un experimento particular (Figura 2E). Después de la grabación, rebanadas de la amígdala son post fijo. Tras la resección y opcionalsitios de tinción, de inyección y de registro se crean imágenes en un microscopio confocal para verificar la ubicación de la inyección y para excluir datos por inyecciones mal colocadas. Imágenes de los sitios de inyección y las proyecciones axonales asociados en la amígdala para las tres estrategias experimentales (entradas mPFC a BLA, entradas talámicas a mpITCs, y la activación local de mpITC) se muestran en la Figura 2A-C.

Figura 3 muestra resultados representativos de grabación obtenidos de BLA principales neuronas, interneuronas locales BLA y neuronas mpITC ilustra las propiedades de las respuestas de luz evocado para las diferentes estrategias experimentales utilizadas (Figura 3A, E, I). Para orientar las neuronas GABAérgicas (interneuronas locales y mpITCs) para la grabación, reportero ratones GAD67-GFP se utilizaron 24. Para mPFC y proyecciones talámicas sensoriales, varios aspectos de la transmisión sináptica pueden ser estudiados. La precisión temporal de activación y las propiedades cinéticas de los CHRS utilizados en este estudio permiten la estimulación fiable con pares de pulsos en una inter-estímulo-intervalo de 50 mseg. Esto permite el análisis de las relaciones de dos pulsos (PPR) de las corrientes postsinápticas (PSC), que pueden ser o bien facilitar o deprimente en función de proyección y tipo de célula diana, y servir como indicadores de la probabilidad de liberación presináptica (Figura 3 B, F, H) . Además, el análisis de las latencias sinápticas permite la disección de diferentes componentes de la respuesta postsináptica.

En este ejemplo, las latencias más largas de la PSC inhibitoria (IPSC) componente PSC excitatoria (EPSC) versus indican una entrada de disynaptic y monosináptico, respectivamente (Figura 3C). En otros casos, puede ser necesario un análisis más exhaustivo de las propiedades adicionales EPSC tales como la fluctuación de respuesta o el coeficiente de variación del tamaño de la respuesta para sacar conclusiones sobre sus mono- o disynanaturaleza ptic 17,23. Además, la aplicación de los bloqueadores farmacológicos para receptores específicos puede identificar la naturaleza de PSC (es decir, EPSC glutamatérgica y GABAérgicas IPSC, la Figura 3C-D). Como era de esperar, el componente inicial de la entrada mPFC era glutamatérgica, mientras que el componente tardía fue GABAérgicas. El bloqueo completo de ambos EPSC y IPSC con el receptor de glutamato bloqueador CNQX apoya, además, que la IPSC es disynaptic. Para investigar la modulación de la transmisión sináptica en fibras optogenetically activados, los efectos de los agonistas y antagonistas de los receptores metabotrópicos (aquí receptores GABA B) de amplitud y PPR se pueden evaluar para evaluar las influencias en los sitios de pre y postsinápticos. En este ejemplo, la disminución concomitante de la amplitud con un aumento de la PPR es indicativo de una modulación presináptica de las fibras activadas por la luz (3 g, H). Por último, las interacciones locales de las células de la amígdala se pueden evaluar, por ejemplo,cuando los ratones que expresan Cre bajo el control del promotor Tac2 25 son inyectadas con una ChR expresando vector viral de doble floxed (Figura 1C). Debido Tac2 y por lo tanto, se expresa en ChR mpITC y la amígdala central (Figura 2C), activación de la luz se restringió a la mpITC mediante el cierre de la abertura de paso de luz fluorescente (Figura 2D). En estas condiciones, los potenciales de acción de luz evocados se pueden provocar en mpITCs infectados. latencia respuestas sinápticas inhibitorias cortas en la BLA indican la presencia de una conexión inhibitoria funcional entre mpITC y BLA neuronas principales.

Figura 1
Figura 1. Las inyecciones estereotácticas, Preparación de rebanadas aguda del cerebro, y la visualización de fibras presinápticas. (A, B) de inyección estereotáctica virus. A) Imagen del ratón anestesiado se coloca en un marco estereotáxico con el cráneo expuesto y lapipeta de inyección. Recuadro: zoom en la imagen de la pipeta de inyección lleno de solución de virus se mezcla con el verde rápido. Barra de escala: 3 mm. (B) Representación esquemática de un cráneo de ratón con posiciones marcadas de pozos de perforación para diferentes zonas de inyección. (C) Esquema que muestra diferentes construcciones virales utilizados en este estudio. gris oscuro: secuencia del promotor; azul: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); verde / rojo: proteína fluorescente. Expresión tiempo fue de 2 semanas para las proyecciones de la amígdala locales y 4 - 6 semanas para las proyecciones de córtex prefrontal medial y MGM / PIN. (D) Preparación de cortes de cerebro agudas: Esquema que muestra la colocación de cerebro de ratón en el escenario para la obtención de la máquina de cortar rodajas de diferentes áreas de inyección y de proyección. (E) La visualización de las fibras en rodajas de cerebro de un ratón agudas GAD67-GFP inyectados con el virus de ChR2-mCherry en MGM / PIN. Las imágenes se toman en el microscopio parche en posición vertical con diferentes conjuntos de filtros: la expresión de GAD67-GFP, medio; fibras MGM / PIN marcado con mCherry, a la derecha. Barra de escala: 200 micras. córtex prefrontal medial, medial prefrontal cortex; mpITC, células intercaladas paracapsular medial; BLA, amígdala basolateral; MGM, núcleo geniculado medial, la parte medial; PIN, posterior intralaminar núcleo talámico; LA, la amígdala lateral; BA, la amígdala basal; CEA, el núcleo central de la amígdala. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Sitios de inyección, en las zonas de proyección, y Optogenética La estimulación de proyecciones axonales. (AC) Confocal de imágenes de los lugares de inyección representativos y áreas de proyección en la BLA, y esquemas de las estrategias experimentales. (A) Izquierda: sitio de la inyección córtex prefrontal medial en un ratón C57BL / 6 teñido con NeuroTrace. Barra de escala:500 micras. Medio: proyecciones en la BLA correspondiente en una rebanada amígdala inclinada. Barra de escala: 200 micras. Derecha: Esquema de toda iluminación de campo de las proyecciones mPFC y grabación de neurona en el BLA. (B) A la izquierda: el sitio de inyección MGM / PIN en un ratón GAD67-GFP. Barra de escala: 500 micras. Medio: proyecciones correspondientes en mpITC y LA de una rebanada coronal amígdala. Barra de escala: 200 micras. Derecha: Esquema de toda iluminación de campo de las proyecciones de MGM / PIN y la grabación de una neurona mpITC. (C) A la izquierda: la expresión local de ChR2-YFP en un NeuroTrace manchado rebanada amígdala de un ratón Tac2-Cre. Barra de escala: 200 micras. Recuadro: Enfoque adentro de mpITCs que expresan ChR2-YFP. Barra de escala: 20 micras. Derecha: Esquema de iluminación restringido de la agrupación mpITC y la grabación de una neurona BLA. (D) Las imágenes de la grabación de la cámara durante el suministro de luz y la imagen de las neuronas en el cerebro rebanadas agudas (cluster mpITC) en un ratón GAD67-GFP con aper abiertas y restringidastura. Barra de escala: 30 micras. (E) las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) evocados por diferentes intensidades de LED (arriba) y parcela de potencia de la luz frente evocados EPSC amplitud (parte inferior) de una neurona mpITC representante a la activación de las fibras optogenético de MGM / PIN. Barra de escala: 100 pA / 10 ms.
Nota:. La figura 2A es una modificación de la referencia # 16 y la Figura 2C de referencia # 23 Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. Los resultados de los ejemplares Optogenética La activación de largo alcance y proyecciones locales. (A) Esquema de la estrategia experimental para (BD). (B) EPSCs representativos registrados a partir de una neurona y director BLABLA interneuronas en la estimulación optogenética a dos pulsos (50 mseg entre estímulos-intervalo) de las fibras del córtex prefrontal medial provocar emparejado facilitación del pulso y la depresión a dos pulsos, respectivamente. Barra de escala: 100 pA / 25 ms. (C) la activación de las fibras de Optogenética mPFC provoca la inhibición de alimentación hacia adelante. Izquierda: Representante EPSC (a -70 mV) y la corriente postsináptica inhibitoria (IPSC, a 0 mV) en una neurona director BLA. El IPSC tiene una latencia sináptica más largo en comparación con la EPSC. Barras de escala: 200 pA / 10 mseg y 200 Pa / 2 mseg. A la derecha: Luz evocados secuencia bifásica EPSC / IPSC (a -50 mV) está bloqueado por el antagonista de AMPA / kainato CNQX (10 micras), más el apoyo a la naturaleza disynaptic de la IPSC. Barra de escala: 50 pA / 5 mseg. (D) Los efectos de la posterior secuencia de bloques de EPSC / IPSC (a -50 mV) por el canal de Cl - bloqueador Picrotoxina (PTX, 100 mM) y PTX + CNQX. El IPSC es bloqueado por PTX y la EPSC restante por CNQX. Barras de escala: 50 Pa / 5 mseg. (E) Esquema de la estrategia experimental para (FH). F) EPSCs representativos grabados desde la mpITC y una neurona director BLA a la estimulación optogenética a dos pulsos de fibras de MGM / PIN. Barra de escala: 50 pA / 20 ms. (G) EPSCs en otra neurona mpITC son bloqueados por el bloqueador de los canales de sodio tetrodotoxina (TTX, 0,5 M), que indica que son dependientes de la actividad del canal de sodio. Barra de escala: 50 pA / 20 ms. (H) Talámicas entradas a las neuronas mpITC son modulados por los receptores GABAB presinápticos. EPSCs bajo condiciones de control, la reducción de la EPSC amplitud y aumento concomitante en la proporción de pares de pulso durante la aplicación del agonista de GABA B Baclofen (2 M), y la recuperación de amplitud y sus iniciales ración pares de pulso en co-aplicación del antagonista CGP55845 GABA B (10 M). Estos cambios son indicativos de una modulación presináptica por los receptores GABA B. Barra de escala: 50 pA / 20 ms. (I) Esquema de la estrategia experimental para (J). (J) Luz-evocó potenciales de acción registrados a partir de una ChR2-YFP que expresan mpITC neurona. IPSC-luz evocado grabadas desde un principio neurona BLA a diferentes potenciales de mantenimiento (-90, -70, -50, -20 y 0 mV) revertir todo el potencial de equilibrio calculado para Cl -. Barras de escala: 20 mV / 100 ms y 10 pA / 10 mseg. Nota:. Figura 3B-D es una modificación de Referencia # 16, y la Figura 3 H y J de la referencia # 23 Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Este protocolo describe un método para la ex vivo investigación optogenético de los circuitos neuronales y la conectividad local que se pueden implementar fácilmente en la mayoría, si no todas, las verticales rebanada de grabación de patch-clamp configuraciones, equipándolos con un ~ 470 nm LED en el puerto de luz de epifluorescencia. Una ventaja importante de la estimulación optogenética de proyecciones axonales en rebanadas es que permite la activación y la investigación de las propiedades de las conexiones que no eran accesibles con la estimulación eléctrica convencional específica, ya que los correspondientes tractos de fibras no eran conocidos, no claramente definidos, o no conservan en una sola rebanada del cerebro. Como un ejemplo clave relevante para los circuitos de miedo, es ilustrado cómo esto se puede aplicar para diseccionar propiedades de entradas mPFC a la amígdala.

Incluso en los casos en que la estimulación eléctrica del tracto de fibra se ha utilizado ampliamente en estudios anteriores, estos tratados a menudo llevan fibras de diferentes regiones de origen. Por ejemplo, en los circuitos relacionados con el miedo de aprendizaje, las proyecciones de diferentes núcleos talámicos o regiones corticales sensorial corren entremezcladas a través de las cápsulas interna y externa, respectivamente. La ventaja de la estimulación optogenética es que permite la activación selectiva de un subconjunto de fibras a partir de una región definida. Esto se ilustra para las entradas talámicos específicos de PIN y MGM a células intercaladas y las células principales de la amígdala lateral. Además, los problemas que surgen con la estimulación eléctrica, es decir, la activación de otras fibras de paso o de las células en la proximidad del electrodo estimulante que puede hacer que las conexiones locales en el área objetivo se pueden superar. Sin embargo, mientras que la estimulación optogenética es igualmente rápido como la estimulación eléctrica, puede haber limitaciones en cuanto a la frecuencia de estimulación que se puede aplicar de forma fiable. Esto depende de inactivación y deinactivation cinética y de la variante de ChR que se utiliza, 4 así como expression niveles y métodos, y los métodos de estimulación de luz 26.

Cuando se utiliza un LED montado en el puerto de fluorescencia para la estimulación de luz, por lo general todo el campo de visión de un objetivo dado se ilumina, lo que resulta en la activación de todas las fibras o células en el campo y dentro de una cierta profundidad. Esto sólo parcialmente se puede limitar a una región más pequeña o conjunto de células marcadas (en este ejemplo, el mpITC) usando una abertura en la trayectoria de la luz fluorescente 23,27. Con los LEDs, potencia de la luz no es un problema, ya que los LEDs azules de alta potencia están disponibles de muchos fabricantes. Sin embargo, los espectros de emisión tienen valores máximos medio de ancho completo de varias decenas de nanómetros. Por lo tanto, los LED presentan limitaciones cuando se desean ya sea espacialmente estimulación precisa para el mapeo subcelular de conectividad y / o estimulación monocromática. Tanto se puede mejorar mediante el uso de láseres azules como fuentes de luz, típicamente en combinación con configuraciones más sofisticadas que permiten alquitrángeting y / o exploración del haz en áreas pequeñas y profundidades de tejido definidos (por ejemplo, véase 28).

Con el enfoque ex vivo optogenético describe aquí, varias propiedades de la transmisión sináptica pueden ser estudiados. Para evaluar monosynapticity del componente temprano sináptica respuesta, el análisis exhaustivo de las latencias y su fluctuación, así como la respuesta de amplitud varianza se debe utilizar en una muestra representativa de las neuronas registradas (por ejemplo, véase 16,17,23). En los casos en que la activación de la actividad de la red puede desempeñar un papel, el método de elección es aislar el componente monosynaptic directa mediante la aplicación de una combinación de tetrodotoxina (TTX) para bloquear potenciales de acción en combinación con el bloqueador de los canales 4-aminopiridina K + (4- AP) para evitar 14,28,29 repolarización. Los receptores que median componentes mono- y disynaptic de entradas pueden ser identificados utilizando bloqueadores farmacológicos. Furthermore, es posible estudiar los aspectos de la modulación presináptica de entradas activadas optogenetically-en la amígdala 23,30. Una advertencia potencial es que tiene algo de ChR2 1,4 permeabilidad de calcio y su activación en fibras presinápticas y terminales se ha sugerido para alterar la probabilidad de liberación por diversos mecanismos 26,31. Sin embargo, varios estudios que incluyen ejemplos que se muestran aquí ChR2 expresión empleada con éxito para identificar de entrada y de orientar las diferencias específicas de las células en las proporciones de dos pulsos en la amígdala y otras áreas del cerebro 16,23,26,32 y, además, la modulación de la probabilidad de liberación demostrado por la activación de determinadas vías de señalización en las terminales presinápticas que no estaba excluido por la activación ChR 23,30. Más apoyo proviene de los datos en el hipocampo y el cerebelo, lo que demuestra que con el método de expresión y la técnica apropiada ChR estimulación de la luz, los aspectos fisiológicos, incluyendo la eficacia de la liberación y de la fidelidad of transmisión sináptica puede ser estudiado de forma fiable 26. Por último, activación de la fibra optogenético también se ha utilizado con éxito para aplicar protocolos de estimulación que inducen 31,33,34 plasticidad sináptica.

Varios aspectos son críticos para el éxito de este método. Una de ellas es la precisión de la orientación estereotáctica de vectores virales. Por lo tanto, es útil para evaluar rápidamente la ubicación del sitio de la inyección antes de obtener grabaciones y luego realizar un análisis más detallado post-hoc. Además de la precisión espacial, la viabilidad de las neuronas en el sitio de inyección es un importante factor determinante para un experimento exitoso y depende de la técnica de inyección. La opción presentada, utilizando electrodos de vidrio largas y delgadas cónico, sirve a este propósito bien para ambos superficial y las áreas del cerebro más profundas, pero puede tener la desventaja de que la conicidad es muy flexible. Una alternativa es el uso de jeringas de microlitros especialmente desarrollados para la administración estereotáxica en la neurociencia (neuro-syringes) con agujas más rígidos que pueden dispensar pequeños volúmenes. La especificidad de la orientación CHR-expresión a tipos de células definidos y regiones puede mejorarse aún más utilizando expresión condicional 7, por ejemplo con el sistema Cre-como se ilustra para las células de la amígdala intercalado. Esto también permite el uso de promotores fuertes en vectores virales Cre-dependientes.

Otro aspecto crítico es la elección del vector viral. Para expresar ChR, se utilizaron los virus adeno-asociados recombinantes (rAAVs) que tienen la ventaja de ser un nivel de bioseguridad 1 vectores en comparación con otros sistemas virales populares. rAAVs se han utilizado durante algún tiempo y en general son vectores seguros y fiables con buena tropismo neural y poco o ningún potencial inmunogénico, pero su volumen de embalaje es limitado (aprox. 4-5 kb) 35. En estos experimentos específicos, los serotipos 2/9 y 2/1 se utilizaron para la expresión ubicua y condicional, respectivamente. De acuerdo con la literatura, laserotipos sí la transducción de células en la región de destino, pero no parecen ser asumido por los axones de las células de la etiqueta de forma retrógrada, a diferencia de los serotipos 2/5 y 2/6 36,37. Sin embargo, los experimentos iniciales deben excluyen que hay cuerpos celulares marcados con ChR en áreas que se proyectan hacia el sitio de inyección, lo que es especialmente importante en el estudio de las regiones del cerebro recíprocamente conectados como mPFC y la amígdala. Varios estudios recientes compararon la eficacia de los serotipos de rAAV en diferentes áreas del cerebro en ratas y ratones 36,38,39. Un tema emergente es que los nuevos serotipos (por ejemplo, 2/1, 2/8 y 2/9) son generalmente más eficaz que el original 2/2 serotipo. También de la nota, la expresión mediada por rAAV de ChR, a diferencia de otros métodos, no causar efectos perjudiciales sobre las células que expresan o axones marcados 40. El tiempo de expresión requeridos para lograr la activación de fibra eficaz ex vivo parece depender de la distancia de la proyección estudiado. Aquí y en consonancia con el Litetura, para el etiquetado y la activación de las conexiones de largo alcance en el ratón (córtex prefrontal medial y estímulos sensoriales), un tiempo expresión de 4 - 8 semanas que se necesita, mientras que para el estudio de la conectividad local en la amígdala, menor tiempo de expresión de 2 - 3 semanas son 14-17,23,30,34 suficiente.

Para la grabación de respuestas provocadas optogenetically-en el área de destino, dos factores son fundamentales: 1) la división cerebral agudo tiene que ser de buena calidad y 2) una cantidad sustancial de fibras marcadas viables necesita ser preservado. La calidad de las rebanadas puede ser mejorada mediante el uso de cuchillas para cortar en rodajas de zafiro. Preservación de los axones y por lo tanto, el tamaño y la estabilidad de las respuestas de luz se puede mejorar mediante la reducción de las rebanadas en un cierto ángulo, como se ilustra para las proyecciones mPFC-amígdala (Figura 1D y 2A) 16,34. Sin embargo, esto depende en gran medida de la orientación de los aferentes de la región objetivo y tendrá que ser determinado para cada combinación de área de proyección y target región. A este respecto, el análisis post-hoc de proyecciones en la región diana puede ser útil. Para mejorar la detección de fibra y blanqueo eludir que pueda haber ocurrido durante la estimulación rebanada, inmunotinción en contra de la etiqueta fluorescente en la proteína de fusión ChR pueden emplearse.

En general, este método de mapeo circuito optogenético recientemente ha sido aplicado no sólo a temer circuitos, pero muchos otros sistemas en el cerebro. En el futuro, la focalización de subnúcleos y tipos de células específicas, combinando un conjunto cada vez mayor de líneas de ratones modificados genéticamente y vectores virales condicionales proporcionará una comprensión más detallada de la diversidad de propiedades sinápticas funcionales de los circuitos específicos de largo alcance local y. Por otra parte, immunolabeling post-hoc de ChR fluorescente con etiquetas en las conexiones funcionales investigados podría combinarse con el análisis ultraestructural (es decir, utilizando métodos de microscopía electrónica) que proporciona una visión de mor precisaphological propiedades de las sinapsis activadas anteriormente.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

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References

  1. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  5. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, (5), 663-668 (2007).
  6. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  7. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  8. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  9. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90, (2), 419-463 (2010).
  10. Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12, (2), 120-150 (2007).
  11. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33, (1), 56-72 (2008).
  12. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13, (6), 728-733 (2006).
  13. Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36, (2), 529-538 (2011).
  14. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80, (6), 1491-1507 (2013).
  15. Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34, (47), 15601-15609 (2014).
  16. Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
  17. Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10, (9), 1435-1442 (2015).
  18. Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52, (1), 215-227 (2007).
  19. Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62, (6), 757-771 (2009).
  20. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247, (2), 246-271 (1986).
  21. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31, (13), 5131-5144 (2011).
  22. Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
  23. Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86, (2), 541-554 (2015).
  24. Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467, (1), 60-79 (2003).
  25. Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
  26. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34, (22), 7704-7714 (2014).
  27. Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16, (3), 332-339 (2013).
  28. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, (7233), 1142-1145 (2009).
  29. Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79, (4), 658-664 (2013).
  30. Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32, (42), 14815-14820 (2012).
  31. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4, (2), 139-141 (2007).
  32. Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76, (4), 790-803 (2012).
  33. Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14, (11), 1413-1415 (2011).
  34. Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31, (1), 339-345 (2011).
  35. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4, (5), 353-364 (2003).
  36. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8, (9), (2013).
  37. Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20, (3), 348-352 (2013).
  38. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
  39. McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109, (3), 838-845 (2009).
  40. Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
<em>Ex Vivo</em> Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro
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Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

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