Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

הקלטה משולב של תוויות מסוף פלט ועצב מבחינה מכנית מאולצת מביא ב Endings עכבר זקיק השיער אזמלי

doi: 10.3791/53854 Published: May 7, 2016

Abstract

טכניקה לנתיחת הקלטת רומן מתוארת על ירי מביא ניטור עורר על ידי עקירה מכאנית של שערות פינת העכבר. הטכניקה היא מאוד חסכוני התחייב בקלות עם חומרים נפוצים במעבדות אלקטרופיזיולוגיה ביותר, או לרכוש בקלות. דיסקציה היא פשוטה ומהירה, עם התזוזה המכאנית מסופקת על ידי רקיק electroceramic הגנרית נשלט על ידי תוכנת קניינית. אותה תוכנה גם רשומה ומנתח את תפוקת electroneurogram. ההקלטה של ​​הפעילות העצבית העוררת היא דרך מגבר הפרש מסחרי הקשורים microelectrodes זכוכית הרגיל אש מלוטשת. עצות מועילות ניתנות לשיפור האיכות של התכשיר, הגירוי ואת תנאי ההקלטה כדי לייעל את איכות הקלטה. המערכת מתאימה עבור מנסה לאמוד את תכונות אלקטרו אופטיות של מסופי אזמלים של סופים משוכים של זקיקי שיער, כמו גם אתתוצאות מהמניפולציה התרופתית ו / או גנטית שלהם. דוגמא של שילוב הקלטת חשמל עם גירוי מכאני וסימון עם צבע styryl פירידיניום חיוני היא נתונה.

Introduction

המסופים אזמלי של אקסונים חושי innervating זקיקי שיער אצל יונקי יוצרי Palisades ברחבי האפיתל שיער-הפיר. מטרתם היא לזהות תזוזה מכאנית של השערות הם מקיפים. הם תערובת של במהירות ולאט לאט התאמת הסופים כי בעיקר לייצר צרורות קצרות של פעילות בתגובת תנועת שיער. פעילות מפסיק מהר מאוד כאשר התנועה נעצרת, אפילו בנוכחות של עקירה המשיך. כאן אנו מתארים את הפיתוח של מודל פינת murine זה ללימודי גומל של מבנה והתפקוד במסופי אזמלים. יש פינת תכונות רבות יתרון ללימוד הסופים אלה. ראשית, הפינה היא בעצם שתי שכבות של עור apposed גב אל גב, עם רקמות קטנות אחרות בין להפריע גישה זקיקי והמסוף. העור הוא דק מאוד גזור בקלות בשל כמויות מינימליות של רקמת חיבור קשה. העצבוב הוא נגיש וקל לזיהוי. בעוד שיער follicles נוכח, הם מופצים יחסית בדלילות, הקלת הגירוי של קבוצות בודדות או קטנות של זקיקים מכאניים. שכבת הדרמיס הדקה הבסיסית נותנת נגישות טובה אל מסוף העצב עם תרופות פרמקולוגיות וצבעים. זה גורם להם במיוחד אידיאלי עבור בדיקות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההדמיה יכולה להיות במסופי חיים, או לאחר קיבוע ועיבוד היסטולוגית נוסף.

התגובות של תאי עצב mechanosensory innervating זקיקי שיער באופן מסורתי נחקרו מכרסם vibrissae 1,2 ו, ובמידה פחותה, בהכנות עור מבודדות 3,4. אלה למדו אותנו הרבה על העקרונות הכלליים של פיזיולוגית mechanosensory במסופים העצבים סביב השערה. הכנת vibrissal מאפשרת שליטה מעולה על התנועה של זקיק שערה אחת. עם זאת, זה יכול להיות קשה לפענח את התפוקה בשל מורכבותו, כמו vibrissalזקיקים להכיל לפחות 8 סוגים שונים של סיום mechanosensory מובחן מבחינת אנטומית 5 ואת ההתאמה של סוגים מורפולוגיים אלה מענה ספציפי אלקטרו היא עדיין עניין של מחלוקת. עכבר העור / הכנת עצב saphenous משמשת לרוב במצב המקולף שלה לחקור תגובות מגע וכאב. העצבוב של זקיקי שיער תכשיר כזה מורכב פחות אבל הצפיפות של זקיקי השיער, בתוספת בנוכחות שלושה סוגי זקיק שונים (שומר, מרצע / auchene ושערות זגזגו) בסמיכות כזו 6, פירושו ללמוד את התגובה החיסונית הספציפית של זקיק בודד או סוג אחד של הסוף שוב מאתגר. יתר על כן, הכנה זו כרוכה לנתיחה מורכבת. לבסוף, בשני vibrissal והכנות עור אחרים, קשה לדמיין את הקצוות מעורבים בעוד הכנות vivo לשעבר עדיין בחיים. לפיכך, חתך רקמות נדרש גם קווי עכבר להביע GFP. משתנvely, זה דורש עיבוד היסטולוגית עוד / אימונולוגיות כגון קיבוע ו / או דגירת נוגדן עבור immunofluorescence.

לפיכך, אנו פתחנו הכנת הפינה והשתמשנו בו כדי לבצע הקלטות חשמל מאוכלוסייה מוגבלת של afferents זקיק שיער ולהראות כי רכיבה על אופני קרום מתרחשות הסופים אזמלי אלה, שמעידים ספיגים של צבעי styryl פירידיניום. לבסוף, הראינו כי הצבע לא להפריע רגישות מכאנית, סימן שהוא לא יחסום את ערוצי mechanotransduction. התוצאות של פרוטוקולי גירוי וניתוח פשוטים מומחשות.

Protocol

עכבר פוסט מורטם קציר רקמות חייב להשתמש אשר בשיטות אתיות. בבריטניה, נקע בצוואר הרחם היא שיטה אישרה הממשלה עכברים בוגרים (שיטה 1 המפורטים בתוספת של בעלי חיים בבריטניה (הליכים מדעיים) Act, 1986 הדירקטיבה אירופה 2010/63 / EU). חקיקה זו נאכפת באופן מקומי באונ' אברדין ידי צער בעלי חי המועצה לביקורת אתית אשר נבדקה ואושר כל הנהלים בשימוש בפרוטוקול הבא.

הערה: שיטות אלה שימשו במחקר דיווחו הבנקים ואח '7.

1. אוזני הכנות לקראת Electrophysiology

  1. לפני לנתיחה, להכין תמיסת מלח פיזיולוגית סטנדרטית, כגון Liley של (1956) ו להרוות את זה עם 90% O 2/5% CO 2. המלוח של Liley (מ"מ) מורכב: NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138.8), 2 MgCl (1), CaCl 2 (2) וגלוקוז(11).
  2. ברוב אנושי להרדים עכבר מבוגר מבלי לפגוע הגולגולת ליד האוזניים. כאן אנו משתמשים C57 / Bl6J ו MF1 עכברים אבל כל זן עכבר מעבדה רגיל יכול לשמש. באופן אידיאלי, להשתמש בעכברים כי הם <25 גר 'אם הקלטת חשמל היא להיות משולבת עם תיוג לצבוע styryl, כמו תיוג בעכברים גדולים הוא פחות אמין, לעתים קרובות שנמצא רק באזורים מוגבלים מוגבלים.
  3. הסר את הראש במספריים גדולים או מספרי עצם.
  4. הנח את הצד מגבה ראש למעלה ב בגז Liley של בצלחת לנתיחה רחבה בעל תחתית (50 סנטימטרים הם בדרך כלל נוחים) על הבמה של מיקרוסקופ לנתיחה סטריאו. באופן קבוע (~ 10 דקות) סכר או להטביע את הראש עם מי מלח בגז.
  5. בזהירות לחתוך ולהפריד את העור בבסיס של האוזן החיצונית (אפרכסת האוזן) במספריים springbow ו # 3 מלקחיים, לחשוף את הסחוס של meatus השמיעה החיצונית (EAM). זהה את ענפי trigeminal (חלוקת mandibular, MDV) ועצבי אוזן גדולים כפי שהן עולות from הגולגולת בתוך הבקע של מפרק פרויקט mandibular דרך בסיס הסחוס מעצבב קעורה (קדמי) וקמור (posterior) היבטים של עור הפינה, בהתאמה.
  6. ליד הגולגולת, לזהות היכן שתי ביציאת סניפי עצב החריץ בין הלסת והתהליך פטמתי. מקסם אורכם ידי משיכת פינה מן הגולגולת וחתך את העצבים בעדינות קרוב הגולגולת ככל האפשר.
  7. הסר את אפרכסת האוזן מהראש במספרי springbow, מקפיד להימנע גדמי דיסטלי של העצבים המחולקים וצמצום הכמות של pelage הצפופה בבסיסו של האוזן כי מוסר.
  8. מעביר את אפרכסת האוזן כדי גומי סיליקון גמיש (PDMS) צלחת -lined המלאה בנוזל של Liley בגז. פתח את EAM ידי וחלוקתו ב הצרה שלה נקודה (הקדמית ביותר). שטח את אפרכסת האוזן, עור קדמי (קעור) צד כלפי מטה והוצא פינים אל PDMS בזהירות בקצוות עם ~ 6-8 פזורות יפות מאוד (~ 0.2 מ"מ קוטר) סיכות חרקים.
  9. ראםove העור של ההיבט האחורי של אפרכסת האוזן לחלוטין ובאופן חלקי להסיר את הסחוס פינה ידי דיסקציה קהה עם # 3 מלקחיים, כדי להבטיח את העור הקדמי נותר בשלמותו.
  10. עם נקודת סיכת חרקי קנס לתפוס אותו # 3 מלקחיים, בעדינות להאריך את הענפים (בדרך כלל 2) של MDV העולים בדיעבד בין העור לבין סחוסי EAM. צמד אלה אל PDMS עם סיכות החרקים המשובחות ביותר, impaling רקמת החיבור הסמוכה הקצוות לחתוך שלהם ולא גזע העצב עצמם.
  11. הסר ביותר של רקמת חיבור המקיפה סביבם, הימנעות מפגיעה בקפידה מתוך עודף מושך או חיתוך.

2. הקלטת אלקטרו הגדרה

  1. הצמד את העור פינה לבסיס מצופה PDMS של חדר הקלטה עם סיכות חרקים בסדר בקצוות (~ 6-8 לכל אוזן), הצבת העצבים ניקו בבסיס של האוזן ליד שתי אלקטרודות יניקה - אחד עבור הקלטה (עד לקחת את העצבים) ואת otלה אלקטרודה אדישה (כדי לספק את האות הניטראלית מגבר דיפרנציאלי ראה 7).
  2. עבור האלקטרודה הקלטה, בזהירות להתאים את הצמצם ואת קוטר פנימי של הפתח כדי עובי בשילוב של שני העצבים, כך הם מתאימים כמו בנוחות ככל האפשר ועבור כמו גדול באורך ככל האפשר.
  3. צייר את העצבים לתוך האלקטרודה על ידי שאיבה עדינה של מזרק 2 מ"ל המחובר לקצה השני עם צינור גומי סיליקון. ודא העצבים ישרים ולא מקופלים או התקפל.
  4. פיתוח התאמת התנגדות / עכבה חשמלית גבוהה באמצעות יניקה חזקה לצייר רקמת חיבור או רקמה שומנית כדי ליצור תקע בחוזקה חותם את הצמצם סביב העצב.
  5. מלא את האלקטרודה (אדישה) האחרת עם מי מלח על ידי יניקה במידת צורך (רשאי הוא למלא על ידי פעולת נימים).
  6. מניח חוטי הקלטה זהים (כסף או פלטינה) לתוך הקדח הפנימי של אלקטרודות ההקלטה לפנות מליחים עצבים(הקלטה) או הצטמצם, סוף-אש מלוטשת (אדישה) של האלקטרודה. אלקטרודה כל מולחמים בנפרד ליבות שונות של כבל הוקרן שתי ליבות. מניח את האמבטיה (קרקע) אלקטרודה (גלולת Ag / AgCl) לאמבטיה, ומעך אותה למסך של כבל שתי ליבה חובר אלקטרודות ההקלטה.
  7. להאכיל את הפעילות החשמלית משתי אלקטרודות לתוך הערוצים הנפרדים של מגבר הפרש, מסנן (0.2-2-עבר להקת kHz), ולהציג על מסך אוסצילוסקופ. בדוק כי הערוץ A (הקלטה) והערוץ B (אדישות) רמות רעש חשמליות נראים דומה. בשלב זה ייתכן שלא ניתן יהיה לראות את פוטנציאל פעולה הספונטני הנורמלי ערוץ לפני שני אלקטרודות מאוזנים.
  8. לתקן את כל הבדלים רעשי רקע בין האלקטרודות על ידי הגדלת העכבה של אלקטרודות ההקלטה (ערוץ א) או אדישות (ערוץ B). עושים זאת על ידי מציצת areolar (השומן) רקמת חיבור עמוק יותר אל תוך או אלקטרודה, ו /או הפעלת כוח יניקה גדולה יותר על מזרק 50 מ"ל.
    1. לאחר 'מאוזן' בדרך זו, לחזור דיפרנציאלי (AB) הקלטה ולחפש פוטנציאל פעולה ספונטנית (APS) ב עקבות או כאשר מלטף שערות בשוליים של אפרכסת האוזן. אם אין פעילות (spiking) נתפסת, מחדש לבדוק את ההתאמה ההדוקה של עצב האלקטרודה הקלטת רקמת חיבור areolar ב האלקטרודה האדיש - בדרך כלל החזקה יותר (העמידות גבוהה יותר) את החותם ואת העכבה יותר שווה בשני אלקטרודות, כן ייטב. בעזרת תרגול, זה יהיה להשיג באיכות טובה (> 2: 1) אות: יחס רעש.
  9. רשום את electroneurogram באמצעות תוכנת ממשק אלקטרופיזיולוגיה מעבדה שרצה על מחשב. פלט שמע של spiking הוא מאוד שימושי ויכול להיות מושגת על ידי האכלת neurogram דרך מגבר אודיו מרמקול כלול. התאם את הסף להיות בדיוק מעל רעש הבסיס (המזוהה על ידי בהעדר-n הלבןoise 'מסנן').
  10. כדי להגדיל סמים או גישת styryl צבע פלואורסצנטי אל הסיומים אזמלי, בזהירות לקלף את שכבת השומן תת-עורי ליד שולה הפינה, פתיחת חלון של ~ 5 מ"מ x 5 מ"מ חשיפת הדרמיס ועל הבסיס של הזקיקים (איור 1 א ', ב' ).
  11. צמד חזרה קפל ~ 1 המ"מ של עור אוזן פינת שומן בשולים המובילים (ברמה של החלון רק פיק, אם זה אפשרי), השארת רווח מלוח המלא ברור בין שכבות עור apposed. בעדינות ללטף את השערות הבולטות לאורך הקצה המקופל בסיכה או מבוסס מלקחיים בסדר, בלי לגעת בעור, כדי לאתר את האזור של פלט מקסימאלי AP על אוסצילוסקופ ואת הייחודי לוחץ 'ו' אבא 'של פלט השמע.

3. ההקלטה Stimulus-פוטנציאלי פעולה

  1. מקם את חללית מכני גירוי - כוס microelectrode בורוסיליקט אש מלוטשת 10 סנטימטרים המחוברים צ'ראמיpiezo חשמלי הינע ג - כך התנועה מקבילה עם קפל העור. הנח את הקצה על 0.5-1 מ"מ מעור לקפל, כך הוא בא במגע עם השערות אבל לא את העור. ודא גירוי יעיל על ידי הזזת הקצה החללי לאט באופן ידני כדי להסיט את השערות ולבחון / להאזין spiking.
  2. השתמש בתוכנת לנהוג גירוי מכני של 1-3 שערות (למשל 3 שניות ב sinusoids 5 הרץ, כל 10 שניות. נסו לעורר עקירה 200-500 מיקרומטר), ולהקליט את עוררו התגובות גירוי בעצבים.
  3. תן כמה רכבות גירוי מכאניות זהות ב 10 מרווחי שניות. מטב את עמדת בדיקה עבור הדירות, אז את תדירות השימוש גירוי פי פרוטוקול הניסוי (קצב החזרה ירידה למשל מ -10 שניות ל -30 שניות).
  4. השתמש בתוכנה כדי להפלות למשל פעילות AP הדמוית באמצעות סף פשוט מוגדר ~ 2x משרעת רעש בתדר הגבוה ו ~ 25% של נקודות הגישה הגדולות.
  5. ספירת נקודות גישה חציית הסף כפי'אירועים', לכימות התדירות והמאפיינים של נקודות הגישה מיוצרת.

4. הקלטה Stimulus עורר ירי בשילוב עם N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) תיוג פירידיניום Dibromide

  1. כדי לבחון את ההשפעות של צבעי styryl על ירי מביא עורר גירוי וסימון הטרמינל, להוסיף את הריכוז המתאים של צבע styryl ברירה, הפתרון רחצה ולהמשיך עם הקלטת החשמל.
  2. לאחר זמן חשיפה הנדרשת (בדרך כלל לפחות 30 דקות), להכין את ההכנה לצפיית הזקיקים. לפתוח את דש העור על ידי הסרת הסיכות תמכו, ולחשוף את שטח עורי פינה כדי לחשוף את התיוג סופנית.
  3. לשטוף לצבוע חיצוני עם מי מלח צבען בחינם, מה שהופך 3 שינויים מלאים של תמיסת מלח.
  4. מדגיר את השינוי הסופי של מלוחים צבען חינם בגז במשך 10-15 דקות, כדי לאפשר את הזיהום לצבוע העיקש ביותר ליץ מן הקרומים חשופים / חיצוניים.
  5. הסר לצבוע הלא הפנימו הנותרים על ממברנות עם סוכן sequestering (cyclodextrin בטא sulfobutylated, 1 מ"מ, 5 דק ') סליין.
  6. מעביר את תא הקלטת על הבמה של מיקרוסקופ epifluorescence זקוף להעסיק את התא עם מנגנון התנועה הבמה / שקופיות.
  7. להאיר את ההכנה עם מתאים אור העירור עבור לצבוע styryl. השתמש מטרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 10X או 25x לשמור על תיוג הזקיק (איור 1).

Representative Results

הסדר הקלטת אלקטרו, עם רקמת השומן תת-עורית סיר כדי לחשוף את זקיקי שיער, מוצג באיור 1 א. חלק באזור החשוף הזה מוצג בהגדלה גבוהה תאורת brightfield באיור 1B. קיפול שולי פינה למעלה ואחורה על עצמו בתחום זה חושף את פני השטח אפידרמיס. זו מציבה את השערות על קצה הקיפול כדי לבלוט אופקי, מצב אידיאלי עבור גירוי מכאני עם בדיקה בוטה (לא מוצג). תרשים 1C מראה כי לאחר חשיפה לצבוע והחזרה השולית לתפקיד הפרש שוב, מגורה זקיקים בעמדה זו סומנו בתווית עם צבע פירידיניום styryl. Electroneurograms מן ההכנות בדרך כלל להראות פעילות AP מתמשך גם בהיעדר של התנועה המוטלות של החללית מזכוכית, כולל ממ"ד של הגודל הגדול ביותר (איור 2 א (איור 2Bi-iii)). זה די דיר, למרות השלב של צורת הגל שבו התגובות נעולות תלוי עמדותיהם, כלומר ובנקודה בתנועה מגעים זה בדיקת רוטט השיער. זיהוי סף פשוט (קו אופקי חוצה את עקבות neurogram ב A (I-III)) נעשה שימוש בניתוח זה. עם זאת, פונקציונלית של תוכנת הקלטה יכולה לשמש לעתים קרובות בצורה מתוחכמת יותרלהפלות תכונות של גודל וצורה ספייק. אז זה יכול לבודד תגובות של סיבים מביאים מסוימים לפי מאפיינים אלה כדי לאפשר ניתוח הקלטה פסאודו יחידה אחת להתבצע.

איור 1
איור 1:. הסדר הקלטת אלקטרו N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) פירידיניום Dibromide התיוג של סופי אזמלי זקיק השיער מביא (א) פינה כנה להגדיר עבור ניסוי אלקטרו מראה את אפרכסת האוזן אורינטציה, את המיקום של העצבים, האלקטרודות ההקלטה באזור החשוף של עצבוב זקיק לאחר הסרת רקמת השומן. (ב) זקיקי שיער כמה גלויי תאורה בשדה בהיר באזור הפינה של רקמות שומן שמעליה עד הדרמיס. בחושך, בדרך כלל bilobed, צורות הם בלוטות חלב. ( 7, באישורו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: (א) פעילות עורר Stimulus קלטות מעכבר הפינה. (Ai-iii) דוגמאות, שנלקחו 3 ניסויים שונים, פעילות מתוך neurograms הרציף pinnae תמיסת המלח של תקן Liley. כל רשומה מציגה קטע שניות 5 כ 5 דקות לאחר תחילת הקלטה, כולל תקופה שנייה 3 של עקירה סינוסי של כמספר הקניון של לשערות. הגירוי המכאני חזר על עצמו כל 30 שניות ברחבי ההקלטה הרציפה, אשר בדרך כלל נמשכת 1-2 שעות. קבצי סקריפט מותאמים אישית מסומן אירועים בודדים כי חצו סף שקבע סמן האופקי (קוצים), כמו גם את תחילתה של כל מחזור סינוסי (נקודה). (AIV) האות הפקודה עבור עקירה סינוסי. (ב) ניתוח של Stimulus עורר פעילות להתחדד. (Bi-iii) היסטוגרמות מחזור ב 3 ° פחי נבנו ממדגם neurogram (Ai-iii) בהתאמה, מראות את התגובות של סופים אזמלי בחזקת גירוי מכאני על ידי עקירה סינוסי 5 הרץ של לשערות על ידי בדיקת זכוכית. הערה בשלב הנעילה המסומנת, בשלבים שונים של המחזור, בהתאם מיקומם ביחס למצב ההתחלתי של החללית המכאנית. (ביב) sinusoid עקירה החללית מנורמל; משרעת בפועל היה כ 1001;. מ ' אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הנה, פתחנו תכשיר פשוט יחסית, יכול להיות גזור במהירות, יש צפיפות זקיקי שיער נמוכה ומאפשר גירוי מכאני סלקטיבית יחסית של מספר קטן של זקיקי שיער. הוא נגיש בקלות עבור הקלטת אלקטרו הדמית ניאון לחיות תאים, הכוללות התגובות לצבוע יישום כדי להמחיש את זקיקי שיער מגורים באופן מכאני, כלומר זקיקי הדמיה עם תגובות אלקטרו מוגדרות. למרות שאנו עדיין לא עשינו זאת, מערכת זו גם נראית נוחה ונגיש תת-חלוקת העצב התחושתי עבור יחידה אחת הקלטה (חושי האקסון יחיד) ושימוש GFP ביטוי ממוקד המאפשר הדמיה שהסתיים מורפולוגיה מסוף חושית.

השתמשנו בהכנת עור האוזן לחקור את המאפיינים של הפנמת שחרורו של צבעי pridinium styryl קרום ניאון 7, טכניקה שפותחה במקור ללמוד vesic המקומימחזור קרום le במסופים הסינפטי 8. סינפסות, הדמיה גם משולבת בקלות עם הקלטת אלקטרו סימולטני של תגובות במסופים מזוהים 8,9. זה היה במחקרים המוקדמים אלה שאנחנו קודם ציינו הצבעים הופנמו גם על ידי קצות mechanosensory 10. עבור עצב סנסורי בתרבות בתאי שיער שבלול, חלק גדול מן התיוג על ידי צבעי styryl פירידיניום נראה לערב צבע עובר דרך ערוצי mechanosensory, אשר לאחר מכן הם לחסום 11,12. הצבעים עליו מדבקת ממברנות תאיות, וסימון זה הוא בלתי הפיך. עם זאת, בתאי שיער שאינם מגורים מכאני 13,14 ו מסוף עצב תחושתי בדיל עיקרי מלא באתרו, כגון סופי Ia ב כישור שריר 15, ובסופו של הסופים אזמלי כאן 7, תיוג לצבוע styryl משקף אנדוציטוזה הממברנה, תיוג מאז הוא הפיך ואינו לחסום את מיל mechanosensoryponses 7,15,16. בעוד כמה הפנמה לצבוע ידי חלחול ערוץ הסופים אלה לא ניתן לשלול לחלוטין, ברור מן הירי נמשך במהלך דגירה לצבוע ואת ההפיכות של התיוג שהרוב הגדול של התיוג במסופי בדיל באתרו הוא על ידי הפנמה עם שלפוחית ​​מחזור קְרוּם. לכן, טכניקה פשוטה זו משמשת בקלות לניטור חשמלי ואופטי משולב של מגוון רחב של פונקציות מסוף mechanosensory ברקמות vivo לשעבר.

כמו ברוב טכניקות מעשיות, שחזור ידרוש חזרה ותרגול. כמה נקודות המפתח שווה תשומת לב מסוימת תפורט עכשיו. במהלך פגישת דיסקציה הקלטה, למקסם כדאי רקמות והישרדות ידי הבטחת ההכנה perfused כל זמן עם מי מלח רווה לגמרי עם 95% O 2/5% CO 2. ודא שיער זקיקים אינם שנעקרו במהלך תהליך זה, ש"שich תעודד ירי הסוף חושי. כך או להשתמש במערכת זלוף רציפה, זרימה למינרית, או גז בועה בעיון את אמבטית האיבר עם צינורות בסדר ממרחק מן ההכנה, או בזהירות לרענן פתרונות לכל דקה '20-30, שמירה על ההכנה מתחת לפני השטח המלוח בכל העת. אלקטרודות הקלטת יניקה מבוצעות על ידי שינוי טפטפות בורוסיליקט אלקטרודה החדה המשמשת בדרך כלל לכלי הקלטה תאית. ראשית, בזהירות לשבור את הקצות החדות עם # 3 מלקחיים לתת הקוטר הפנימי המתאים כדי להתאים את העצבים-פולני אש מאוד קצרה (<1 sec) חשיפת להבת מבער בונזן (ראה 2.4 ו -2.5). כדי לקבל יחס אות לרעש טוב בעת הקלטה, זה הכרחי כי העכבה החשמלית (התנגדות) בשתי אלקטרודות אלו הן מוגדלת ושווות. עושה זאת על ידי מתן תשומת לב לפרטים הבאים של שתי אלקטרודות. עבור האלקטרודה הקלטה, להבטיח את הקוטר הפנימי הוא התאים בקושי עבור העצב, ואת האורך המרבי של neRVE הוא נשאב לתוך האלקטרודה ההקלטה. נסה להשתמש רקמת חיבור המקיפה את העצבים לאטום את קצה האלקטרודה ביעילות. לחלופין, או בנוסף, לצייר את הקצה הצר של פיסה כראוי בגודל, מחודדת של רקמת שומן לצד העצב. לאחר מכן, חבר את קצה האלקטרודה על ידי יישום יניקה חזקה דקות ~ 1 עם מזרק 50 מ"ל מצורף צינורות. לתיקון קצה היטב אטום, החלת יניקה חזקה פשוט תחזק את האפקטיביות של התקע ולא למשוך יותר נוזלי או עצב. כדי למנוע נזק עצבי, לעומת זאת, להבטיח כי רקמת החיבור הוא שצריך לרפד העצב כתוצאה מהלחץ על החומר שמסביב וסחוס EAM. האלקטרודה האדיש צריך לחקות את עכבת ההתנגדות / של האלקטרודה ההקלטה ככל האפשר. זה עזר מאש-ליטוש בזהירות את המידע לשלטונות קטן צמצם ככל האפשר מבלי איטום זה. אם התנגדות נוספת נדרשת, ולאחר מכן חבר את הקצה של האלקטרודה האדיש עם adipose רקמת חיבור, כפי שתואר לעיל עבור האלקטרודה ההקלטה.

Electroceramic נותן שליטה מעולה על עקירה מכאנית, הוא במרחב ובזמן. עם זאת, לטפל ביצוע חיבורים חשמליים - טמפרטורות גבוהות להשמיד אותם, ועל כן אין להשתמש הלחמה חמה. להשתמש בדבק אפוקסי טעון מתכת, או להשתמש בשקע מומחה שכיבות לנכונות מומלץ על ידי הספק. זה הן יחזיקו אותו בחוזקה ולהקים קישוריות חשמל. צרף את החללית מגרה זכוכית אל electroceramic עם שרף אפוקסי רגיל. אש-פולנית בסופו של 10 ס"מ סטנדרטי x צינור נימי זכוכית בורוסיליקט 1.5 מ"מ קוטר המשמש להכנת תיקון או אלקטרודות לחיתוך הקלטה אלקטרו כדי למזער את הסיכון של נזק לרקמות. אם גירוי זקיק בודד שיער נדרש, אש-פולני הקצה להתאים שערה אחת, ומקם את החללית עם שערה אחת בתוך הצמצם הפתוח. זה נותן שליטה מעולה על שערה אחת. לקבלת dy styrylתיוג אלקטרוני, הוא אחיד בדרך כלל יותר ברקמות מבעלי חיים צעירים. זה לא לגמרי ברור מדוע, אבל זה כנראה משקף פחות טראומה מכאנית והסרת רקמות עמוקה יעילה יותר מן הרקמות הצעירות. להיות יסודי בהסרת פוליסטירן הדומה שכבת הקצף המכסה את בסיסי זקיק שיער. עם זאת, להימנע מלהיות מדי נמרצת, כמו זה סיכוני הסרת השכבה מקלעת העצבים ומסופי אזמלי הקשורים. אם יש מעט או ללא תגובה חשמלית לתנועת זקיק שיער, ויישום לצבוע styryl מוביל תיוג שולט של בלוטות חלב (צהובות / לבן), עם autofluorescence הברור של בבסיס השערה ולא סופים אזמלי (כתום / צהוב), אישור נלהב יתר על זיקת הרקמות שמתחת לפני השטח. לבסוף, באמצעות סוכן-chelating לצבוע לפני ההדמיה משפר באופן משמעותי לעומת תמונה ואיכות התמונות הסופיות.

טכניקה זו יכולה להיות שימושית במגוון של מחקרים נוספים. שיתוף אלהULD כולל, למשל, בדיקות סקר לאיתור הערוץ mechanosensory (הים) האחראי עורר תגובות מתיחות, על ידי דוגרי ההכנה עם ליגנדים תרופתיים סלקטיבית עבור ערוצי מועמד או הקרנת קווי עכבר עם ערוצים כאלה שנמחקו גנטיים. זה האחרון יכול להיות משולב עם ערכת קרינה של כל שינויים במורפולוגיה מסוף בשל מניפולציה גנטית בקווי עכבר, למשל עם ביטוי של GFP הצמוד Npy2r 17. דוגמא סופית עשויה להיות חוקרת את תפקיד השלפוחית ​​דמוית הסינפטי (ספקים חד-הלשונית) 7 במסופי אזמלים אלה על ידי בחינת ההשפעה של מאפננים ממחזור SLV (Ca, Mg, latrotoxin, הליגנדים קולטן הגלוטמט) על עורר תגובות למתוח ספיגת צבע styryl /לְשַׁחְרֵר. לפיכך, טכניקה חדשה זו פותחת מגוון של שדרות פוטנציאל מעניינות של מחקר במדעי מוח mechansensory.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS - Sylgard 184 Dow Corning Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps Fine Science Tools 11231-20
Austerlitz Insect pins Fine Science Tools 26002-10 Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier Digitimer Neurolog NL104A Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. 
High/Low-pass Filter Digitimer Neurolog NL125 Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger Digitimer Neurolog NL201 Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. 
Audio Amplifier & speakers Digitimer Neurolog NL120S Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope 
Oscilloscope Digitimer PM3380A We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer Morgan Electroceramics, Southampton UK PZT507 Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply Home made 0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software Cambridge Electronic Design (CED) Spike2 v7 Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface Cambridge Electronic Design (CED) 1401 micro Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4 Biotium/Cambridge Bioscience BT70020 Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7 Biotium/Cambridge Bioscience BT70029 A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394 Qimaging Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software Perkin Elmer Volocity 6.3 Image capture and analysis software.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14, (4), 300-309 (2009).
  2. Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
  3. Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407, (6807), 1007-1011 (2000).
  4. Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516, (7529), 121-125 (2014).
  5. Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449, (2), 103-119 (2002).
  6. Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
  7. Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591, (10), 2523-2540 (2013).
  8. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, (5041), 200-203 (1992).
  9. Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
  11. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
  12. Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (1), 1 (2007).
  13. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  14. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20, (1), 41-50 (2004).
  15. Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562, (2), 381-394 (2005).
  16. Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21, (PC22), (2010).
  17. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, (7), 1615-1627 (2011).
הקלטה משולב של תוויות מסוף פלט ועצב מבחינה מכנית מאולצת מביא ב Endings עכבר זקיק השיער אזמלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).More

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter