A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
En ny disseksjon og registreringsteknikk er beskrevet for å overvåke afferent avfyring fremkalt av mekanisk forskyvning av hår i mus øremuslingen. Teknikken er svært kostnadseffektivt og enkelt foretas med materialer som vanligvis finnes i de fleste elektrofysiologiske laboratorier, eller lett kjøpt. Disseksjon er enkel og rask, med mekanisk forskyvning levert av en generisk elektrokeramiske wafer kontrollert av proprietær programvare. Den samme programvaren også poster og analyserer electroneurogram utgang. Registreringen av fremkalt nerveaktivitet er gjennom en kommersiell differensialforsterker som er koblet til brann polert standard glassmikroelektroder. Nyttige tips er gitt for å forbedre kvaliteten på forberedelse, stimulering og opptaksforholdene for å optimalisere opptakskvalitet. Systemet er egnet for analysering av elektrofysiologiske og optiske egenskapene til lansettformete terminaler fra Palisade avslutninger av hårsekkene, samtResultatene fra deres farmakologiske og / eller genetisk manipulasjon. Et eksempel på kombinasjon av elektriske opptak med mekanisk stimulering og merking med en styryl pyridinium vital fargestoff blir gitt.
De lansettformede terminalene på sensoriske aksoner innervating hårsekkene hos pattedyr danner palisader rundt håret-aksling epitel. Deres formål er å oppdage mekanisk forskyvning av hårene de omgir. De er en blanding av hurtig og sakte tilpasse avslutninger som hovedsakelig produserer små pakker med aktivitetsnivået til håret bevegelse. Aktiviteten opphører meget raskt når bevegelsen stanser, selv i nærvær av fortsatt forskyvning. Her beskriver vi utviklingen av denne murine pinna modell for samsvarende studier av struktur og funksjon i lansettformete terminaler. Øremuslingen har mange fordelaktige egenskaper for å studere disse avslutninger. Først er det ytre øret hovedsak to lag av huden apposed back-to-back, med lite annet vev mellom å forstyrre tilgangen til follikler og terminaler. Huden er meget tynn og lett dissekert på grunn av minimale mengder av seigt bindevev. Den innervasjon er lett tilgjengelig og identifiserbare. Mens håret follicles er til stede, de er forholdsvis tynt fordelt, legge til rette for stimulering av enkeltpersoner eller små grupper av follikler mekanisk. Den tynne underliggende dermal lag gir god tilgjengelighet til nerveterminalene med farmakologiske stoffer og fargestoffer. Dette gjør dem spesielt ideelt for bildediagnostikk ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Bildebehandling kan enten være i levende terminaler, eller etter fiksering og videre histologisk behandling.
Responsene til mechanosensory neuroner innervating hårsekkene har tradisjonelt blitt studert i gnager vibrissae 1,2 og, i mindre grad, i isolerte hudpreparater 3,4. Disse har lært oss mye om de generelle prinsippene for mechanosensory fysiologi i nerveterminalene rundt håret. Den vibrissal forberedelse gjør utsøkt kontroll over bevegelse av en enkelt hårsekken. Imidlertid kan det være vanskelig å tyde utgang på grunn av sin kompleksitet, som vibrissalfollicles inneholde minst 8 forskjellige typer anatomisk tydelig mechanosensory avslutning fem og matching av disse morfologiske typer til spesifikke elektrofysiologiske responser er fortsatt omstridt. Musen hud / saphenous nerve forberedelse er oftest brukt i sin hårfrie staten til å undersøke berørings og smerte svar. Den innervasjon av hårsekkene i et slikt preparat er mindre kompleks, men tettheten av hårsekkene, pluss tilstedeværelsen av tre ulike hårsekken typer (vakt, Syl / auchene og sikksakk hår) i slik nærhet 6, betyr å studere de spesifikke svarene av en enkelt hårsekken eller én type ending blir igjen utfordrende. Videre innebærer dette preparat et kompleks disseksjon. Til slutt, i både vibrissal og andre hudpreparater, er det vanskelig å visualisere de avslutninger som er involvert, mens den ex vivo preparater er fortsatt i live. Således er vevet snitte nødvendig selv i GFP-uttrykkende mus linjer. Alternatisvis, det krever ytterligere histologisk / immunologisk behandling, for eksempel fiksering og / eller antistoff inkubering i immunfluorescens.
Vi har derfor utviklet øremuslingen forberedelse og brukte den til å lage elektriske opptak fra en begrenset populasjon av hårsekken afferente og vise at membran sykling skjer i disse lansettformede avslutninger, dokumentert av opptak av styryl pyridinium fargestoffer. Til slutt viste vi at fargen ikke forstyrrer mekanisk følsomhet, noe som indikerer at det ikke blokkerer mechanotransduction kanaler. Resultatene av enkle stimulering og analyseprotokoller er illustrert.
Her har vi utviklet en relativt enkel forberedelse som raskt kan dissekert, har lav hårsekken tetthet og gir mulighet for relativt selektiv mekanisk stimulering av et lite antall hårsekker. Det er lett tilgjengelig for elektrofysiologisk opptak og live-celle fluorescerende bildebehandling, inkludert svar på fargestoff program for å visualisere mekanisk stimulert hårsekkene, dvs. bilde follikler med definerte elektrofysiologiske responser. Selv om vi ikke har gjort det, synes dette systemet også lett mottagelig for sub-dividere sensoriske nerve for enkelt enhet (single sensoriske axon) opptak og bruk av målrettet GFP-uttrykk for å visualisere sensorisk terminal slutter morfologi.
Vi har brukt øret huden forberedelse til å undersøke egenskapene til internalisering og frigjøring av fluorescerende membran styryl pridinium fargestoffer 7, en teknikk som opprinnelig ble utviklet for å studere lokalisert vesicle membran gjenvinning i synaptiske terminaler 8. I synapser, er bildebehandling også lett kombineres med samtidig elektrofysiologisk registrering av svar i identifiserte terminaler 8,9. Det var i disse tidlige studiene som vi først bemerket fargestoffer ble også internalisert av mechanosensory avslutninger 10. For sensoriske nevroner i kultur og i cochlea hårceller, mye av merkingen av styryl pyridinium fargestoffer synes å innebære fargestoffer som passerer gjennom mechanosensory kanaler, som de deretter blokkerer 11,12. De fargene deretter merke intracellulære membraner, og denne merkingen er irreversible. Men i hårcellene som ikke er mekanisk stimulert 13,14 og i fullt differensierte primære sensoriske nerveterminaler i situ, for eksempel Ia avslutninger i muskel spindler 15, og i lansettformede avslutninger her 7, styryl fargestoff merking synes å reflektere membran endocytose, siden merking er reversibel og ikke blokkere mechanosensory responses 7,15,16. Mens noen fargestoff intern etter kanal gjennomtrengning i disse avslutninger ikke kan utelukkes helt ut, er det klart fra fort skyting under fargestoff inkubasjon og reversibel merkingen at den store majoriteten av merkingen i differensierte terminaler i situ er ved internalisering med resirkulering vesikkel membran. Dermed er denne enkle teknikk lett anvendes for kombinert elektrisk og optisk kontroll av en rekke mechanosensory terminalfunksjoner i ex vivo vev.
Som med de fleste praktiske teknikker vil kreve reproduserbarhet repetisjon og praksis. Noen av de viktigste punktene verdt særlig oppmerksomhet vil nå bli beskrevet. Gjennom hele disseksjon og opptakssesjon, maksimere vev levedyktighet og overlevelse ved å sikre at preparatet er konstant perfusert med saltvann fullstendig mettet med 95% O2 / 5% CO2. Sørg for at håret follicles er ikke fortrenges under denne prosessen, which vil stimulere sanse ending avfyring. Enten bruke en kontinuerlig, laminær strømning perfusjon system, eller forsiktig boble gass gjennom organbadet med fin røret i en avstand fra det preparat, eller forsiktig oppdatere løsningene hver 20-30 min, og holder den nedenstående fremstilling saltvann overflaten til enhver tid. Suge opptak elektrodene er laget ved å modifisere skarpe elektrode borsilikat pipetter som normalt anvendes for intracellulære opptaket. Først forsiktig bryte av de skarpe spisser med # 3 tang for å gi den riktige indre diameter for å passe nerver og brann-polish av meget kort (<1 sekund) eksponering for Bunsen-brenner-flammen (se 2.4 og 2.5). For å få en god signal-til-støy-forholdet ved innspilling, er det viktig at den elektriske impedans (motstand) i disse to elektroder er både mulig og mest mulig like. Gjør dette ved å betale oppmerksomhet til følgende i de to elektroder. For opptaket elektrode, sikre indre diameter er en tettsittende passform for nerve, og den maksimale lengden på nekurven under trekkes inn i opptaks elektroden. Prøv å bruke bindevevet rundt nerve å effektivt forsegle elektrodespissen. Alternativt, eller i tillegg, trekker den smale enden av en passende størrelse, avsmalnende del av fettvev i ved siden av nerve. Koble deretter elektrodespissen ved å bruke sterke suge for ~ 1 min med en 50 ml sprøyte festet til slangen. For en godt forseglet spissen, vil påføre sterk suge bare styrke effektiviteten av pluggen, og vil ikke trekke i mer væske eller nerve. For å unngå nerveskader, men at bindevevet blir demping nerve fra kompresjon på det omkringliggende materialet og EAM brusk. Den likegyldig elektroden skal etterligne den motstand / impedansen av opptakselektrode så tett som mulig. Dette blir hjulpet av nøye brann-polering spissen til så liten blenderåpning som mulig uten å faktisk tetting. Hvis ytterligere motstand er nødvendig, og koble enden av likegyldig elektrode med adipose bindevev, som beskrevet ovenfor for opptak elektroden.
Den elektrokeramiske gir utsøkt kontroll over mekanisk forskyvning, både romlig og tidsmessig. Men ta vare å lage elektriske forbindelser – høye temperaturer ødelegge dem, så ikke bruk varmt loddetinn. Bruk metall lastet epoxy lim, eller bruke en spesialist push fit socket anbefalt av leverandøren. Dette vil både holde den fast og etablere elektrisk tilkobling. Fest glass stimulerende proben til den elektrokeramiske med standard epoksyharpiks. Brann-polish enden av en standard 10 cm x 1,5 mm diameter borsilikatglass kapillarrør anvendes for fremstilling av plaster eller skarpe elektroder for elektrofysiologisk opptak for å minimalisere risikoen for vevsskade. Dersom enkel hårsekken stimulering er nødvendig, for å brann-polsk spissen passe en enkelt hår, og plassere sonden med et eneste hår på innsiden av åpen blender. Dette gir utsøkte kontroll over en enkelt hår. For styryl dye merking, er det generelt mer ensartet i vev fra unge dyr. Det er ikke helt klart hvorfor, men det skyldes sannsynligvis mindre mekanisk trauma og mer effektiv fjerning av dype vev fra de yngre vev. Være grundig i å fjerne den skummende lag likner ekspandert polystyren liggende hårsekken baser. Men unngå å være for kraftig, da dette risikerer å fjerne nerve plexus lag og tilhørende lansettformete terminaler. Hvis det er lite eller ingen elektrisk respons på hårsekken bevegelse, og styryl fargestoff anvendelse fører til overveiende merking av talgkjertler (gule / hvite), med tydelig autofluorescens av basen på håret i stedet for lansettformete avslutninger (orange / gul), over-entusiastisk klaring har skadet de underliggende vev. Til slutt, ved hjelp av et fargestoff-chelateringsmiddel før avbilding forbedrer bildekontrast og kvaliteten på det endelige bilde.
Denne teknikk kan være nyttig i en rekke av videre studier. disse could innbefatter for eksempel, screening for de mechanosensory kanalen (e) er ansvarlig for strekk-fremkalt respons, ved inkubering av preparat med farmakologiske ligander selektive for kandidatkanaler eller screening mus linjer med slike kanaler genetisk slettet. Sistnevnte kan kombineres med fluorescens vurdering av eventuelle endringer i terminal morfologi på grunn av genetisk manipulasjon i mus linjer, f.eks med Npy2r bundet GFP uttrykk 17. Et siste eksempel kan være å undersøke hvilken rolle synaptiske lignende vesikler (Leverandører av ett språk) 7 i disse lansettformede terminalene ved å undersøke effekten av modulatorer av SLV omsetning (Ca, Mg, latrotoxin, glutamat reseptorligander) på strekk-fremkalte responser og styryl fargestoff opptak /utgivelse. Dermed åpner denne nye teknikken opp en rekke potensielt interessante muligheter for forskning i mechansensory nevrovitenskap.
The authors have nothing to disclose.
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |