Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Ex vivo optogenetic Dissekering av skräck kretsar i hjärnan skivor

doi: 10.3791/53628 Published: April 5, 2016

Summary

Optogenetic metoder används ofta för att manipulera neural aktivitet och bedöma konsekvenserna för hjärnans funktion. Här, är en teknik som beskrivs att vid in vivo-expression av den optiska aktivator channelrhodopsin, möjliggör ex vivo analys av synaptiska egenskaper hos specifika lång räckvidd och lokala neurala kopplingar i rädsla relaterade kretsar.

Abstract

Optogenetic tillvägagångssätt är nu allmänt används för att studera funktionen av neurala populationer och kretsar genom att kombinera riktad expression av ljusaktiverade proteiner och efterföljande manipulation av neural aktivitet genom ljus. Channelrhodopsins (ChRs) är ljus-gated katjon-kanaler och när smält till ett fluorescerande protein deras uttryck möjliggör visualisering och samtidig aktivering av specifika celltyper och deras axonala projektioner inom definierade områden av hjärnan. Via stereotaktisk injektion av virala vektorer, kan Chr fusionsproteiner konstitutivt eller villkorligt uttrycks i specifika celler i en definierad hjärnregion, och deras axonala projektioner kan därefter studeras anatomiskt och funktionellt via ex vivo optogenetic aktivering i hjärnan skivor. Detta är särskilt viktigt när syftet är att förstå synaptiska egenskaper av anslutningar som inte kunde lösas med konventionella elektriska stimuleringsmetoder, eller för att identifiera nya affehyra och efferent anslutning som tidigare dåligt kända. Här, några exempel illustrerar hur denna teknik kan tillämpas för att undersöka dessa frågor till att belysa rädsla relaterade kretsar i amygdala. Amygdala är en viktig region för förvärv och uttryck för rädsla, och lagring av rädsla och känslomässiga minnen. Många bevislinjer tyder på att den mediala prefrontala cortex (mPFC) deltar i olika aspekter av rädsla förvärv och utrotning, men dess exakta anslutning med amygdala är bara i början att förstå. Först visas hur ex vivo optogenetic aktivering kan användas för att studera aspekter av synaptisk kommunikation mellan mPFC afferenter och målceller i den basolaterala amygdala (BLA). Vidare är det illustreras hur kan tillämpas denna ex vivo optogenetic metod för att bedöma nya anslutningsmönster med användning av en grupp av GABA-erga neuroner i amygdala, den paracapsular inlagrade cellkluster (mpITC), som ett exempel.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Exakta verktyg för visualisering och samtidig aktivering av specifika kopplingar mellan områden i hjärnan och vissa typer av nervceller blir allt viktigare att förstå de funktionella anslutnings underliggande friska hjärnans funktion och sjukdomstillstånd. Helst innebär det fysiologiska undersökning av exakta synaptiska egenskaper som identifierade nervceller kommunicerar. Detta gäller särskilt för anslutningar mellan områden i hjärnan som inte kan bevaras i en enda akut hjärn skiva. I det förflutna, har detta varit i stort sett uppnåtts i separata experiment. Å ena sidan, injiceras neurala spårämnen in vivo har använts i kombination med efterföljande ljus eller elektronmikroskopisk analys av pre-och postsynaptiska partners. Å andra sidan, när fiber skrifter från ursprungsregionen bevaras och tillgängliga i skiva beredning, elektrisk stimulering har använts för att bedöma synaptiska kommunikationsmekanismer med celler i målområdet.

Med tillkomsten av optogenetik, riktade uttryck av ljus gated kat-kanaler, såsom Channelrhodopsins (ChRs) sammansmält med fluorescerande proteiner, gör det nu möjligt aktivering av nervceller och deras axonala banor samtidigt som deras visualisering och post-hoc anatomisk analys 1- 4. Eftersom Chr-uttryck axoner kan stimuleras även när avskiljas från moder somata 5, är det möjligt i hjärnan skivor till: 1) bedöma ingångar från områden i hjärnan som inte var tillgänglig med konventionell elektrisk stimulering, eftersom fiber kontrakt inte kan avskiljas eller specifika bana är inte känd; 2) otvetydigt identifiera ursprungsregionen för specifika insatsvaror som postulerade men ofullständigt förstås; och 3) att undersöka den funktionella anslutning mellan definierade celltyper, både lokalt och i långdistans prognoser. På grund av ett antal fördelar, har detta optogenetic kartläggning av kretsar i hjärnan skivor blivit brettly använts under de senaste åren, och en mängd olika virala vektorer för expression av fluorescerande-taggade ChRs är lätt tillgängliga från kommersiella leverantörer. Några viktiga fördelar med optogenetic aktivering jämfört med konventionell elektrisk stimulering är inga skador på vävnaden på grund av placeringen av stimuleringselektroder, specificitet fiberstimulering eftersom elektrisk stimulering kan också rekrytera fibrer av passagen eller andra närliggande celler, och en lika snabb och tidsmässigt exakt stimulering. Dessutom kan stereotaktisk injektion av virala vektorer lätt riktas till specifika områden i hjärnan 6 och villkorligt eller celltyp specifika uttryck kan uppnås med hjälp av Cre-beroende uttryck och / eller specifika promotorer 7. Här är denna teknik tillämpas för kartläggning av långväga och lokala kretsar i rädsla systemet.

Amygdala är en viktig region för förvärv och uttryck för rädsla, och lagring av rädsla och känslomässiga minnen 8,9. Apart from amygdala, den mediala prefrontala cortex (mPFC) och hippocampus (HC), strukturer som ömsesidigt är kopplade till amygdala, är inblandade i olika aspekter av förvärv, konsolidering och hämtning av rädsla och utrotning minnen 10,11. Aktivitet i underavdelningar av mPFC verkar spela en dubbel roll i kontrollen både hög och låg rädsla påstår 12,13. Detta kan delvis förmedlas genom direkta förbindelser från mPFC till amygdala som skulle kontrollera amygdala aktivitet och produktion. Därför under de senaste åren har flera studier startade i ex vivo slice experiment för att undersöka synaptiska interaktioner mellan mPFC afferenter och specifika målceller i amygdala 14-17.

Under rädsla lärande, sensorisk information om rade och obetingade stimuli når amygdala via prognoser från specifika talamiska och kortikala regionerna. Plasticitet av dessa ingångar till neuroner i den laterala delen (LA) för basolateral amygdala (BLA) är en viktig mekanism som ligger bakom rädsla konditione 9,18. Ökande bevis tyder på att parallella plast processer i amygdala innebär hämmande element för att styra rädsla minne 19. En grupp klustrade hämmande nervceller är GABAergic mediala paracapsular inskjutna celler (mpITCs), men deras exakta anslutning och funktion är ofullständigt känd 20-22. Här är optogenetic krets kartläggning används för att bedöma afferenta och efferenta anslutning av dessa celler och deras inverkan på mål neuroner i amygdala, vilket visar att mpITCs få direkt sinnesintryck från talamiska och kortikala relästationer 23. Specifikt uttryck av Chr i mpITCs eller BLA nervceller möjliggör kartläggning av lokala interaktioner, avslöjar att mpITCs hämmar, utan även inbördes aktiveras genom BLA huvud nervceller, placera dem i nya feed-forward och återkoppling hämmande kretsar som effektivt styr BLA aktivitet23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik uttalande: Alla försöksförfaranden var i enlighet med EU-direktivet om användning av djur i forskning och har godkänts av den lokala Animal Care och användning kommittén (Regierungspräsidium Tübingen, delstaten Baden-Württemberg, Tyskland) som ansvarar för universitetet i Tübingen.

1. Stereotaktisk injektionsproceduren

  1. Förbered sterila verktyg (sax, skalpell, klämmor, borra, nålar, suturmaterial) med hjälp av en autoklav. Ordna sterila verktyg och andra erforderliga lösningar och kirurgi förnödenheter såsom sterila bomullsswappar, desinfektionsmedel, steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4), och H2O 2 på en steril kirurgisk duk.
  2. Dra glasmikropipetter för injektioner (Figur 1A, inlägg) med en 3 mm bred box filament på en horisontell mikro avdragare enligt tillverkarens anvisningar.
    Obs! För djupa injektioner, bör elektrod avsmalningen vara tillräckligtlång för att nå de ventrala flesta koordinaterna (ca 5 mm,. för koordinater, se 1.10).
  3. Foder 1 pl viruslösningen och 0,2 pl 0,1% snabb grön lösning i steril PBS (för bättre synlighet lösning i glaspipett). Fyll glaspipetter med blandning av viruslösningen och snabb grön med hjälp av en mikroliter pipett med en fin spets (Figur 1A, infälld).
    Notera: Arbete med rekombinanta Adenoassocierade virala vektorer (rAAV) anses biosäkerhetsnivån 1 (BSL 1) arbete och måste utföras i en BSL ett laboratorium. rAAVs används i denna studie (figur 1C) var: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (serotyp 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (serotyp 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1a-DIOhChR2 (H134R) -YFP (serotyp 2/1) 23
  4. Söva en mus med en liten djuranestesiapparaten (Isofluran: 3% i syre för induktion).
    Notera: Möss som användes i denna studie var 4 -7 veckor gamla och av följande stammar och genotyper: C57BL6 / J vildtyp (experiment i figurerna 2A och 3A-D); GAD67-GFP 24 (experiment i figurerna 2B och 3E-H); Tac2-Cre 25 (experiment i figurerna 2C och 3I-J).
  5. Raka huvudet mellan öronen och ögonen. Applicera desinfektionsmedel (providon-jod baserad) till rakat huvud med hjälp av bomullspinnar.
  6. Applicera en ögonsalva för att förhindra uttorkning av ögonen under anestesi. Subkutant injicera musen med smärtstillande (meloxikam-baserad, 0,1 ml av 5 mg / ml lösning).
  7. Placera musen i stereotaktisk ram (Figur 1A) och upprätthålla anestesi via en gas anestesi mask (Isofluran: 2% i syre för underhåll). Kontrollera anestesi djup med hjälp av lem tillbakadragande reflex innan du fortsätter.
    Obs: Bibehåll sterila förhållanden så bra som möjligt under hela kirurgiska ingrepp; Använd engångs ansiktsmask, kirurgiska gown och handskar.
  8. Gör huden snitt på toppen av huvudet med en sax. Dra försiktigt huden åt sidan med trubbiga pincett, fixa med klämmor för att exponera skallen ytan, och ren skalle med H2O 2.
  9. Markera platser injektion på skallen med hjälp av en fin spets märkpenna och borra hål för båda halvkloten (Figur 1B). Koordinater för injektioner i denna studie är (från bregma (mm)): mPFC: främre 1,9, lateral ± 0,3, ventrala 2,1; MGM / PIN: bakre 3,0, lateral ± 1,8, ventrala 3,8; mpITC / BLA: bakre 1,45, lateral ± 3,35, och ventrala 4,75.
  10. Mount fylld glaspipett på stereotaktiska ramen ansluten till en tryckinjektionsanordning och föra pipetten till Bregma position.
  11. Bryt av spetsen på glaspipett med fina raka spets pincett. Gör detta försiktigt för att förhindra aerosolbildning av viruslösningen. Se till pipettspetsen är öppen genom att tillämpa några tryckpulser och observera extrudering av droppar av virus lösning.
  12. Gå till de önskade injektions koordinater och injicera hälften av innehållet i pipetten (~ 0,5 l) med följande inställningar på insprutningsanordningen: Tryck: 20 psi, genomsnitt pulslängd: 30 ms, genomsnittligt antal pulser: 50.
  13. Lämna pipett på plats för ~ 1 minut före långsamt (1 mm / min) dra tillbaka den.
    Obs: Se till att pipetten inte blockeras innan du upprepar proceduren med samma pipett på andra halvklotet. Vid blockerad spets, ren eller bryta spets och noll pipett position vid Bregma igen.
  14. Ren skalle med PBS (pH 7,4), ta bort klämmor, försiktigt dra ihop huden, och sutur snittet med individuell knapp sutur (3 - 4 knop). Tillämpa desinfektionsmedel (providon-jod baserad) runt såret.
  15. Stoppa anestesi och inte lämnar musen utan uppsikt tills den är helt vaken. Håll enda förvaras eller återgå till sällskap av andra djur endast när den är helt återhämtat sig. Postoperativt, att fortsätta att övervaka hälsotillståndet, och admiter analgetikum vid behov. Följ förfaranden enligt de regler som framförts av den lokala Animal Care och användning kommittén.

2. Beredning av akut skivor

  1. Förbered ACSF, skärande lösning, verktyg (sax, skalpell, tång, spatel, Pasteurpipett) och agar block.
    Beakta: 1 L av artificiell cerebro-spinalvätska (ACSF) krävs per försök, och framställs genom att lösa kemikalier i dubbeldestillerat H2O som tidigare publicerats 16,23. Skär lösning framställs genom att komplettera 200 ml ACSF med 0,87 ml av 2 M MgSO 4 förrådslösning.
  2. Oxygenat ACSF och skärlösning genom hela experimentet med 95% O2 och 5% CO2.
  3. Djupt söva musen med hjälp av ett litet djur anestesiapparaten med hjälp av isofluran (3% syre). Kontrollera anestesi djup med hjälp av lem tillbakadragande reflex innan du fortsätter.
  4. Halshugga musen med stora saxar och omedelbart kylahuvudet i iskall lösning för kapning.
  5. Öppna skull av en enda mittlinjen snitt från kaudalt rostralt och tryck försiktigt bitar av skallen till sidor med pincett. Snabbt bort hjärnan genom att försiktigt lyfta det ur skallen med en liten rundad spatel. Avskurna lillhjärnan med skalpell. Placera hjärnan i iskallt lösning för kapning.
  6. För mPFC injektionsställen: avskuren främre delen av hjärnan (innehållande mPFC) med hjälp av en skalpell och sätta i iskall lösning för kapning tills skiv.
  7. Ta bort överflödig lösning för kapning med ett filterpapper och limma den bakre delen av hjärnan på vibratome scenen.
  8. För lutade amygdala skivor, limma hjärnan på en agar blocket (4%) skär vid en 35 ° vinkel (Figur 1D, mitten). För koronalt amygdala skivor MGM / PIN injektionsställen och mPFC injektionsställen, limma hjärnan direkt på scenen (figur 1D, vänster och höger). Placera ytterligare agar blocket bakom hjärnan för stabilitet medan skivning.
  9. place etappen i skärkammaren med iskall syreskärlösning som hålls vid 4 ° C med hjälp av ett kylaggregat. Förbered akuta skivor av amygdala (320 pm) med en safir blad. Placera skivor i ett gränssnitt kammare försedd med syresatt ACSF vid RT.
  10. Efter framställning av akuta amygdala skivor, placera gränssnittet kammaren i ett vattenbad vid 36 ° C för att återvinna skivor under 35 - 45 min. Därefter återvänder gränssnittskammaren till RT. För inspelning från dessa skivor, fortsätt med steg 3,2.
  11. Under inledningen av steg 2,10, skär skivor av injektionsstället som beskrivits tidigare för akut amygdala skivor (steg från 2,8 till 2,9). Återvinning av skivor i vattenbadet krävs inte här. Valfritt: Om du snabbt vill beräkna injektionsstället plats, observera skivor på en stereoskop utrustad med ett lysrör och lämpliga filteruppsättningar.
  12. Fix skivor som innehåller injektionsställen för post-hoc-analys genom sandwiching dem mellan två filterpapper och submerging dem i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS-lösning O / N. För analys av injektionsställen vidare med steg 4,1.

3. Visualisering och stimulering av Presynaptiska fibrer

  1. Förbered patch mikroskop för optogenetic aktivering av fibrer och celler:
    1. Centrera monterade Ijusemitterande diod (LED) på ljus leverans vägen.
    2. Mäta LED ljusintensiteten vid det bakre fokalplanet och vid utgången hos varje mål med en effektmätare med valet av lämplig våglängd på 470 nm.
    3. Beräkna ljusintensiteten i mW / mm 2 och skapa en kalibreringskurva (LED intensitet (%) jämfört med ljuseffekt (mW / mm 2)) för varje mål för värden som uppmätts för 470 nm våglängd.
  2. Hämta en akut amygdala skiva från gränssnittskammaren och plats i munstyckskammaren monterad på upprätt mikroskop utrustat med ett lysrör. Var noga med att placera skivan så att den slice yta uppåt i gränssnittet kammaren också uppåt i inspelningen kammaren. BEGJUTA skiva med färskt, syresatt ASCF med en hastighet av 1 - 2 ml / min vid en temperatur av ~ 31 ° C.
  3. Observera presynaptiska fibrer i segmentet med hjälp av lysrör i kombination med lämpliga filteruppsättningar för specifika fluorescerande proteinet uttrycks. Använd 5x mål att få en överblick (figur 1E) och 60x mål för bedömning av fibertätheten inom målområdet.
    Obs: För GFP och YFP, använda filter in "gröna" (excitation 472/20, stråldelaren 495, Emission 490 LP) för mCherry använda filter set "röd" (excitation 560/40, stråldelaren 585, Emission 630/70) enligt i material / utrustning tabell.
  4. Öppna eller begränsa öppningen i mikroskop ljus vägen som önskas för experimentet (figur 2D).
  5. För att få en patch inspelning, fylla en patch pipett med intern lösning och montera in elektrodhållare. Applicera positivt tryck till plåstret pipetten och långsamt sänka den först i badet lösning och sedan under visuell kontroll i segment med hjälp av mikromanipulator.
    1. Närma sig neuron av intresse med plåstret pipetten från sidan och uppifrån. Frigöra övertryck när pipetten befinner sig på ytan av cellen (dimple synlig på cellytan) och erhålla en "gigatätning" genom att applicera negativt tryck.
    2. Applicera ytterligare sug att brista membranet patch för att få helcells-inspelning. Därefter stimulera märkta fibrer med den anslutna LED med hjälp av lämplig våglängd för aktivering Chr (470 nm) under inspelning av elektriska svar från cellen.
    3. För synaptisk stimulering börja med en låg LED intensitet och öka tills den önskade synaptiska strömamplituden uppnås. Utlösa LED genom att konfigurera digitala utgångar i datainsamling programvara för att styra timing och pulslängd (exempel i figur3).
      Obs: annan programvara och / eller TTL-genererande enheter kan användas för att utlösa LED.
  6. Upprepa stimulering med öppen eller begränsad öppning (steg 3,4) i mikroskopets ljusvägen som önskas för nästa inspelade cellen och / eller i närvaro av specifika läkemedel.
  7. Efter inspelningen, fixa skivor för post-hoc-analys genom sandwiching dem mellan två filterpapper och dränka dem i 4% PFA O / N.
  8. Analysera elektrofysiologiska data.
    Obs: Använd lämplig programvara för att visualisera inspelade svepdata för varje enskild stimulering offline. Vid analys av effekterna av läkemedel, använder toppdetektering rutiner för att erhålla tidsförloppet för läkemedelseffekt på synaptiska nuvarande amplituder för alla enskilda svep. Bestäm när läkemedelseffekten når steady state. För att framställa representativa genomsnittssvar för siffror, använda programvara till genomsnittligt ≥10 enskilda svep per experimentell betingelse (jfr figur 3B-D, FH, J höger panel).
    Obs: flera alternativa programvarupaket kan användas för dataanalys.

4. Post-hoc-analys av injektionsställen

  1. Tvätta skivor av injektionsställen (från steg 2,12) och inspelningsplatser (om re-imaging önskas, från steg 3,7) tre gånger i PBS. Detta görs genom att upprepade gånger byta ut lösningen med färsk PBS på en roterande skakanordning tre gånger i 10 min.
  2. Förbered 2% agar-agarlösning i PBS, och låt det svalna till ~ 65 ° C. Placera skivor platt på botten av en liten 30 mm petri diameter skålen, bädda skivor i agar-agar och låt den svalna tills fast.
  3. Limma en agar block med inbäddade skiva eller skivor till stadiet av en vibratome och placera steg i skärkammaren med PBS.
  4. Resektion inbäddade skivor till 70 um tjocklek. Valfritt: Efter resektion, kan skivor färgas, dvs med Neurotrace att avslöja cytoarchitecture (Figur 3A, C), och / eller by immunofluorescens färgning för YFP eller mCherry att öka signalen från Chr-fusionsprotein.
  5. Montera skivor på diabilder och täck med monterings media. Bildinjektionsställen och, om så önskas, även bildskivor vilka innehåller fibrer i projektionsområden med användning av ett fluorescerande mikroskop eller ett konfokalt lasersvepmikroskop (figur 2A-C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta avsnitt visar arbetsflödet av en ex vivo optogenetic tillvägagångssätt och representativa resultat från olika experimentella strategier för att undersöka de fysiologiska egenskaperna hos sensoriska och modulerlångdistans prognoser till BLA och mpITC nervceller samt egenskaper hos lokala anslutning mellan mpITC och BLA.

Efter stereotaktisk injektion av utvalda virusvektor på de önskade koordinaterna i mushjärna (Figur 1A-C, viral expressions tid 2 - 6 veckor, beroende på experimentet), akut hjärnan skivor av injektionsstället och projektions områden i amygdala bereds vid den lämpliga vinkeln för patch-clamp-experiment och från den injicerade hjärnregion för post-hoc-analys av injektionsställen (Figur 1D). Innan du börjar inspelningar och optogenetic stimulans, fluorescensmärkta celler eller axonal probör kontrolleras jections i målområdet (amygdala) på upprätt mikroskop för patch-clamp inspelningar med hjälp av bifogade lysrör (figur 1E). Vid erhållande av ett patch-clamp inspelning från en förmodad målcell i projektionsområdet av den del, är lätta stimulering initieras medan tidpunkt, intervall, och pulslängd styrs via patch programvara som utlöser den Ijusemitterande diod (LED). Beroende på den experimentella strategin (Figur 2A-C, höger) öppningen i den fluorescerande ljusbanan är antingen helt öppen eller begränsas (figur 2D). Samtidigt hålla pulslängden konstant och så kort som möjligt (helst ≤1 ms), är LED utgångsintensitet långsamt ökade till bedöma vilka intensitet krävs för att uppnå den önskade amplituden hos den synaptiska respons i ett särskilt experiment (figur 2E). Efter inspelningen amygdala skivor är efter fast. Vid resektion och valfrittfärgning, injektion och inspelningsplatser avbildas på ett konfokalmikroskop att kontrollera injektions plats och att utesluta data från felplacerade injektioner. Bilder av injektionsställen och tillhörande axonal prognoser i amygdala för de tre försöksstrategier (mPFC ingångarna till BLA, talamus ingångar till mpITCs och lokala mpITC aktivering) visas i figur 2A-C.

Figur 3 visar representativa inspelnings resultaten från BLA huvud neuroner, lokala BLA intern och mpITC nervceller som illustrerar egenskaperna hos ljus evoked potential för de olika experimentella strategier som används (Figur 3A, E, I). Att rikta GABAergic neuroner (lokala interneuronen och mpITCs) för inspelning, var GAD67-GFP reporter möss används 24. För mPFC och sensoriska talamus prognoser kan studeras flera aspekter av synaptisk transmission. Den temporala precision över activation och de kinetiska egenskaperna hos de ChRs användes i denna studie möjliggöra tillförlitlig stimulering med parade pulser vid en inter-stimulus-intervall på 50 msek. Detta möjliggör analys av parade pulskvoter (PPR) av postsynaptiska strömmar (PSC), som antingen kan vara att underlätta eller deprimerande beroende på projektion och mål celltyp, och fungerar som indikatorer på presynaptisk frisättning sannolikhet (Figur 3B, F, H) . Dessutom analys av synaptiska latenser medger dissektion av olika postsynaptiska svar komponenter.

I detta exempel, längre latenser av den inhiberande PSC (IPSC) som funktion av excitatoriska PSC (epsc) komponenten indikera en disynaptic och monosynaptic ingång, respektive (Figur 3C). I andra fall kan en mer noggrann analys av ytterligare epsc egenskaper såsom svar jitter eller variationskoefficient svar storlek behövas för att dra slutsatser om dess mono- eller disynaptic natur 17,23. Dessutom kan tillämpning av farmakologiska blockerare för specifika receptorer identifiera vilken typ av PSC (dvs glutamaterg epsc och GABAergic IPSC figur 3C-D). Som väntat, den tidiga komponenten av mPFC ingång var glutamaterga, medan den sena komponenten var GABAergic. Den kompletta block av både epsc och IPSC med glutamatreceptorblockerare CNQX stödjer vidare att IPSC är disynaptic. För att undersöka modulering av synaptisk transmission vid optogenetically aktiverade fibrer, kan effekterna av agonister och antagonister för metabotropiska receptorer (här GABA B-receptorer) på amplitud och PPR bedömas för att utvärdera påverkan på pre- och postsynaptiska platser. I detta exempel är den åtföljande minskning av amplituden med en ökning av PPR som indikerar en presynaptisk modulering av ljusaktiverade fibrer (3G, H). Slutligen kan lokala interaktioner av celler i amygdala bedömas, till exempel,när möss som uttrycker Cre under kontroll av Tac2 promotorn 25 injiceras med en dubbel-floxed CHR som uttrycker viral vektor (Figur 1C). Eftersom Tac2 och därmed är CHR uttrycks i mpITC och centrala amygdala (Figur 2C), var ljusaktivering begränsas till mpITC genom att stänga fluorescerande ljusbanan öppning (figur 2D). Under dessa betingelser, kan ljus-framkallade aktionspotentialer framkallas i infekterade mpITCs. Korta latency hämmande synaptiska svar i BLA indikera närvaron av en funktionell inhiberande anslutning mellan mpITC och BLA huvudsakliga neuroner.

Figur 1
Figur 1. stereotaktiska injektioner, Beredning av akut hjärnan skivor, och visualisering av Presynaptiska fibrer. (A, B) Stereotaktisk virus injektion. A) Bild på sövda mus placeras i en stereotaktisk ram med skallen exponerades ochinjektion pipett. Infällt: Zooma in bilden injektions pipett fylld med virus lösning blandas med snabb grönt. Skala bar: 3 mm. (B) Schematisk bild av en mus skalle med markerade positionerna för borrhålen för injektions olika områden. (C) Schema som visar olika virala konstruktioner som används i denna studie. Mörkgrå: promotorsekvens; blått: Channelrhodopsin2 (ChR2 (H134R)); grön / röd: fluorescerande protein. Expression tid var 2 veckor för lokala amygdala prognoser och 4 - 6 veckor för prognoser från mPFC och MGM / PIN-kod. (D) Framställning av akut hjärnan skivor: schema som visar placeringen av mushjärna på skivare scenen för att erhålla skivor från injektion och projektions olika områden. (E) Visualisering av fibrer i akut hjärnan skivor från en GAD67-GFP mus injiceras med ChR2-mCherry virus i MGM / PIN-kod. Bilder tas på upprätt patch mikroskop med olika filteruppsättningar: GAD67-GFP uttryck, mitt; MGM / PIN fibrer märkt med mCHerry, höger. Skala bar: 200 nm. mPFC, mediala prefrontala cortex; mpITC, mediala paracapsular inskjutna celler; BLA, basolateral amygdala; MGM, medial geniculate kärna, medial del; PIN, bakre intralaminära talamisk kärna; LA, lateral amygdala; BA, basal amygdala; CEA, centrala kärnan av amygdala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. injektionsställen, Projektionsområden och optogenetic Stimulering av axonal prognoser. (AC) Confocal bilder av representativa injektionsställen och projektionsområden i BLA och system för de experimentella strategier. (A) Vänster: mPFC injektionsstället i en C57BL / 6 mus färgas med Neurotrace. Skala bar:500 | j, m. USA: motsvarande prognoser i BLA i en lutande amygdala skiva. Skala bar: 200 nm. Höger: Schematisk bild av hela fältet belysning av mPFC prognoser och registrering av neuron i BLA. (B) Vänster: MGM / PIN injektionsstället i en GAD67-GFP mus. Skala bar: 500 nm. USA: Motsvarande prognoser i mpITC och LA av en coronal amygdala skiva. Skala bar: 200 nm. Höger: Schematisk bild av hela fältet belysning av MGM / PIN prognoser och inspelning av en mpITC neuron. (C) Vänster: Lokala uttryck för ChR2-YFP i en Neurotrace färgade amygdala bit av en Tac2-Cre mus. Skala bar: 200 nm. Infällt: Zooma in på mpITCs uttrycker ChR2-YFP. Skala bar: 20 pm. Höger: Schematisk med begränsad belysning av mpITC kluster och inspelning av en BLA neuron. (D) Bilder på inspelningskammaren under ljus leverans och bilden av nervceller i akuta hjärnan skivor (mpITC kluster) i en GAD67-GFP mus med öppen och begränsad aperTure. Skala bar: 30 pm. (E) Excitatoriska postsynaptiska strömmar (EPSCs) framkallade av olika LED-intensiteter (överst) och kurva över ljuseffekt kontra evoked epsc amplitud (botten) från ett representativt mpITC neuron vid optogenetic aktivering av fibrer från mgm / PIN. Skala bar: 100 pA / 10 msek.
Obs: Fig. 2A är modifierad från referens # 16 och figur 2C från referens # 23 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Exempel på resultat från optogenetic Aktivering av långdistans och lokala prognoser. (A) ordning för experimentell strategi för (BD). (B) Representativa EPSCs spelats in från en BLA huvud neuron ochBLA interneuronen på optogenetic parade pulsstimulering (50 ms mellan stimulus-intervall) av fibrer från mPFC framkalla parade pulsen underlättande och parade puls depression, respektive. Skala bar: 100 pA / 25 msek. (C) optogenetic aktivering av fibrer från mPFC framkallar frammatnings hämning. Vänster: representant epsc (vid -70 mV) och hämmande postsynaptisk ström (IPSC, vid 0 mV) i en BLA huvud neuron. IPSC har en längre synaptisk latens jämfört med epsc. Skala barer: 200 Pa / 10 msek och 200 Pa / 2 ms. Höger: Lätt framkallade bifasisk epsc / IPSC sekvens (vid -50 mV) blockeras av AMPA / kainat-antagonist CNQX (10 nm), ytterligare stöder disynaptic karaktär IPSC. Skala bar: 50 pA / 5 ms. (D) Effekterna av efterföljande block av epsc / IPSC sekvens (vid -50 mV) från Cl - kanalblockerare pikrotoxin (PTX, 100 M) och PTX + CNQX. IPSC blockeras av PTX och resterande epsc av CNQX. Skala barer: 50 PA / 5 ms. (E) Scheme of experimentell strategi för (FH). F) Representativa EPSCs som spelats in från en mpITC och BLA huvud neuron vid optogenetic parade puls stimulering av fibrer från MGM / PIN-kod. Skala bar: 50 pA / 20 ms. (G) EPSCs i en annan mpITC neuron är blockerade av natriumkanalblockerare Tetrodotoxin (TTX, 0,5 ^ M), vilket indikerar att de är beroende av natriumkanalaktivitet. Skala bar: 50 pA / 20 ms. (H) thalamus ingångar till mpITC nervceller moduleras av presynaptiska GABA B-receptorer. EPSCs under kontroll tillstånd, minskning av epsc amplitud och samtidig ökning av parade pulskvot under applicering av GABA B-agonist Baklofen (2 M), och återvinning av både amplitud och inledande parade pulsen ranson vid samtidig tillämpning av GABA B-antagonisten CGP55845 (10 ^ M). Dessa förändringar är ett tecken på en presynaptisk modulering genom GABA B-receptorer. Skala bar: 50 pA / 20 ms. (I) ordning för experimentell strategi för (J). (J) Ljus framkallade aktionspotentialer som spelats in från en ChR2-YFP som uttrycker mpITC neuron. Ljus framkallade iPSCs spelats in från en BLA huvud neuron vid olika hållpotentialer (-90, -70, -50, -20, och 0 mV) vända runt den beräknade jämviktspotentialen för Cl -. Skalstrecken: 20 mV / 100 msek och 10 pA / 10 msek. Obs: Fig. 3B-D ändras från referens # 16, och figur 3H och J från referens # 23 klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll beskriver en metod för ex vivo optogenetic undersökning av nervbanor och lokala anslutningar som enkelt kan implementeras på de flesta, om inte alla, upprätt skiva patch-clamp inspelning inställningar genom att förse dem med en ~ 470 nm LED i epifluorescence ljus port. En stor fördel med optogenetic stimulering av axonal prognoser i skivor är att det möjliggör för specifik aktivering och undersökning av egenskaper hos anslutningar som inte var tillgänglig med konventionell elektrisk stimulering, eftersom motsvarande fibervägarna inte var kända, inte tydligt definierade, eller bevaras inte i en enda hjärna skiva. Som ett viktigt exempel är relevant för rädsla kretsar, är det illustreras hur detta kan användas för att dissekera egenskaper mPFC ingångar till amygdala.

Även i de fall där elektrisk fiberkanalen stimulering har i stor utsträckning använts i tidigare studier, dessa skrifter bär ofta fibrer från olika ursprungsregioner. Till exempel, i kretsar med anknytning till frukta lärande prognoser från olika sensoriska talamiska kärnor eller kortikala regioner blandade genom interna och externa kapslar, respektive. Fördelen med optogenetic stimulering är att den möjliggör selektiv aktivering av en undergrupp av fibrer från ett definierat område. Detta illustreras för specifika talamus ingångar från PIN och MGM inskjutna celler och sido amygdala huvud celler. Dessutom kan problem som uppstår med elektrisk stimulering, dvs aktivering av andra fibrer av passage eller celler i närheten av stimulerande elektrod som kan göra lokala anslutningar i målområdet övervinnas. Men medan optogenetic stimulering är lika snabb som elektrisk stimulering, kan det finnas begränsningar beträffande stimuleringsfrekvensen som kan appliceras på ett tillförlitligt sätt. Detta beror på inaktive och deinactivation kinetik och variant av Chr som används, 4 samt expression nivåer och metoder, och lätta stimuleringsmetoder 26.

Vid användning av en LED monterad på fluorescens-port för ljusstimulering, typiskt hela synfältet för en given mål belyst, vilket resulterar i aktivering av alla fibrer eller celler i fältet och inom ett visst djup. Detta kan endast delvis begränsas till en mindre region eller en uppsättning av märkta celler (i detta exempel, den mpITC) med användning av en öppning i den fluorescerande ljusbanan 23,27. Med lysdioder är ljuseffekt inte en fråga, eftersom hög effekt blå lysdioder finns nu tillgängliga från många tillverkare. Men emissionsspektra har full bredd halv maxvärden för flera tiotal nanometer. Därför lysdioder utgör begränsningar när antingen rums exakt stimulering för subcellulär kartläggning av anslutning och / eller monokromatisk stimulering önskas. Båda kan förbättras genom att använda blå lasrar som ljuskällor, typiskt i kombination med mer sofistikerade uppställningar som möjliggör tjärageting och / eller scanning av strålen i små områden och definierade vävnadsdjup (t.ex. se 28).

Med ex vivo optogenetic metod som beskrivs här, kan studeras flera egenskaper hos synaptisk transmission. För att bedöma monosynapticity av den tidiga synaptiska svar komponent, grundlig analys av latenser och deras jitter, liksom responsamplitud variansen bör användas på ett representativt urval av inspelade neuroner (t.ex., se 16,17,23). I fall där aktivering av nätverksaktivitet kan spela en roll, är den metod som före att isolera den direkta monosynaptic komponent genom applicering av en kombination av tetrodotoxin (TTX) för att blockera aktionspotentialer i kombination med K + kanalblockerare 4-aminopyridin (4- AP) för att förhindra repolarisering 14,28,29. Receptorerna medierar mono- och disynaptic komponenter ingångar kan identifieras med hjälp av farmakologiska blockerare. Furthermore, är det möjligt att studera aspekter av presynaptisk modulering av optogenetically aktiverade ingångar i amygdala 23,30. En potentiell protest är att ChR2 har några kalciumpermeabilitet 1,4 och dess aktivering i presynaptiska fibrer och terminaler har föreslagits för att förändra frigör sannolikhet av olika mekanismer 26,31. Icke desto mindre flera studier inklusive exempel som visas här med framgång ChR2 uttryck för att identifiera input och rikta cellspecifika skillnader i parade pulskvoterna i amygdala och andra hjärnområden 16,23,26,32 och dessutom visat modulering av frisättnings sannolikhet genom aktivering specifika signalvägar i presynaptiska terminaler som inte hindras av Chr aktivering 23,30. Ytterligare stöd kommer från data i hippocampus och lillhjärnan, som visar att med lämpliga Chr uttrycksmetod och ljusstimulering teknik, fysiologiska aspekter, inklusive effekten av utsläpp och trohet of synaptisk överföring tillförlitligt kan studeras 26. Slutligen optogenetic fiberaktivering har också med framgång användas för att applicera stimuleringsprotokoll som inducerar synaptisk plasticitet 31,33,34.

Flera aspekter är avgörande för att lyckas med denna metod. En är precisionen hos stereotaktisk inriktning av virala vektorer. Därför är det lämpligt att snabbt bedöma injektionsstället plats innan de har fått inspelningar och sedan utföra en mer detaljerad post-hoc-analys. Förutom rumslig precision, är viabiliteten av neuroner vid injektionsstället en avgörande faktor för ett lyckat experiment och beror på injektionstekniken. Den presenterade alternativet, med användning av långa och tunna avsmalnande glaselektroder, tjänar detta syfte väl för både ytliga och djupare områden i hjärnan, men kan ha den nackdelen att avsmalningen är mycket flexibel. Ett alternativ är att använda mikroliter sprutor speciellt utvecklade för stereotaktisk leverans inom neurovetenskap (neuro-syringes) med styvare nålar som kan undvara små volymer. Specificiteten att rikta Chr-uttryck definierade typer och regioner cell kan förbättras ytterligare med hjälp av villkorligt uttryck 7, till exempel med Cre-systemet som illustreras för amygdala inskjutna celler. Detta tillåter också användningen av starka promotorer i Cre-beroende virala vektorer.

En annan kritisk aspekt är valet av den virala vektorn. För att uttrycka CHR ades rekombinanta Adenoassocierade virus (rAAVs) användas, som har fördelen av att vara en biosäkerhetsnivån 1-vektorer jämfört med andra populära virala system. rAAVs har använts under en längre tid och är i allmänhet säkra och tillförlitliga vektorer med god neurala tropism och liten eller ingen immunogen potential, men deras förpackningar volym är begränsad (ca. 4-5 kb) 35. I dessa specifika experiment, serotyperna 2/9 och 2/1 användes för allestädes närvarande och villkorsuttryck, respektive. I enlighet med litteraturen, denSE serotyper omvandla celler i målområdet, men verkar inte tas upp av axoner att retrograd etikett celler, till skillnad från serotyperna 2/5 och 2/6 36,37. Dock bör inledande experiment utesluta att det finns Chr-märkta cellkroppar i områden som skjuter till injektionsstället, vilket är särskilt viktigt när man studerar inbördes förbundna områden i hjärnan som mPFC och amygdala. Flera nya studier jämfördes effekten av rAAV serotyper i olika hjärnområden hos råttor och möss 36,38,39. En framväxande tema är att nyare serotyper (t.ex. 2/1, 2/8 och 2/9) är i allmänhet mer effektiva än den ursprungliga 2/2 serotyp. Värt att notera, rAAV-medierad uttryck av CHR, i motsats till andra metoder, inte orsaka skadliga effekter på uttryckande celler eller märkta axoner 40. Den erforderliga expressions tiden för att uppnå effektiv fiber aktivering ex vivo förefaller bero på avståndet av utsprånget studeras. Här och i överensstämmelse med liteperatur, för märkning och aktivering av långdistansförbindelser i mus (mPFC och sinnesintryck), ett uttryck på 4 - 8 veckor krävs, medan det för att studera lokal anslutning i amygdala, kortare uttryck gånger av 2 - 3 veckor är tillräcklig 14-17,23,30,34.

För inspelning av optogenetically-framkallade svar i målområdet, två faktorer är avgörande: 1) den akuta hjärnan skiva måste vara av god kvalitet och 2) en avsevärd mängd av livskraftiga märkta fibrer måste bevaras. Kvaliteten på skivor kan förbättras genom att använda safir bladen för skivning. Konservering av axoner och därmed storlek och stabilitet av lätta svar kan förbättras genom att skära skivor i en viss vinkel, såsom visas för mPFC-amygdala utsprång (figur 1D och 2A) 16,34. Detta beror dock starkt på orienteringen av afferenter i målområdet och måste bestämmas för varje kombination av projektionsytan och tarFå regionen. I detta avseende kan post-hoc analys av prognoser i målområdet vara användbar. För att öka fiber upptäcka och kringgå blekning som kan ha inträffat under skiva stimulering, immunofärgning mot den fluorescerande taggen på Chr-fusionsproteinet kan användas.

Totalt sett denna metod för optogenetic krets kartläggning har nyligen inte endast tillämpats att frukta kretsar, men många andra system i hjärnan. I framtiden kommer inriktning av subnuclei och specifika celltyper genom att kombinera ett ökande utbud av genetiskt modifierade mus linjer och villkorliga virala vektorer ger en ännu mer detaljerad förståelse för mångfalden av funktionella synaptiska egenskaper hos specifika lokala och långväga kretsar. Dessutom kan post-hoc immunmärkningen av fluorescerande-märkta CHR i undersökta funktionella anslutningar kombineras med ultra analys (dvs med hjälp av elektronmikroskopiska metoder) för att ge insikter i exakt morgiska egenskaperna hos tidigare aktiverade synapser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgery
Stereotactic frame Stoelting, USA 51670 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Steretoxic frame mouse adaptor Stoelting, USA 51625 can be replaced by other stereotactic frame for mice
Gas anesthesia mask for mice Stoelting, USA 50264 no longer available, replaced by item no. 51609M
Pressure injection device, Toohey Spritzer Toohey Company, USA T25-2-900 other pressure injection devices (e.g. Picospritzer) can be used
Kwik Fill glass capillaries World Precision Instruments, Germany 1B150F-4
Anesthesia machine, IsoFlo Eickemeyer, Germany 213261
DC Temperature Controler and heating pad FHC, USA 40-90-8D
Horizontal Micropipette Puller Model P-1000 Sutter Instruments, USA P-1000
Surgical tool sterilizer, Sterilizator 75 Melag, Germany 08754200
rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (serotype 2/9) Penn Vector Core, USA AV-9-26973P
rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (serotype 2/9)  Penn Vector Core, USA AV-9-20938M
rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (serotype 2/1)  Penn Vector Core, USA AV-1-20298P
fast green Roth, Germany 0301.1
Isoflurane Anesthetic, Isofuran CP (1ml/ml) CP Pharma, Germany
Antiseptic, Betadine (providone-iodine) Purdure Products, USA BSOL32 can be replaced by other disinfectant
Analgesic, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam) Boehringer Ingelheim, Germany can be replaced by other analgesics
Bepanthen eye ointment Bayer, Germany 0191 can be replaced by other eye ointment
Drill NM3000 (SNKG1341 and SNIH1681) Nouvag, Switzerland
Sutranox Suture Needle Fine Science Tools, Germany 12050-01
Braided Silk Suture Fine Science Tools, Germany 18020-60
Recordings, light stimulation, and analysis
artificial cerebrospinal fluid (ACSF) for composition see references #16 and #23
internal patch solutions for composition see references #16 and #23
MagnesiumSulfate Heptahydrate Roth, Germany P027.1 prepare 2M stock solution in purified water
Slicer, Microm HM650V Fisher Scientific, Germany 920120
Cooling unit for tissue slicer, CU65 Fisher Scientific, Germany 770180
Sapphire blade Delaware Diamond Knives custom order, inquire with company
Stereoscope, SZX2-RFA16 Olympus, Japan
Xcite fluorescent lamp (XI120Q-1492) Lumen Dynamics Group, Canada 2012-12699
Patch microscope, BX51WI Olympus, Japan
Multiclamp 700B patch amplifier  Molecular Devices, USA
Digitdata 1440A Molecular Devices, USA
PClamp software, Version 10 Molecular Devices, USA used to control data acquisition and stimulation
Bath temperature controler, TC05 Luigs & Neumann, Germany 200-100 500 0145
Three axis micromanipulator Mini 25 Luigs & Neumann, Germany 210-100 000 0010
Micromanipulator controller SM7 Luigs & Neumann, Germany 200-100 900 7311
glass capillaries for patch pipettes World Precision Instruments, Germany GB150F-8P
Cellulose nitrate filterpaper for interface chamber  Satorius Stedim Biotech, Germany 13006--50----ACN
LED unit, CoolLED pE CoolLED, UK 244-1400 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
CoolLED 100 Dual Adapt CoolLED, UK pE-ADAPTOR-50E CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
LED unit, USL 70/470 Rapp Optoelectronic L70-000 CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Dual port adapter Rapp Optoelectronic inquire with company CoolLED or USL 70/470 and appropriate adapters are two alternative choices for LED stimulation
Filter set red (excitation) AHF, Germany F49-560 Filters can be bought as set F46-008
                     (beamsplitter) AHF, Germany F48-585 Filters can be bought as set F46-008
                     (emission) AHF, Germany F47-630 Filters can be bought as set F46-008
Filter set green (excitation) AHF, Germany F39-472 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (beamsplitter) AHF, Germany F43-495W Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
                         (emission) AHF, Germany F76-490 Alternatives: filterset F36-149 or F46-002 (with bandpass emission)
LaserCheck, handheld power meter Coherent, USA 1098293
IgorPro Software, Version 6 Wavemetrics, USA for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Neuromatic suite of macros for IgorPro http://www.neuromatic.thinkrandom.com for electrophysiology data analysis, other alternative software packages can also be used 
Post hoc analysis of injections and projections
Paraformaldehyde powder (PFA) Roth, Germany 0335.2
Neurotrace 435/455 blue fluorescent Nissl stain Invitrogen N-21479
agar-agar for embedding and resectioning Roth, Germany 5210.3
30 x 10 mm petri dishes for embedding SPL Life Sciences alternatives can be used
Slides, Super Frost R. Langenbrinck, Germany 61303802 alternatives can be used
cover slips R. Langenbrinck, Germany 3000302 alternatives can be used
Vecta Shield mounting medium Vector Laboratories, USA H-1000 alternative mounting media can be used
cellulose nitrate filter for flattening slices for fixation Satorius Stedim Biotech, Germany 11406--25------N
Confocal Laser Scanning Microscope LSM 710 Zeiss, Germany

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  3. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat Rev Neurosci. 13, (4), 251-266 (2012).
  4. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Optogenetics in neural systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  5. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10, (5), 663-668 (2007).
  6. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, (6), 3166-3173 (2006).
  7. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in the mouse. Annu Rev Neurosci. 36, 183-215 (2013).
  8. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu Rev Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  9. Pape, H. C., Pare, D. Plastic synaptic networks of the amygdala for the acquisition, expression, and extinction of conditioned fear. Physiol Rev. 90, (2), 419-463 (2010).
  10. Myers, K. M., Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry. 12, (2), 120-150 (2007).
  11. Quirk, G. J., Mueller, D. Neural mechanisms of extinction learning and retrieval. Neuropsychopharmacology. 33, (1), 56-72 (2008).
  12. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13, (6), 728-733 (2006).
  13. Sierra-Mercado, D., Padilla-Coreano, N., Quirk, G. J. Dissociable roles of prelimbic and infralimbic cortices, ventral hippocampus, and basolateral amygdala in the expression and extinction of conditioned fear. Neuropsychopharmacology. 36, (2), 529-538 (2011).
  14. Cho, J. H., Deisseroth, K., Bolshakov, V. Y. Synaptic encoding of fear extinction in mPFC-amygdala circuits. Neuron. 80, (6), 1491-1507 (2013).
  15. Arruda-Carvalho, M., Clem, R. L. Pathway-Selective Adjustment of Prefrontal-Amygdala Transmission during Fear Encoding. J Neurosci. 34, (47), 15601-15609 (2014).
  16. Hubner, C., Bosch, D., Gall, A., Luthi, A., Ehrlich, I. Ex vivo dissection of optogenetically activated mPFC and hippocampal inputs to neurons in the basolateral amygdala: implications for fear and emotional memory. Front Behav Neurosci. 8, 64 (2014).
  17. Strobel, C., Marek, R., Gooch, H. M., Sullivan, R. K., Sah, P. Prefrontal and Auditory Input to Intercalated Neurons of the Amygdala. Cell Rep. 10, (9), 1435-1442 (2015).
  18. Sigurdsson, T., Doyere, V., Cain, C. K., LeDoux, J. E. Long-term potentiation in the amygdala: a cellular mechanism of fear learning. Neuropharmacology. 52, (1), 215-227 (2007).
  19. Ehrlich, I., Humeau, Y., Grenier, F., Ciocchi, S., Herry, C., Luthi, A. Amygdala inhibitory circuits and the control of fear memory. Neuron. 62, (6), 757-771 (2009).
  20. Millhouse, O. E. The intercalated cells of the amygdala. J Comp Neurol. 247, (2), 246-271 (1986).
  21. Busti, D., et al. Different fear states engage distinct networks within the intercalated cell clusters of the amygdala. J Neurosci. 31, (13), 5131-5144 (2011).
  22. Palomares-Castillo, E., Hernandez-Perez, O. R., Perez-Carrera, D., Crespo-Ramirez, M., Fuxe, K., Perez de la Mora, M. The intercalated paracapsular islands as a module for integration of signals regulating anxiety in the amygdala. Brain Res. 1476, 211-234 (2012).
  23. Asede, D., Bosch, D., Luthi, A., Ferraguti, F., Ehrlich, I. Sensory inputs to intercalated cells provide fear-learning modulated inhibition to the basolateral amygdala. Neuron. 86, (2), 541-554 (2015).
  24. Tamamaki, N., Yanagawa, Y., Tomioka, R., Miyazaki, J., Obata, K., Kaneko, T. Green fluorescent protein expression and colocalization with calretinin, parvalbumin, and somatostatin in the GAD67-GFP knock-in mouse. J Comp Neurol. 467, (1), 60-79 (2003).
  25. Mar, L., Yang, F. C., Ma, Q. Genetic marking and characterization of Tac2-expressing neurons in the central and peripheral nervous system. Mol Brain. 5, (2012).
  26. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. J Neurosci. 34, (22), 7704-7714 (2014).
  27. Li, H., Penzo, M. A., Taniguchi, H., Kopec, C. D., Huang, Z. J., Li, B. Experience-dependent modification of a central amygdala fear circuit. Nat Neurosci. 16, (3), 332-339 (2013).
  28. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457, (7233), 1142-1145 (2009).
  29. Felix-Ortiz, A. C., Beyeler, A., Seo, C., Leppla, C. A., Wildes, C. P., Tye, K. M. BLA to vHPC inputs modulate anxiety-related behaviors. Neuron. 79, (4), 658-664 (2013).
  30. Chu, H. Y., Ito, W., Li, J., Morozov, A. Target-specific suppression of GABA release from parvalbumin interneurons in the basolateral amygdala by dopamine. J Neurosci. 32, (42), 14815-14820 (2012).
  31. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nat Methods. 4, (2), 139-141 (2007).
  32. Britt, J. P., Benaliouad, F., McDevitt, R. A., Stuber, G. D., Wise, R. A., Bonci, A. Synaptic and behavioral profile of multiple glutamatergic inputs to the nucleus accumbens. Neuron. 76, (4), 790-803 (2012).
  33. Kohl, M. M., Shipton, O. A., Deacon, R. M., Rawlins, J. N., Deisseroth, K., Paulsen, O. Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity. Nat Neurosci. 14, (11), 1413-1415 (2011).
  34. Morozov, A., Sukato, D., Ito, W. Selective suppression of plasticity in amygdala inputs from temporal association cortex by the external capsule. J Neurosci. 31, (1), 339-345 (2011).
  35. Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nat Rev Neurosci. 4, (5), 353-364 (2003).
  36. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8, (9), (2013).
  37. Salegio, E. A., et al. Axonal transport of adeno-associated viral vectors is serotype-dependent. Gene Ther. 20, (3), 348-352 (2013).
  38. Holehonnur, R., et al. Adeno-associated viral serotypes produce differing titers and differentially transduce neurons within the rat basal and lateral amygdala. BMC Neurosci. 15, (2014).
  39. McFarland, N. R., Lee, J. S., Hyman, B. T., McLean, P. J. Comparison of transduction efficiency of recombinant AAV serotypes 1, 2, 5, and 8 in the rat nigrostriatal system. J Neurochem. 109, (3), 838-845 (2009).
  40. Miyashita, T., Shao, Y. R., Chung, J., Pourzia, O., Feldman, D. E. Long-term channelrhodopsin-2 (ChR2) expression can induce abnormal axonal morphology and targeting in cerebral cortex. Front Neural Circuits. 7, (2013).
<em>Ex vivo</em> optogenetic Dissekering av skräck kretsar i hjärnan skivor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).More

Bosch, D., Asede, D., Ehrlich, I. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (110), e53628, doi:10.3791/53628 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter