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Neuroscience

Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings

doi: 10.3791/53854 Published: May 7, 2016

Abstract

Um romance técnica de dissecção ea gravação é descrita para o acendimento monitoramento aferentes evocada pelo deslocamento mecânico de cadeiras no pavilhão auricular mouse. A técnica é muito custo-efetivo e facilmente realizado com materiais normalmente encontrados na maioria dos laboratórios de eletrofisiologia, ou facilmente adquiridos. A dissecção é simples e rápido, com o deslocamento mecânico fornecido por um wafer eletrocerâmicos genérico controlado por software proprietário. O mesmo software também registra e analisa a saída electroneurogram. A gravação da atividade do nervo evocado é através de um amplificador diferencial comercial ligado à microeletrodos de vidro padrão polido-fogo. dicas úteis são dadas para a melhoria da qualidade da preparação, o estímulo e as condições de gravação para otimizar a qualidade de gravação. O sistema é apropriado para ensaiar as propriedades electrofisiológicas e ópticas dos terminais lanceoladas terminações de paliçada de folículos de cabelo, bem como aos resultados a partir da sua manipulação farmacológica e / ou genética. Um exemplo da combinação de gravação eléctrico com a estimulação mecânica e etiquetagem com um corante vital estiril piridínio é dada.

Introduction

Os terminais lanceoladas de axônios sensitivos que inervam folículos pilosos em mamíferos formam paliçadas em todo o epitélio de cabelo eixo. Sua finalidade é detectar deslocamento mecânico dos pêlos que cercam. Eles são uma mistura de rápida e lenta adaptação terminações que produzem predominantemente rajadas curtas de atividade em resposta ao movimento do cabelo. Actividade deixa muito rapidamente quando o movimento pára, mesmo na presença de deslocamento continuado. Aqui nós descrevemos o desenvolvimento deste modelo de orelha de murino para estudos correlativos da estrutura e função em terminais lanceoladas. O pavilhão tem muitas características vantajosas para estudar essas terminações. Em primeiro lugar, o pavilhão auricular é essencialmente duas camadas de pele transformada num back-to-back, com pouca outro tecido entre a interferir com o acesso para os folículos e terminais. A pele é muito fina e facilmente dissecados devido a quantidades mínimas de tecido conjuntivo resistente. A inervação é facilmente acessível e identificável. Enquanto follicl cabeloes estão presentes, eles são relativamente pouco distribuída, facilitando a estimulação dos indivíduos ou pequenos grupos de folículos mecanicamente. A camada dérmica subjacente fina dá boa acessibilidade aos terminais nervosos com drogas farmacológicas e corantes. Isso os torna particularmente ideal para estudos de imagem por microscopia de fluorescência. A imagem pode ser tanto em terminais vivos, ou após a fixação e posterior processamento histológico.

As respostas de neurónios que enervam mecanosensorial folículos de cabelo têm sido tradicionalmente estudado em roedor vibrissas 1,2 e, em menor grau, em preparações isoladas de pele 3,4. Estes têm ensinou-nos muito sobre os princípios gerais da fisiologia mecanosensorial nas terminações nervosas em torno do eixo do cabelo. A preparação das vibrissas permite um controlo excelente sobre o movimento de um único folículo piloso. No entanto, pode ser difícil para decifrar a saída, devido à sua complexidade, como vibrissasfolículos conter pelo menos 8 tipos diferentes de final mecanosensorial anatomicamente distinta 5 ea correspondência entre estes tipos morfológicos a respostas eletrofisiológicas específicos continua a ser uma questão de disputa. A preparação nervo pele do rato / safena é mais frequentemente usado em seu estado depilada para investigar toque e dor respostas. A inervação dos folículos pilosos em uma tal preparação é menos complexo, mas a densidade dos folículos pilosos, além da presença de três tipos foliculares diferentes (guarda, Awl / auchene e cabelos ziguezague) em tal proximidade 6, significa estudar as respostas específicas de um único folículo ou tipo único de final é novamente um desafio. Além disso, esta preparação envolve uma dissecção complexo. Finalmente, em ambas as vibrissas e outras preparações para a pele, é difícil visualizar as terminações envolvidas enquanto ex vivo preparações estão ainda vivos. Assim, o seccionamento de tecidos é necessária mesmo em linhas de rato que expressam GFP. alternatively, requer mais processamento histológico / imunológico, tais como a fixação e / ou incubação do anticorpo para imunofluorescência.

Temos, portanto, desenvolvido a preparação pavilhão auricular e é usado para fazer gravações elétricos a partir de uma população restrita de aferentes folículo piloso e mostrar que o ciclismo membrana ocorre nessas terminações lanceoladas, evidenciadas por captação de corantes de estirilo pirid�nio. Finalmente, mostrámos que o corante não interfira com sensibilidade mecânica, indicando que ele não bloqueia os canais mecanotransdução. Os resultados de protocolos de estimulação e análise simples são ilustrados.

Protocol

Rato post mortem colheita de tecidos devem usar métodos aprovados éticos. No Reino Unido, deslocamento cervical é um método aprovado do governo para ratos adultos (a listado método de Programação 1 no Reino Unido Animals (Scientific Procedures) Act de 1986 e da Directiva Europeia 2010/63 / UE). Esta legislação é aplicada localmente na Universidade de Aberdeen pelo Bem-Estar Animal e Ethical Review Board, que analisou e aprovou todos os procedimentos utilizados no seguinte protocolo.

Nota: Estes métodos foram usados ​​na pesquisa, publicada na Banks et al 7.

1. Orelhas preparando para Eletrofisiologia

  1. Antes de dissecção, preparar uma solução salina fisiológica padrão, tais como Liley (1956) e satura com 90% de O2 / 5% de CO 2. Solução salina de Liley (mM) é constituído por: NaHCO3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl2 (1), CaCl2 (2) e glucose(11).
  2. Humanamente sacrificá um rato adulto sem danificar o crânio perto das orelhas. Aqui usamos ratos C57 / Bl6J e MF1 mas qualquer cepa padrão rato de laboratório pode ser usado. O ideal é usar ratos que são <25 g se a gravação elétrica deve ser combinada com a rotulagem estiril tintura, como a rotulagem em camundongos maiores é menos confiável, muitas vezes sendo encontrado apenas em áreas circunscritas restritas.
  3. Retire a cabeça com grandes tesouras ou tesouras ósseas.
  4. Coloque o lado da cabeça dorsal em gaseados Liley de em uma ampla de fundo prato dissecção (50 cm, é normalmente conveniente) no palco de um microscópio de dissecção estéreo. Regularmente (~ 10 min) eclusa ou submergir a cabeça com solução salina gaseados.
  5. Cuidadosamente inciso e separar a pele na base da orelha externa (pavilhão auricular) com uma tesoura Springbow e # 3 fórceps, expor a cartilagem do conduto auditivo externo (CAE). Identificar os ramos do trigêmeo (divisão mandibular, MDV) e grandes nervos auriculares à medida que surgem from do crânio na fenda do mandibular projeto conjunto e através da base de cartilagem na inervação do aspectos da pele do pavilhão auricular côncava (anterior) e convexa (posterior), respectivamente.
  6. Perto do crânio, identificar onde os dois nervos ramos saída no sulco entre a mandíbula eo processo mastóide. Maximizar o seu comprimento, puxando levemente o pavilhão auricular para longe do crânio e cortar os nervos tão próximas ao crânio possível.
  7. Remover o pavilhão auricular a partir da cabeça com uma tesoura Springbow, tendo o cuidado de evitar os coto distal dos nervos divididas e minimizando a quantidade de pelagem densa na base da orelha que é removido.
  8. Transferir o pavilhão auricular para uma borracha de silicone flexível (PDMS) prato -lined preenchido com líquido gaseificado de Liley. Abra o EAM, dividindo-o em seu ponto mais estreito (ântero-mais). Achatar a orelha, pele anterior (côncava) do lado para baixo e pino para o PDMS cuidadosamente as bordas com ~ 6-8 regularmente espaçados muito finas (~ 0,2 mm de diâmetro) de insetos dos pinos.
  9. Remove a pele do aspecto posterior do pavilhão auricular completamente e remover parcialmente a cartilagem do pavilhão por dissecção romba com fórceps # 3, assegurando a pele anterior é deixada intacta.
  10. Com a ponta de um alfinete inseto bem apreendido com # 3 fórceps, suavemente estender os ramos (geralmente 2) do MDV que surgem posteriormente entre a pele e cartilagens EAM. Pin-las para o PDMS com as melhores possíveis pinos de insetos, espetando o tecido conjuntivo adjacente suas extremidades cortadas e não os troncos nervosos próprios.
  11. Remover a maior parte do tecido conjuntivo circundante em torno deles, evitando-se cuidadosamente o excesso de danos de puxar ou de corte.

2. eletrofisiológica Gravação Configurar

  1. Pin a pele do pavilhão auricular para a base de uma câmara de registo com finas pinos de insectos em torno das bordas PDMS-alinhado (~ 6-8 por orelha), colocando os nervos limpas na base da orelha perto de dois eléctrodos de sucção - uma para a gravação (a tomar o nervo) e do otela um eléctrodo indiferente (para fornecer o sinal de neutro a um amplificador diferencial, ver 7).
  2. Para o eléctrodo de registo, corresponder cuidadosamente a abertura e o diâmetro interno da abertura para a espessura combinada dos dois nervos, de modo que eles se encaixam firmemente quanto possível e com tão grande quanto possível de um comprimento.
  3. Desenhar os nervos para o eléctrodo por sucção suave a partir de uma seringa de 2 ml ligado à outra extremidade, com um tubo de borracha de silicone. Certifique-se os nervos são retas, não dobrado ou dobrou.
  4. Desenvolver uma alta resistência eléctrica ajuste / impedância usando sucção mais forte para desenhar um tecido conjuntivo ou do tecido adiposo para formar um tampão que veda hermeticamente a abertura em torno do nervo.
  5. Encha o outro eletrodo (indiferente) com solução salina por sucção, se necessário (que pode encher por acção capilar).
  6. Coloque fios de gravação idênticas (prata ou platina) para dentro do furo interno dos eléctrodos de registo para entrar em contato com a solução salina e o nervo(Gravação) ou estreitada, final polido-fogo (indiferente) do eletrodo. Cada eletrodo é soldado individualmente para diferentes núcleos de dois-núcleo do cabo blindado. Coloque o eletrodo banho (terra) (Ag / AgCl pellet) para o banho, e, triturando-o para a tela do cabo de dois núcleos conectados aos eletrodos de registro.
  7. Alimente a atividade elétrica dos dois eletrodos nos canais separados de um amplificador diferencial, filtro (passou-band 0,2-2 kHz), e vista em uma tela do osciloscópio. Verifique se o canal A (gravação) e do canal B (indiferente) níveis de ruído elétrico semelhante. Nesta fase, pode não ser possível ver os potenciais de acção espontânea normais num canal antes de os dois eléctrodos são equilibradas.
  8. Corrigir quaisquer diferenças de ruído de fundo entre os eléctrodos através do aumento da impedância da gravação (canal A) ou eléctrodos indiferentes (canal B). Faça isso por sucção areolar tecido conjuntivo (adiposo) ainda mais em ambos os eletrodos, e /ou a aplicação de uma maior força de sucção sobre a seringa de 50 ml.
    1. Uma vez que "equilibrada", desta forma, voltar ao diferencial de gravação (AB) e procurar potenciais espontâneos de ação (APs) no rastreamento ou quando acariciando os cabelos na margem do pavilhão auricular. Se nenhuma atividade (spiking) é visto, re-verificar o ajuste apertado do nervo no eletrodo de gravação e do tecido conjuntivo areolar no eletrodo indiferente - normalmente o mais apertado (maior resistência) o selo e mais igual a impedância nos dois eléctrodos, o melhor. Com a prática, isto irá conseguir uma boa qualidade (> 2: 1) de sinal: ruído.
  9. Grave a electroneurogram através de um software de interface laboratório e eletrofisiologia executado em um computador. Uma saída de áudio de cravação é muito útil e pode ser conseguida alimentando a neurograma através de um amplificador de áudio e alto-falante de áudio associado. Ajustar o limiar ser um pouco acima do ruído de linha de base (identificado pela ausência de branco-Noise 'silvo').
  10. Para aumentar a droga ou o acesso estiril corante fluorescente para as terminações lanceoladas, cuidadosamente descascar a camada adiposa sub-dérmica perto da margem do pavilhão auricular, abrindo uma janela de ~ 5 x 5 mm expor a derme e base dos folículos (Figura 1A, B ).
  11. Pin para trás uma dobra de ~ de 1 mm da pele da orelha limpou-adiposo na margem principal (ao nível da janela apenas produzida, se for o caso), deixando um espaço cheio de solução salina clara entre as camadas da pele apostos. Suavemente derrame os pêlos salientes ao longo da borda dobrada com um pino ou uma pinça fina aterrados, sem tocar a pele, para localizar a área de saída AP máxima no osciloscópio eo distintivo 'cliques' e 'pops' na saída de áudio.

3. Potenciais de Ação de Gravação Estímulo-evocados

  1. Posicionar a sonda de estimulação mecânica - a 10 centímetros de vidro de borosilicato de microeletrodos fogo-polido ligado a um Ceramic piezo-elétrico atuador - por isso o movimento é paralelo com a dobra da pele. Coloque a ponta cerca de 0,5-1 mm de pele dobra, por isso toca os cabelos, mas não a pele. Verifique estimulação efetiva, movendo lentamente a ponta da sonda manualmente para desviar os cabelos e observar / ouvir a cravação.
  2. Use o software para conduzir estimulação mecânica de 1-3 pêlos (por exemplo, 3 segundos a 5 sinusóides Hz, a cada 10 segundos. Sonda deslocamento 200-500 mm), e registrar as respostas evocadas por estimulação nos nervos.
  3. Dê vários trens estimulação mecânica idênticas em intervalos de 10 segundos. Otimizar a posição da sonda para a repetibilidade, em seguida, reduzir a frequência de estimulação de acordo com o protocolo experimental (por exemplo, taxa de repetição de queda de 10 seg a 30 seg).
  4. Usar o software para discriminar AP-actividade semelhante a, por exemplo usando um limiar simples ajustado para ~ 2x a amplitude do ruído de alta frequência e ~ 25% dos maiores APs.
  5. Conte os APs que cruzam o limiar'eventos', quantificando a frequência e as características dos APs produzidos.

4. acendimento captação dos estímulos evocadas combinado com N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) piridínio Dibrometo Etiquetagem

  1. Para examinar os efeitos de corantes de estirilo sobre queima aferentes evocadas por estímulo e rotulagem terminal, adicione a concentração adequada de um corante de estirilo de escolha, à solução de banho e continuar com a gravação elétrica.
  2. Após o tempo de exposição necessário (geralmente, pelo menos, 30 min), preparar a preparação para visualização dos folículos. Abra a aba de pele, removendo os pinos de retenção, e expor a área dérmica liberado para revelar a rotulagem terminal.
  3. Lavar corante externo com solução salina livre de corante, fazendo 3 mudanças completas de solução salina.
  4. Incubar na mudança final de solução salina livre de corante gaseados por 10-15 min para permitir a contaminação do corante mais persistente a lixiviação a partir de membranas expostas / externos.
  5. Remover o corante não-internalizado restante em membranas com um agente sequestrante (sulfobutylated beta-ciclodextrina, 1 mM, 5 min) numa solução salina.
  6. Transferir a câmara de gravação para o palco de um microscópio de epifluorescência vertical e envolver a câmara com o mecanismo de movimento estágio / slide.
  7. Iluminar a preparação com luz de excitação apropriado para o corante de estirilo. Usar uma objectiva 10X de microscópio de fluorescência ou 25X para observar a rotulagem folículo (Figura 1).

Representative Results

O arranjo de gravação electrofisiológico, com o tecido adiposo sub-cutâneo removida para expor os folículos pilosos, é mostrado na Figura 1A. Uma porção desta área exposta é mostrada com uma ampliação maior na iluminação de campo claro na Figura 1B. Dobrando a margem pinna cima e para trás sobre si mesmo nesta área expõe a superfície da epiderme. Isto posiciona os cabelos na borda da dobra para se projectar horizontalmente, numa situação ideal para a estimulação mecânica com uma sonda romba (não representada). A Figura 1C mostra que após exposição corante e retornando a margem para a posição desdobrada, novamente, os folículos estimulada nesta posição foram marcadas com um corante de estirilo piridínio. Electroneurograms de preparações mostram tipicamente actividade de AP em curso, mesmo na ausência de movimento imposto da sonda de fibra de vidro, incluindo os APs de maior tamanho (Figura 2A (Figura 2BI-III)). Isto é bastante reproduzíveis, apesar da fase da forma de onda em que as respostas são bloqueados depende da sua posição, isto é em que ponto o movimento de vibração da sonda entra em contacto com o cabelo. A detecção do limiar simples (linha horizontal cruzando os traços neurograma em A (i-iii)) tem sido utilizado para esta análise. No entanto, a funcionalidade do software de gravação pode muitas vezes ser utilizado de uma maneira mais sofisticadadiscriminar características de tamanho pico e forma. Este pode, então, isolar as respostas de determinadas fibras aferentes por essas características para permitir a análise de gravação pseudo-single-unidade a ser empreendido.

figura 1
Figura 1:. Arranjo gravação eletrofisiológico e N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) estiril) Pyridinium Dibrometo Rotulagem de folículo piloso terminações aferentes Lanceolate (A) Um pavilhão auricular preparação configurado para um experimento eletrofisiológico, mostrando o pavilhão auricular orientação, a localização dos nervos, os eléctrodos de registo e a área exposta da inervação folículo depois da remoção do tecido adiposo. (B) vários folículos pilosos são visíveis na iluminação de campo brilhante na área limpa de tecidos adiposos sobrepostas até a derme. O escuro, geralmente bilobado, formas são glândulas sebáceas. ( 7, com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: (A) Atividade evocadas por estímulo gravado a partir do mouse Pinna. (Ai-iii) Exemplos, tomadas a partir de 3 experimentos diferentes, da atividade de neurograms contínuas de pinnae em solução salina padrão de Liley. Cada ficha 5 mostra uma secção segundo a cerca de 5 minutos após o início da gravação, incluindo um período de 3 segundos de deslocamento sinusoidal de quantonúmero de shopping de fios de cabelo. A estimulação mecânica foi repetida cada 30 segundos durante toda a gravação contínua, que geralmente dura por 1-2 horas. arquivos de script personalizados marcados eventos individuais que cruzaram um limiar definido pelo cursor horizontal (pontos), bem como o início de cada ciclo sinusoidal (período). (Aiv) O sinal de comando para o deslocamento senoidal. (B) Análise de Estímulo-evocado Bater Atividade. (Bi-III) histogramas de ciclo em 3 ° lixeiras construída a partir das amostras neurograma (Ai-III), respectivamente, que mostra as respostas das terminações lanceoladas presumíveis à estimulação mecânica por 5 Hz deslocamento sinusoidal de fios de cabelo por uma sonda de vidro. Note-se a fase de bloqueio marcado, em diferentes fases do ciclo, dependendo da sua posição em relação à posição de partida da sonda mecânica. (Biv) sonda Normalizada deslocamento senoidal; a amplitude real foi de aproximadamente 1001;. M Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui, nós desenvolvemos uma preparação relativamente simples que pode ser rapidamente dissecados, tem uma baixa densidade do folículo de cabelo e permite a estimulação mecânica relativamente selectiva de um pequeno número de folículos do cabelo. É facilmente acessível para a gravação eletrofisiológico e de imagem fluorescente de células vivas, incluindo as respostas para tingir aplicativo para visualizar os folículos pilosos estimulada mecanicamente, ou seja, os folículos de imagem com respostas eletrofisiológicas definidos. Embora não tenhamos feito isso, este sistema também parece prontamente passível de sub-divisão do nervo sensorial para a unidade única (single axônio sensorial) gravação e usando GFP-expressão direcionados para visualizar a morfologia do terminal terminando sensorial.

Temos usado a preparação da pele da orelha para investigar as características da internalização e libertação dos corantes pridinium estirilo membrana fluorescente 7, uma técnica originalmente desenvolvida para estudar vesic localizadareciclagem membrana le nos terminais sinápticos 8. Em sinapses, imaging também é facilmente combinado com a gravação eletrofisiológico simultânea de respostas em terminais identificados 8,9. Foi nesses estudos iniciais que, primeiro, anotou os corantes também foram internalizados pelas terminações mecanosensorial 10. Para neurônios sensoriais na cultura e nas células ciliadas da cóclea, grande parte da rotulagem por corantes de estirilo pirid�nio parece envolver corantes que passam através dos canais mecanosensorial, que eles bloqueiam 11,12. Os corantes, em seguida, rotular membranas intracelulares, e essa rotulagem é irreversível. No entanto, nas células ciliadas que não são mecanicamente estimulados 13,14 e nos terminais completamente diferenciadas primárias sensoriais nervosas in situ, tais como terminações Ia em fusos musculares 15, e nas terminações lanceoladas aqui 7, rotulagem estiril corante parece refletir a endocitose de membrana, uma vez que a rotulagem é reversível e não bloquear os res mecanosensorialponses 7,15,16. Enquanto alguns internalização corante por permeação canal nessas terminações não pode ser completamente descartado, é evidente a partir da queima continuou durante a incubação corante e a reversibilidade da rotulagem que a grande maioria da rotulagem em terminais diferenciadas in situ é de internalização com vesícula reciclagem membrana. Assim, esta técnica simples é facilmente utilizado para a monitorização eléctrica e óptica combinada de uma variedade de funções do terminal mecanosensorial em tecidos ex vivo.

Tal como acontece com a maioria das técnicas práticas, reprodutibilidade vai exigir a repetição e prática. serão agora descritos alguns dos pontos-chave especial atenção vale a pena. Durante toda a sessão de gravação e dissecção, maximizar a viabilidade do tecido e da sobrevivência, assegurando a preparação é constantemente perfundidos com solução salina totalmente saturado com 95% O2 / 5% de CO 2. Assegurar o cabelo folículos não são deslocados durante este processo, which irá estimular a queima final sensorial. Ou utilizar, num sistema contínuo de fluxo laminar de perfusão, ou cuidadosamente bolha de gás através de um banho de órgãos com tubos finos, a uma distância a partir da preparação, ou actualizar cuidadosamente soluções cada 20-30 min, mantendo a preparação abaixo da superfície da solução salina em todos os momentos. eletrodos de registro de sucção são feitos modificando pipetas de borosilicato eletrodo afiadas normalmente utilizados para a gravação intracelular. Em primeiro lugar, cuidadosamente quebrar as pontas afiadas com # 3 fórceps para dar o diâmetro interno adequado para o ajustar os nervos e fogo-polonês por muito breve (<1 seg) a exposição a chama do queimador de Bunsen (ver 2.4 e 2.5). Para obter uma boa relação sinal-para-ruído durante a gravação, é essencial que a impedância eléctrica (resistência) nestes dois eléctrodos é maximizada e ambos igual. Para fazer isso, prestando atenção para o seguinte nos dois eletrodos. Para o eléctrodo de registo, assegurar o diâmetro interno é um ajuste confortável para o nervo, e o comprimento máximo de NErve é atraído para o eléctrodo de registo. Tente usar o tecido conjuntivo ao redor do nervo para selar eficazmente a ponta do eletrodo. Em alternativa, ou além disso, tirar a parte mais estreita de um pedaço de tamanho adequado, afunilada de tecido adiposo em ao lado do nervo. Em seguida, ligar a extremidade do eléctrodo por aplicação de sucção forte para ~ 1 min com uma seringa de 50 ml ligado à tubagem. Para uma dica bem fechados, aplicação de sucção forte simplesmente reforçar a eficácia da ficha e não vai chamar em mais líquido ou do nervo. Para evitar danos nos nervos, no entanto, garantir que o tecido conjuntivo é amortecer o nervo de compressão sobre o material circundante e da cartilagem EAM. O eletrodo indiferente deve imitar a resistência / impedância do eletrodo de registro, tanto quanto possível. Este é ajudado por cuidadosamente fogo-de polimento a ponta para tão pequeno uma abertura possível sem realmente selando-o. Se ainda mais a resistência é necessário, em seguida, ligue a extremidade do eléctrodo indiferente com AdipoSE tecido conjuntivo, tal como descrito acima para o eléctrodo de registo.

O eletrocerâmicos dá o controle requintado ao longo deslocamento mecânico, tanto espacialmente e temporalmente. No entanto, tome cuidado para fazer as conexões elétricas - altas temperaturas destruí-los, portanto, não use solda quente. Use cola epóxi carregada com metal, ou utilizar uma tomada de encaixe especialista recomendado pelo fornecedor. Isso quer segurá-lo com firmeza e estabelecer a conectividade elétrica. Fixe a sonda estimulante de vidro para o eletrocerâmicos com resina epóxi padrão. Fire-polonês o fim de um padrão cm x 10 tubos capilares de vidro de borosilicato 1,5 milímetros de diâmetro utilizadas para fazer patch ou eléctrodos afiadas para o registo electrofisiológico para minimizar o risco de danos nos tecidos. Se a estimulação folículo piloso única é necessária, fogo-polonês a ponta para caber um único fio de cabelo, e posicionar a sonda com um único fio de cabelo dentro da grande abertura. Isto dá o controle requintado ao longo de um único fio de cabelo. Para dy estirile rotulagem, ele é geralmente mais uniforme em tecidos de animais mais jovens. Não está totalmente claro por que, mas isso provavelmente reflete menos trauma mecânico e remoção mais eficaz do tecido profundo dos tecidos mais jovens. Ser completo na remoção da camada de espuma de poliestireno expandido lembrando que recobre as bases do folículo piloso. No entanto, evitar ser demasiado vigorosa, já que esta corre o risco de remover a camada plexo nervoso e terminais lanceoladas associados. Se houver pouca ou nenhuma resposta eléctrica ao movimento do folículo capilar, e a aplicação estiril corante leva a rotulagem predominante das glândulas sebáceas (amarelo / branco), com autofluorescência distinta da base da haste do cabelo, em vez de terminações lanceoladas (amarelo alaranjado /), apuramento excesso de entusiasmo tem prejudicado os tecidos subjacentes. Finalmente, usando um agente corante quelante antes de imagem melhora consideravelmente o contraste da imagem e qualidade das imagens finais.

Esta técnica pode ser útil numa variedade de estudos suplementares. estes could incluem, por exemplo, o rastreio para o canal (s) mecanosensorial responsável por respostas evocadas por estiramento, por incubação da preparação com ligandos farmacológicos selectivos para os canais de candidatos ou de rastreio de linhas de ratinhos com tais canais geneticamente suprimido. Este último poderia ser combinada com a avaliação de fluorescência de quaisquer alterações na morfologia do terminal devido à manipulação genética em linhas de rato, por exemplo, com expressão GFP Npy2r-linked 17. Um último exemplo pode ser investigar o papel das vesículas sinápticas-like (SLVs) 7 nesses terminais lanceoladas, examinando o efeito de moduladores de volume de negócios SLV (Ca, Mg, latrotoxin, ligantes de receptores de glutamato) sobre as respostas evocadas por estiramento e captação estiril corante /lançamento. Assim, esta nova técnica abre um leque de possibilidades potencialmente interessantes de pesquisa em neurociência mechansensory.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS - Sylgard 184 Dow Corning Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps Fine Science Tools 11231-20
Austerlitz Insect pins Fine Science Tools 26002-10 Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier Digitimer Neurolog NL104A Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. 
High/Low-pass Filter Digitimer Neurolog NL125 Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger Digitimer Neurolog NL201 Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. 
Audio Amplifier & speakers Digitimer Neurolog NL120S Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope 
Oscilloscope Digitimer PM3380A We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer Morgan Electroceramics, Southampton UK PZT507 Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply Home made 0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software Cambridge Electronic Design (CED) Spike2 v7 Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface Cambridge Electronic Design (CED) 1401 micro Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4 Biotium/Cambridge Bioscience BT70020 Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7 Biotium/Cambridge Bioscience BT70029 A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394 Qimaging Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software Perkin Elmer Volocity 6.3 Image capture and analysis software.

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References

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Gravação combinado de saída Mecanicamente Stimulated aferentes e Nerve Terminal Rotulagem no mouse do folículo piloso Lanceolate Endings
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Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).More

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).

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