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Neuroscience

Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings

doi: 10.3791/53854 Published: May 7, 2016

Abstract

Una tecnica di dissezione e la registrazione romanzo è descritto per la cottura monitoraggio afferente evocato da spostamento meccanico dei capelli nella pinna del mouse. La tecnica è molto conveniente e facilmente intrapresa con materiali comunemente presenti nella maggior parte dei laboratori di elettrofisiologia, o facilmente acquistati. La dissezione è semplice e veloce, con lo spostamento meccanico fornito da un generico wafer electroceramic controllato dal software proprietario. Lo stesso software registra anche e analizza l'uscita electroneurogram. La registrazione dell'attività del nervo evocata è attraverso un amplificatore differenziale commerciale collegato a microelettrodi di vetro standard fuoco lucido. consigli utili sono dati per migliorare la qualità della preparazione, la stimolazione e le condizioni di registrazione per ottimizzare la qualità di registrazione. Il sistema è adatto per saggiare le proprietà elettrofisiologiche e ottiche di terminali lanceolate di terminazioni palizzate di follicoli piliferi, nonché lai risultati da loro manipolazione farmacologica e / o genetica. Un esempio di combinazione registrazione elettrica con stimolazione meccanica e marcatura con un colorante vitale styryl piridinio è dato.

Introduction

I terminali lanceolate di assoni sensitivi che innervano i follicoli piliferi nei mammiferi formano palizzate intorno l'epitelio capelli-albero. Il loro scopo è quello di rilevare spostamento meccanico dei peli che circondano. Essi sono un mix di rapido e lentamente adattando terminazioni che producono prevalentemente brevi sequenze di attività in risposta al movimento dei capelli. Attività cessa molto rapidamente quando il movimento si arresta, anche in presenza di spostamento continuato. Qui si descrive lo sviluppo di questo modello murino Pinna per gli studi correlativi della struttura e funzione nei terminali lanceolate. Il padiglione auricolare ha molte caratteristiche vantaggiose per lo studio di questi terminali. Innanzitutto, la pinna è essenzialmente due strati di pelle apposto back-to-back, con poco altro tessuto tra di interferire con l'accesso ai follicoli e terminali. La pelle è molto sottile e facilmente sezionato a causa di minime quantità di tessuto connettivo duro. L'innervazione è facilmente accessibile e identificabile. Mentre follicl capelliES sono presenti, sono relativamente poco distribuiti, facilitando la stimolazione di individui o piccoli gruppi di follicoli meccanicamente. Lo strato dermico sottostante sottile dà una buona accessibilità alle terminazioni nervose con farmaci farmacologici e coloranti. Questo li rende particolarmente ideale per gli studi di imaging usando la microscopia a fluorescenza. L'acquisizione di immagini può essere sia in terminali viventi, o dopo fissazione e successiva trasformazione istologica.

Le risposte dei neuroni meccanosensoriali innervano follicoli piliferi sono stati tradizionalmente studiati in roditori vibrisse 1,2 e, in misura minore, in preparazioni della pelle isolati 3,4. Questi hanno insegnato molto sui principi generali della fisiologia meccanosensoriali nelle terminazioni nervose che circondano il fusto del capello. La preparazione vibrissal permette il controllo squisito il movimento di un singolo follicolo pilifero. Tuttavia, può essere difficile decifrare l'uscita a causa della sua complessità, come vibrissalfollicoli contengono almeno 8 diversi tipi di anatomicamente distinti finale meccanosensoriali 5 e l'abbinamento di questi tipi morfologici a specifiche risposte elettrofisiologiche è ancora oggetto di controversia. Il / preparato nervo safeno pelle del mouse è più spesso utilizzato nel suo stato depilata di indagare le risposte tattili e dolore. L'innervazione dei follicoli piliferi in una tale preparazione è meno complesso ma la densità dei follicoli piliferi, più la presenza di tre diversi tipi follicolo (guardia, punteruolo / auchene e capelli zigzag) in tale vicinanza 6, significa studiare le risposte specifiche di un singolo follicolo o solo tipo di finale è ancora impegnativo. Inoltre, questa preparazione implica una dissezione complesso. Infine, sia vibrissal e altre preparazioni pelle, è difficile visualizzare le terminazioni coinvolti mentre la ex vivo preparativi sono ancora vivi. Così, il sezionamento del tessuto è necessario anche in linee di topi GFP che esprimono. alternativamente, richiede ulteriore elaborazione istologica / immunologica come la fissazione e / o l'incubazione anticorpo per immunofluorescenza.

Abbiamo quindi sviluppato la preparazione padiglione auricolare e lo ha utilizzato per effettuare registrazioni elettrici da una popolazione ristretta di capelli afferenze follicolo e dimostrare che la membrana ciclismo si verifica in queste terminazioni lanceolate, rappresentati da assorbimento di coloranti styryl piridinio. Infine, abbiamo dimostrato che il colorante non interferisca con sensibilità meccanica, indicando che non blocca i canali meccanotrasduzione. I risultati di semplici protocolli di stimolazione e di analisi sono illustrati.

Protocol

Mouse post mortem raccolta dei tessuti deve utilizzare approvato metodi etici. Nel Regno Unito, dislocazione cervicale è un metodo approvato governo per topi adulti (un elencato metodo di pianificazione 1 negli animali del Regno Unito (Procedure Scientifiche) Act, 1986 e la direttiva europea 2010/63 / UE). Questa normativa viene applicata localmente presso l'Università di Aberdeen da parte del benessere degli animali e etica Review Board, che ha esaminato e approvato tutte le procedure utilizzate nella seguente protocollo.

Nota: Questi metodi sono stati utilizzati per la ricerca riportata nel Banks et al 7.

1. Orecchie Preparazione per Elettrofisiologia

  1. Prima dissezione, preparare una soluzione salina fisiologica standard, come Liley (1956) e saturare con 90% O 2/5% di CO 2. Salina di Liley (mM) comprende: NaHCO 3 (12), KCl (4), KH 2 PO 4 (1), NaCl (138,8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) e glucosio(11).
  2. Umanamente eutanasia un topo adulto senza danneggiare il teschio vicino alle orecchie. Qui usiamo topi C57 / Bl6J e MF1 ma qualsiasi ceppo standard di laboratorio mouse può essere utilizzato. Idealmente, usare i topi che sono <25 g se la registrazione elettrica deve essere combinato con l'etichettatura tintura styryl, come l'etichettatura nei topi più grandi è meno affidabile, essendo spesso si trova solo in zone circoscritte ristrette.
  3. Rimuovere la testa con grandi forbici o cesoie ossee.
  4. Posizionare il lato testa dorsale fino a gasato Liley di in una vasta fondo piatto dissezione (50 centimetri di solito è conveniente) sul palco di un microscopio dissezione stereo. Regolarmente (~ 10 min) chiusa o immergere la testa con soluzione salina gasati.
  5. incise con cura e separare la pelle alla base dell'orecchio esterno (padiglione auricolare) con le forbici springbow e # 3 pinze, esponendo la cartilagine del condotto uditivo esterno (EAM). Identificare i rami del trigemino (divisione mandibolare, MDV) e grandi nervi auricolari che emergono from del cranio in caverna della mandibolare progetto comune e attraverso la base di cartilagine per innervare la concava (anteriore) e convesse (posteriore) gli aspetti della pelle Pinna, rispettivamente.
  6. Vicino al cranio, identificare dove i due rami del nervo uscita nel solco tra la mascella e il processo mastoide. Massimizzare la loro lunghezza tirando delicatamente il padiglione auricolare via dal cranio e tagliare i nervi più vicino al cranio il più possibile.
  7. Rimuovere la pinna dalla testa con le forbici springbow, avendo cura di evitare i monconi distali dei nervi divisi e minimizzando la quantità di denso pelage alla base dell'orecchio che viene rimosso.
  8. Trasferire la pinna di una gomma flessibile in silicone (PDMS) Piatto -lined riempito di liquido Gassed di Liley. Aprire il EAM dividendolo nel punto più stretto (anteriore-la maggior parte). Appiattire il padiglione auricolare, pelle anteriore (concava) rivolto verso il basso e il pin per il PDMS con attenzione ai bordi con ~ 6-8 intervalli regolari molto sottili (~ 0,2 mm di diametro) perni di insetti.
  9. Remil sobrio la pelle della faccia posteriore del padiglione auricolare completamente e rimuovere parzialmente la cartilagine pinna per via smussa con # 3 pinze, assicurando la pelle anteriore è lasciata intatta.
  10. Con la punta di un bel perno insetto afferrato con # 3 pinze, si estende dolcemente i rami (di solito 2) del MDV che emergono posteriormente tra la pelle e cartilagini EAM. Pin questi per il PDMS con i migliori possibili perni di insetti, impalare il tessuto connettivo adiacente loro estremità tagliate e non nervose tronchi stessi.
  11. Rimuovere la maggior parte del tessuto connettivo circostante che li circonda, evitando accuratamente i danni da eccesso di trazione o taglio.

2. registrazione elettrofisiologica Set Up

  1. Pin la pelle pinna alla base PDMS-allineati di una camera di registrazione con sottili perni di insetti intorno ai bordi (~ 6-8 per orecchio), mettendo i nervi puliti alla base dell'orecchio vicino due elettrodi di aspirazione - uno per la registrazione (ad prendere il nervo) e l'otlei un elettrodo indifferente (per fornire il segnale di folle ad un amplificatore differenziale, vedi 7).
  2. Per l'elettrodo di registrazione, corrispondere accuratamente l'apertura e diametro interno dell'apertura allo spessore combinato dei due nervi, in modo da adattarsi perfettamente quanto possibile e a grande lunghezza possibile.
  3. Disegnare i nervi nella elettrodo aspirazione delicata da una siringa 2 ml attaccato all'altra estremità di tubi in gomma siliconica. Assicurarsi che i nervi sono diritti, non piegata o raddoppiato.
  4. Sviluppare un alto elettrica in forma di resistenza / impedenza utilizzando forte aspirazione per disegnare il tessuto connettivo o un tessuto adiposo in modo da formare un tappo che sigilla ermeticamente l'apertura intorno al nervo.
  5. Riempire l'altro elettrodo (indifferente) con soluzione salina per aspirazione, se necessario (si riempia per capillarità).
  6. Posizionare fili registrazione identiche (argento o platino) nel foro interno degli elettrodi di registrazione per contattare la soluzione salina e il nervo(Registrazione) o ristretta, end ribruciate (indifferente) dell'elettrodo. Ogni elettrodo è saldato individualmente a diversi nuclei di cavo schermato a due fili. Posizionare la vasca (terra) elettrodo (Ag / AgCl pellet) nel bagno, lo ridusse allo schermo del cavo due core collegato agli elettrodi di registrazione.
  7. Feed l'attività elettrica dei due elettrodi nei canali separati di un amplificatore differenziale, filtro (banda superato 0,2-2 kHz), e vista schermo di un oscilloscopio. Controllare che il canale A (registrazione) e il canale B (indifferenti) livelli di rumore elettrico aspetto simile. In questa fase può non essere possibile vedere i normali potenziali d'azione spontanei del canale A prima che i due elettrodi sono bilanciati.
  8. Risarcimento eventuali differenze di rumore di fondo tra gli elettrodi, aumentando l'impedenza della registrazione (canale A) o elettrodi (canale B) indifferenti. A tale scopo, succhiando areolare (adiposo) tessuto connettivo più in nessuna delle due elettrodi, e /o applicare una maggiore forza di aspirazione sulla siringa 50 ml.
    1. Una volta 'bilanciata' in questo modo, tornare alla differenziali (AB) la registrazione e cercare potenziali spontanei di azione (AP) nella traccia o quando accarezzando i capelli ai margini del padiglione auricolare. Se si vede alcuna attività (spiking), ri-controllare la perfetta aderenza del nervo nell'elettrodo registrazione e il tessuto connettivo areolare nel elettrodo indifferente - di solito il più stretto (maggiore resistenza) la guarnizione e il più uguale all'impedenza nei due elettrodi, meglio è. Con la pratica, si otterrà una buona qualità (> 2: 1) Segnale: rumore.
  9. Registrare il electroneurogram tramite un software di interfaccia laboratorio e di elettrofisiologia in esecuzione su un computer. Un'uscita audio di spiking è molto utile e può essere ottenuto alimentando il neurogram attraverso un amplificatore audio e altoparlante audio associato. Regolare la soglia di essere appena sopra il rumore di fondo (identificato dall'assenza di bianco-nOise 'sibilo').
  10. Per aumentare droga o fluorescente accesso tintura styryl alle terminazioni lanceolate, togliere via lo strato adiposo sub-dermica vicino al margine Pinna, aprendo una finestra su di ~ 5 mm x 5 mm di esporre il derma e la base dei follicoli (Figura 1A, B ).
  11. Pin indietro una piega di ~ 1 mm pelle dell'orecchio adiposo-eliminato al margine di primo piano (a livello della finestra appena prodotto, se del caso), lasciando un evidente gap soluzione salina tra gli strati della pelle apposto. Delicatamente ictus i peli sporgenti lungo il bordo ripiegato con uno spillo o una pinza sottile a terra, senza toccare la pelle, per individuare la zona di uscita massima di AP sul oscilloscopio e il caratteristico 'click' e 'pop' in uscita audio.

3. potenziali d'azione di registrazione stimolo-evocati

  1. Posizionare la sonda stimolazione meccanica - 10 cm in vetro borosilicato microelettrodi Sfaccettate collegato a un Ceramic piezoelettrico attuatore - così il movimento è parallelo con la pelle piega. Posizionare la punta di circa 0,5-1 mm dalla piega della pelle, in modo che tocchi i capelli, ma non la pelle. Verificare la stimolazione efficace spostando lentamente la punta della sonda manualmente per deviare i peli e osservare / ascoltare la chiodare.
  2. Utilizzare il software per guidare stimolazione meccanica di 1-3 peli (ad esempio 3 secondi a 5 sinusoidi Hz, ogni 10 sec. Sonda cilindrata 200-500 micron), e registrare le risposte di stimolo-evocata nei nervi.
  3. Dare diversi identiche treni stimolazione meccanica a intervalli di 10 sec. Ottimizzare la posizione della sonda per la ripetibilità, quindi ridurre la frequenza di stimolazione in base al protocollo sperimentale (ad esempio, calo dei tassi di ripetizione da 10 sec a 30 sec).
  4. Utilizzare il software di discriminare AP-come attività ad esempio utilizzando una semplice soglia impostata a ~ 2x l'ampiezza del rumore ad alta frequenza e ~ 25% dei più grandi punti di accesso.
  5. Contare i punti di accesso che attraversano la soglia"eventi", quantificando la frequenza e le caratteristiche dei prodotti AP.

4. La cottura di registrazione stimolo-evocato In combinazione con N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) piridinio Dibromide Labeling

  1. Per esaminare gli effetti del stirilici su stimolo-evocato cottura afferenti ed etichettatura terminale, aggiungere la concentrazione appropriata di un colorante styryl di scelta, alla soluzione di balneazione e continuare con la registrazione elettrica.
  2. Dopo il tempo di esposizione necessario (solitamente almeno 30 min), preparare la preparazione per la visualizzazione dei follicoli. Aprire il lembo cutaneo, eliminando i perni di fissaggio, ed esporre l'area cutanea eliminato per rivelare l'etichettatura terminale.
  3. Lavare via tintura esterno con soluzione salina priva di tintura, rendendo 3 cambi completi di soluzione salina.
  4. Incubare al cambio finale di soluzione salina senza colorante gasati per 10-15 minuti per consentire la contaminazione tintura più persistente a percolare da esposte membrane / esterni.
  5. Rimuovere colorante non internalizzati rimanente membrane con un agente sequestrante (sulfobutylated beta-ciclodestrina, 1 mM, 5 min) in soluzione salina.
  6. Trasferire la camera di registrazione alla fase di un microscopio a epifluorescenza in posizione verticale e coinvolgere la camera con il meccanismo di movimento di fase / slide.
  7. Illuminare la preparazione con la luce di eccitazione appropriato per il colorante styryl. Utilizzare un obiettivo microscopio 10X o 25X fluorescenza per osservare l'etichettatura follicolo (Figura 1).

Representative Results

La disposizione registrazione elettrofisiologica, con il tessuto adiposo sottocutaneo rimosso per esporre i follicoli piliferi, viene mostrato nella Figura 1A. Una parte di questa zona esposta è mostrato un ingrandimento maggiore nell'illuminazione campo chiaro in Figura 1B. Pieghevole margine pinna e su se stesso in questo settore espone la superficie epidermica. Ciò posiziona i peli sul bordo della piega a sporgere orizzontalmente, in una situazione ideale per la stimolazione meccanica con una sonda smussato (non mostrato). La figura 1C mostra che dopo l'esposizione tintura e ritornando nuovamente il margine alla posizione dispiegata, il follicoli stimolato in questa posizione sono stati etichettati con un colorante styryl piridinio. Electroneurograms da preparazioni mostrano tipicamente corso dell'attività AP anche in assenza di movimento imposto della sonda in fibra di vetro, compreso AP dalle dimensioni maggiori (Figura 2A (Figura 2BI-iii)). Questo è abbastanza ripetibile, anche se la fase della forma d'onda in cui le risposte sono bloccate dipende dalla loro posizione, cioè in quale punto il movimento vibrante sonda contatta i capelli. Un semplice rilevamento di soglia (linea orizzontale che attraversa le tracce neurogram in A (i-iii)) è stato utilizzato per questa analisi. Tuttavia, la funzionalità software di registrazione può essere spesso utilizzato in modo più sofisticato perdiscriminare caratteristiche di dimensione picco e forma. Questo può quindi isolare le risposte di particolari fibre afferenti da queste caratteristiche per consentire l'analisi di registrazione pseudo-single-unità da intraprendere.

Figura 1
Figura 1:. Elettrofisiologiche Disposizione di registrazione e N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) piridinio Dibromide Etichettatura di follicolo pilifero terminazioni afferenti lanceolate (A) Un Pinna preparazione impostati per un esperimento elettrofisiologico che mostra la pinna orientamento, la posizione dei nervi, gli elettrodi di registrazione e l'area esposta del follicolo innervazione dopo la rimozione del tessuto adiposo. (B) Diversi follicoli piliferi sono visibili nella illuminazione campo chiaro nella zona libera da tessuti adiposi sovrastanti fino al derma. Il buio, di solito bilobato, le forme sono ghiandole sebacee. ( 7, con il permesso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: (a) Attività stimolo-evocato Registrato dal Pinna Mouse. (Ai-III) Esempi, tratti da 3 diversi esperimenti, di attività da neurograms continui da padiglioni auricolari in soluzione salina normale di Liley. Ogni record mostra una sezione 5 secondi a circa 5 minuti dopo l'inizio della registrazione, compreso un periodo 3 sec di spostamento sinusoidale comeil numero centro commerciale di fusto del capello. La stimolazione meccanica è stata ripetuta ogni 30 secondi per tutta la registrazione continua, che di solito è durato per 1-2 ore. file script personalizzati assegnati singoli eventi che hanno attraversato una soglia impostata dal cursore orizzontale (punte), così come la comparsa di ogni ciclo sinusoidale (periodo). (Aiv) Il segnale di comando per lo spostamento sinusoidale. (B) Analisi di stimolo-evocato Schiacciata attività. (Bi-III) istogrammi ciclo in 3 ° contenitori costruiti dai campioni neurogram rispettivamente (Ai-III), che mostra le risposte di terminazioni lanceolate presunti alla stimolazione meccanica da 5 Hz spostamento sinusoidale del fusto del capello da una sonda di vetro. Notare la fase di bloccaggio marcata, in diverse fasi del ciclo, a seconda della loro posizione rispetto alla posizione di partenza della sonda meccanica. (Biv) sonda normalizzato spostamento sinusoide; l'ampiezza effettiva era approssimativamente 1001;. M Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Qui, abbiamo sviluppato una relativamente semplice preparazione che possono essere rapidamente sezionato, ha bassa densità follicolo pilifero e permette stimolazione meccanica relativamente selettivo di un piccolo numero di follicoli piliferi. E 'facilmente accessibile per la registrazione elettrofisiologica e l'imaging a fluorescenza live-cellule, comprese le risposte a tingere applicazione di visualizzare i follicoli dei capelli stimolati meccanicamente, cioè i follicoli di imaging con risposte elettrofisiologiche definiti. Anche se non abbiamo fatto, questo sistema sembra anche facilmente suscettibili di sub-divisione del nervo sensitivo per singola unità (singolo assone sensoriale) registrazione e l'utilizzo mirato GFP-espressione per la visualizzazione sensoriale terminale di fine morfologia.

Abbiamo usato la preparazione della pelle dell'orecchio per studiare le caratteristiche della internalizzazione e rilascio dei fluorescente stirilici membrana pridinium coloranti 7, una tecnica originariamente sviluppato per studiare Vesic localizzataLe riciclaggio membrana nei terminali sinaptici 8. In sinapsi, l'imaging è anche facilmente combinato con registrazione elettrofisiologica simultanea di risposte nei terminali individuati 8,9. E 'stato in questi primi studi che abbiamo prima notato i coloranti sono stati internalizzati anche da terminazioni meccanosensoriali 10. Per i neuroni sensoriali nella cultura e nelle cellule ciliate cocleari, gran parte della etichettatura da coloranti styryl piridinio sembra coinvolgere i coloranti che passano attraverso i canali meccanosensoriali, che poi bloccano 11,12. I coloranti poi etichettare le membrane intracellulari, e questo l'etichettatura è irreversibile. Tuttavia, in cellule ciliate che non vengono stimolati meccanicamente 13,14 e completamente differenziate principali terminali sensoriali nervose in situ, come terminazioni Ia in fusi muscolari 15, e nelle terminazioni lanceolate qui 7, etichettatura tintura styryl sembra riflettere endocitosi membrana, dal momento che l'etichettatura è reversibile e non blocca le res meccanosensorialiponses 7,15,16. Mentre alcuni internalizzazione colorante da permeazione canale in queste terminazioni, non si può escludere del tutto, è chiaro dalla cottura continuata durante l'incubazione tintura e la reversibilità della etichettatura che la grande maggioranza della etichettatura terminali differenziati in situ è di internalizzazione con riciclo delle vescicole membrana. Così, questa semplice tecnica è facilmente utilizzato per il monitoraggio elettriche ed ottiche combinato di una serie di funzioni del terminale meccanosensoriali in ex vivo tessuti.

Come con la maggior parte delle tecniche pratiche, riproducibilità richiederà ripetizione e la pratica. Alcuni dei punti chiave particolare attenzione merita verrà ora descritta. Per tutta la sessione di dissezione e la registrazione, massimizzare la vitalità del tessuto e la sopravvivenza, garantendo la preparazione è costantemente perfuso con soluzione salina completamente saturato con il 95% O 2/5% di CO 2. Assicurarsi che i capelli follicoli non vengono spostati durante questo processo, which stimolerà sensoriale cottura finale. Utilizzare un sistema continuo flusso laminare perfusione o accuratamente gas bolla attraverso il bagno di organo con tubi raffinata ad una distanza dalla preparazione, o accuratamente aggiornare soluzioni ogni 20-30 minuti, mantenendo la preparazione di sotto della superficie salina in ogni momento. elettrodi di registrazione di aspirazione sono realizzate modificando taglienti pipette elettrodo borosilicato normalmente utilizzate per la registrazione intracellulare. In primo luogo, accuratamente rompere le punte affilate con # 3 pinze per dare il diametro interno adeguato per soddisfare i nervi e il fuoco-polacco per molto breve (1 sec <) l'esposizione a Bunsen fiamma del bruciatore (vedi 2.4 e 2.5). Per ottenere un buon rapporto segnale-rumore durante la registrazione, è essenziale che l'impedenza elettrica (resistenza) in questi due elettrodi si sia massimizzata e pari. A tale scopo, prestando attenzione a quanto segue nelle due elettrodi. Per l'elettrodo di registrazione, assicurarsi che il diametro interno è una perfetta aderenza per il nervo, e la lunghezza massima di Nerve viene aspirata l'elettrodo di registrazione. Provare a utilizzare il tessuto connettivo circostante il coraggio di sigillare in modo efficace l'elettrodo. In alternativa, o in aggiunta, disegnare l'estremità più stretta di dimensioni adeguate, piece rastremata del tessuto adiposo nel fianco del nervo. Quindi, inserire l'elettrodo applicando forte aspirazione per ~ 1 min con una siringa da 50 ml attaccato al tubo. Per una punta ben chiuso, l'applicazione di forte aspirazione semplicemente rafforzare l'efficacia della spina e non si baserà in più liquido o del nervo. Per evitare danni al sistema nervoso, tuttavia, assicurarsi che il tessuto connettivo è ammortizzazione il nervo dalla compressione sul materiale circostante e EAM cartilagine. L'elettrodo indifferente dovrebbe imitare la resistenza / impedenza dell'elettrodo di registrazione più vicino possibile. Questo è aiutato da accuratamente fuoco lucidatura della punta come piccolo un'apertura possibile, senza in realtà sigillarlo. Se è necessaria ulteriore resistenza, quindi inserire l'estremità dell'elettrodo indifferente con adipose il tessuto connettivo, come sopra descritto per l'elettrodo di registrazione.

Il electroceramic dà il controllo esclusive sui spostamento meccanico, sia spazialmente e temporalmente. Tuttavia, prendersi cura di effettuare i collegamenti elettrici - alte temperature li distruggono, in modo da non utilizzare saldatura a caldo. Utilizzare colla epossidica metallo-caricato, o utilizzare una presa specialista push-fit raccomandato dal fornitore. In questo modo sia tenerlo fermo e stabilire la connettività elettrica. Fissare la sonda vetro stimolante al electroceramic con resina epossidica standard. Fuoco-polacco alla fine di uno standard di 10 cm x 1,5 mm di diametro borosilicato tubo capillare di vetro usato per fare patch o elettrodi taglienti per la registrazione elettrofisiologica per ridurre al minimo il rischio di danni ai tessuti. Se è necessaria la stimolazione follicolo pilifero singolo, il fuoco-polacco la punta per misura un singolo capello, e posizionare la sonda con un singolo capello all'interno del diaframma aperto. Questo dà il controllo squisito su un singolo capello. Per styryl dye etichettatura, è generalmente più uniforme in tessuti di animali più giovani. Non è del tutto chiaro perché, ma questo probabilmente riflette trauma meno meccanico e più efficace rimozione dei tessuti profondi dai tessuti più giovani. Essere approfondita nella rimozione dello strato di schiuma di polistirene espanso Simile sovrastante le basi del follicolo pilifero. Tuttavia, evitare di essere troppo forte, in quanto ciò rischia di rimozione dello strato nervose del plesso e terminali lanceolate associati. Se c'è risposta elettrica poco o nessun al movimento del follicolo pilifero, ed applicazione di tintura styryl porta ad etichettatura predominante delle ghiandole sebacee (giallo / bianco), con autofluorescenza distinta della base del fusto del capello anziché terminazioni lanceolate (arancione / giallo), spazio troppo entusiasta ha danneggiato i tessuti sottostanti. Infine, utilizzando un agente colorante-chelante prima di imaging migliora notevolmente contrasto dell'immagine e la qualità delle immagini finali.

Questa tecnica può essere utile in una serie di ulteriori studi. questi coULD comprendono, ad esempio, lo screening per il canale meccanosensoriali (s) responsabile per le risposte di stiro-evocato, incubando la preparazione con ligandi farmacologici selettivi per i canali candidati o di screening linee del mouse con tali canali geneticamente cancellati. Quest'ultimo potrebbe essere combinato con la valutazione della fluorescenza di eventuali cambiamenti nella morfologia del terminale a causa della manipolazione genetica in linee del mouse, ad esempio con l'espressione GFP Npy2r-linked 17. Un ultimo esempio potrebbe essere indagare il ruolo delle vescicole sinaptiche-like (SLV) 7 in questi terminali lanceolate, esaminando l'effetto di modulatori di fatturato SLV (Ca, Mg, latrotoxin, ligandi dei recettori del glutammato) sulle risposte di stiro-evocato e tintura styryl assorbimento /uscita. Così, questa nuova tecnica apre una serie di viali potenzialmente interessanti di ricerca in neuroscienze mechansensory.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS - Sylgard 184 Dow Corning Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps Fine Science Tools 11231-20
Austerlitz Insect pins Fine Science Tools 26002-10 Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier Digitimer Neurolog NL104A Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. 
High/Low-pass Filter Digitimer Neurolog NL125 Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger Digitimer Neurolog NL201 Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. 
Audio Amplifier & speakers Digitimer Neurolog NL120S Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope 
Oscilloscope Digitimer PM3380A We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer Morgan Electroceramics, Southampton UK PZT507 Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply Home made 0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software Cambridge Electronic Design (CED) Spike2 v7 Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface Cambridge Electronic Design (CED) 1401 micro Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4 Biotium/Cambridge Bioscience BT70020 Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7 Biotium/Cambridge Bioscience BT70029 A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394 Qimaging Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software Perkin Elmer Volocity 6.3 Image capture and analysis software.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings
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Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).More

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).

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