A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
En ny dissektion och inspelningsteknik beskrivs för övervakning afferenta bränning framkallas genom mekanisk förflyttning av hår i musen pinna. Tekniken är mycket kostnadseffektivt och enkelt genomföras med material som vanligen finns i de flesta elektrofysiologiska laboratorier, eller lätt köpas. Dissektion är enkel och snabb, med den mekaniska förskjutningen från en generisk electroceramic skiva styrs av proprietär programvara. Samma programvara även in på och analyserar electroneurogram utgång. Inspelningen av den framkallade nervaktiviteten är genom en kommersiell differentialförstärkare ansluten till brand polerade standardglas mikroelektroder. Användbara tips ges för att förbättra kvaliteten av preparatet, stimulans och inspelningsförhållandena att optimera inspelningskvalitet. Systemet är lämpligt för analys av de elektrofysiologiska och optiska egenskaper hos lansettlika terminalerna hos Palisade ändelser av hårsäckar, såväl som denresultat från deras farmakologiska och / eller genetisk manipulation. Ett exempel på att kombinera elektrisk inspelning med mekanisk stimulering och märkning med en styryl pyridinium vitala färgämnet ges.
De lansettlika terminaler av sensoriska axoner innerverar hårsäckarna hos däggdjur bildar palissader runt håret axeln epitel. Deras syfte är att detektera mekanisk förflyttning av de hårstrån som de omger. De är en blandning av snabbt och långsamt anpassa ändelser som huvudsakligen producerar korta skurar av aktivitet som svar på håret rörelse. Aktivitet upphör mycket snabbt när rörelsen stannar, även i närvaro av en fortsatt förskjutning. Här beskriver vi utvecklingen av denna mus pinna modell för korrelat studier av struktur och funktion i lansettlika terminaler. Ytterörat har många fördelaktiga särdrag för att studera dessa avslutningar. För det första är ytterörat väsentligen två lager av hud apposed back-to-back, med lite annan vävnad mellan att hindra tillträde till folliklar och terminaler. Huden är mycket tunn och lätt dissekeras på grund av minimala mängder av tuffa bindväv. Innervation är lättillgängligt och identifierbar. Medan håret follicles är närvarande, de är relativt glest fördelade, vilket underlättar stimulering av enskilda eller små grupper av folliklar mekaniskt. Det tunna underliggande dermala skiktet ger god tillgänglighet till nervändarna med farmakologiska läkemedel och färgämnen. Detta gör dem särskilt idealisk för avbildning studier med fluorescensmikroskopi. Avbildning kan antingen vara i levande terminaler, eller efter fixering och ytterligare histologisk bearbetning.
Svaren från mechanosensory nervceller innerverar hårsäckar har traditionellt studerats i gnagare vibrissae 1,2 och, i mindre utsträckning, i isolerade hudpreparat 3,4. Dessa har lärt oss mycket om de allmänna principerna för mechanosensory fysiologi i nervterminalerna kring hårstrået. Den vibrissal beredning medger utsökt kontroll över rörelsen hos en enda hårsäcken. Dock kan det vara svårt att dechiffrera utsignalen på grund av dess komplexitet, som vibrissalfolliklar innehåller åtminstone 8 olika typer av anatomiskt distinkt mechanosensory slut 5 och matchningen av dessa morfologiska typer till specifika elektrofysiologisk undersökning är fortfarande en tvistefråga. Musen hud / vena nerv preparat används oftast i sin avhårade tillstånd att undersöka beröring och smärta svar. Innervation av hårsäckar i ett sådant preparat är mindre komplicerad men densiteten av hårsäckar, plus närvaron av tre olika follikelstimulerande typer (vakt, Awl / auchene och sicksack hårstrån) i en sådan närhet 6, innebär att studera specifika svar en enda follikelstimulerande eller enda typ av slut återigen utmana. Dessutom har denna beredning innebär en komplicerad dissektion. Slutligen, i både vibrissal och andra hudpreparat, är det svårt att visualisera ändelser inblandade medan ex vivo preparat är fortfarande lever. Således vävnad sektionering krävs även i GFP-uttryckande mus linjer. Alternatidevis krävs det ytterligare histologiska / immunologisk behandling såsom fixering och / eller antikropps inkubation för immunofluorescens.
Vi har därför utvecklat ytterörat preparatet och använde det för att göra elektriska inspelningar från en begränsad population av hårsäcken afferenter och visar att membran cykling sker i dessa lansettlika ändelser, framgår av upptag av styryl pyridinium färgämnen. Slutligen visade det sig att färgämnet inte interfererar med mekanisk känslighet, vilket indikerar att det inte blockera mechanotransduction kanalerna. Resultaten av enkla stimulerings och analysprotokoll illustreras.
Här har vi utvecklat en relativt enkel beredning som snabbt kan dissekeras, har låg hårsäcken densitet och tillåter relativt selektiv mekanisk stimulering av ett litet antal hårsäckar. Det är lätt åtkomlig för elektrofysiologiska inspelning och live-cell fluorescerande imaging, inklusive svaren att färga ansökan för att visualisera mekaniskt stimulerade hårsäckarna, dvs avbildnings folliklar med definierade elektrofysiologiska svar. Även om vi inte har gjort det, verkar detta system också lätt mottagliga för under dividera sensoriska nerver för enhet (enda sensoriska axon) inspelning och användning av riktade GFP-uttryck för att visualisera sensorisk terminal slutar morfologi.
Vi har använt framställningen öronhuden för att undersöka egenskaperna hos den internalisering och frisättning av de fluorescerande membran styrylfärgämnen pridinium färgämnen 7, en teknik som ursprungligen utvecklades för att studera lokaliserad Vesicle membran återvinning i synaptiska terminaler 8. I synapser är avbildning också lätt kombineras med samtidig elektrofysiologiska inspelning av svaren i identifierade terminaler 8,9. Det var i dessa tidiga studier som vi först noterade färgämnena också internaliseras av mechanosensory ändelser 10. För sensoriska neuroner i kultur och i cochlea hårceller, en stor del av märkningen av styryl pyridinium färgämnen tycks involvera färgämnen som passerar genom mechanosensory kanaler, som de sedan blockerar 11,12. Färgämnena märka då intracellulära membran, och märkningen är oåterkallelig. Men i hårceller som inte mekaniskt stimuleras 13,14 och i fullt differentierade primära sensoriska nervändar in situ, såsom Ia ändar i muskelspolar 15, och i lansettlika ändelser här 7, styryl färg märkning tycks återspegla membran endocytos, eftersom märkningen är reversibel och inte blockera mechanosensory responses 7,15,16. Medan vissa färginterna genom kanalträngning i dessa ändelser inte kan uteslutas helt, framgår det av den fortsatta bränning under färgämne inkubation och reversibilitet av märkningen att den stora majoriteten av märkning differentierade terminaler in situ är att internalisering med återvinning vesikler membran. Således är denna enkla teknik lätt användas för kombinerad el- och optik övervakning av en rad mechanosensory terminalfunktioner i ex vivo vävnader.
Som med de flesta praktiska tekniker kommer reproducerbarhet kräver upprepning och praktik. Några av de viktigaste punkterna värda särskild uppmärksamhet kommer nu att beskrivas. Under hela dissekering och inspelningssession maximera vävnadens viabilitet och överlevnad genom att säkerställa framställningen ständigt perfusion med saltlösning fullständigt mättad med 95% O2 / 5% CO2. Se till att håret folliklar är inte förskjuts under denna process, WHich kommer att stimulera sensoriska slut bränning. Antingen använda ett kontinuerligt, laminärt flöde perfusion system eller försiktigt bubbla gas genom organbadet med fina rör på avstånd från beredningen, eller noggrant uppdatera lösningar varje 20-30 min, varvid preparatet under saltytan vid alla tillfällen. Sug inspelning elektroder görs genom att modifiera skarpa elektrod borosilikat pipetter som normalt används för intracellulära inspelning. Först försiktigt bryta vassa spetsar med # 3 pincett för att ge en lämplig inre diameter för att passa de nerver och brand polera av mycket kort (<1 sek) exponering för bunsenbrännare låga (se 2.4 och 2.5). För att få en bra signal-brusförhållande vid inspelning, är det viktigt att den elektriska impedansen (motstånd) i dessa två elektroder är både maximerad och lika. Gör detta genom att uppmärksamma följande i de två elektroderna. För inspelningen elektroden, säkerställa den inre diametern är en perfekt passform för nerven, och den maximala längden av nerve dras in i inspelningen elektroden. Försök att använda bindväv som omger nerven för att effektivt täta elektrodspetsen. Alternativt, eller dessutom, dra den smala änden av en lämplig storlek, avsmalnande stycke av fettvävnad i vid sidan av nerven. Anslut sedan elektrodspetsen genom att applicera starkt sug efter ~ 1 min med en 50 ml spruta fäst till slangen. För en väl tillsluten spets kommer att tillämpa starkt sug helt enkelt stärka effektiviteten i kontakten och kommer inte att dra in mer vätska eller nerv. För att undvika nervskador, dock se till att bindväven är dämpa nerven från kompression på det omgivande materialet och EAM brosk. Den indifferenta elektroden bör efterlikna den resistans / impedansen hos den registrerande elektroden så nära som möjligt. Detta underlättas genom att noggrant brand polering spetsen till så liten öppning som möjligt utan att täta den. Om det behövs ytterligare motstånd, anslut sedan slutet av neutral elektrod med adipoSE bindväv, såsom beskrivits ovan för den registrerande elektroden.
Den electroceramic ger utsökt kontroll över mekanisk förflyttning, både rumsligt och tidsmässigt. Men ta hand gör elektriska anslutningar – höga temperaturer förstöra dem, så att inte använda varmt lod. Använd metallbelastade epoxilim, eller använda en specialist skjutpassning uttag som rekommenderas av leverantören. Detta kommer både att hålla den stadigt och etablera elektrisk anslutning. Fäst glas stimulerande sonden till electroceramic med standard epoxiharts. Brand polska slutet av en standard 10 cm x 1,5 mm borosilikat diameter glas kapillärrör som används för att göra plåster eller vassa elektroder för elektrofysiologiska inspelning för att minimera risken för vävnadsskador. Om enstaka hårsäcken stimulering krävs för att brand polera spetsen passa en enda hår och placera sonden med ett enda hårstrå inuti öppen bländare. Detta ger utsökt kontroll över ett enda hårstrå. För styryl dye märkning, är det i allmänhet mer enhetlig i vävnader från yngre djur. Det är inte helt klart varför, men detta återspeglar sannolikt mindre mekanisk trauma och effektivare djup vävnad avlägsnande från de yngre vävnader. Var noggrann i att ta bort skummigt skikt som liknar expanderad polystyren som ligger över hårsäcken baser. Men undvika att vara alltför kraftig, eftersom det riskerar att ta bort nervplexus skiktet och tillhörande lansettlika terminaler. Om det finns lite eller ingen elektrisk svar på hårsäcken rörelse, och styryl färgämnet ansökan leder till övervägande märkning av talgkörtlar (gul / vit), med tydlig autofluorescens av basen av hårstrået snarare än lansettlika ändelser (orange / gul), överentusiastiska clearance har skadat underliggande vävnader. Slutligen, med användning av ett färgämnes kelatmedel innan avbildning förbättrar avsevärt bildkontrasten och kvaliteten hos de slutliga bilderna.
Denna teknik skulle kunna vara användbar i ett område av ytterligare studier. dessa could innefattar exempelvis, screening med avseende på mechanosensory kanal (er) som ansvarar för stretch-evoked potential, genom att inkubera preparatet med farmakologiska ligander selektiva för kandidatkanaler eller screening mus linjer med sådana kanaler genetiskt borttagna. Den senare kan kombineras med fluorescens bedömning av eventuella förändringar i terminal morfologi på grund av genetisk manipulation i mus linjer, t.ex. med Npy2r bunden GFP uttryck 17. Ett sista exempel kan vara att undersöka rollen av synaptiska liknande vesiklar (SLVS) 7 i dessa lansettlika terminaler genom att undersöka effekten av modulatorer för SLV omsättning (Ca, Mg, latrotoxin, glutamat-receptorligander) på stretch-framkallade svar och styryl färgupptagning /släpp. Således, öppnar denna nya teknik upp en rad potentiellt intressanta möjligheter till forskning inom mechansensory neurovetenskap.
The authors have nothing to disclose.
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |