Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı

doi: 10.3791/53854 Published: May 7, 2016

Abstract

Bir roman diseksiyon ve kayıt tekniği fare kulak kepçesi kılların mekanik değiştirmesi ile uyarılmış izleme afferent ateş tarif edilmiştir. teknik çok maliyetli ve kolay yaygın çoğu elektrofizyoloji laboratuvarlarında bulunan, ya da kolayca satın alınan malzemeler ile üstlenilen olduğunu. Diseksiyon tescilli yazılım tarafından kontrol edilen bir jenerik elektroseramik gofret tarafından sağlanan mekanik deplasman, kolay ve hızlı. Aynı yazılım aynı zamanda kayıt ve elektronörogram çıkışını analiz eder. uyarılmış sinir aktivitesinin kayıt yangın cilalı standart cam Mikroelektronlar bağlı ticari bir diferansiyel amplifikatör geçer. Yararlı ipuçları hazırlanması, stimülasyon ve kayıt kalitesini optimize etmek için kayıt koşullarına kalitesini artırmak için verilmiştir. Sistem yanı sıra, saç foliküllerinin çit sonlar hançer terminallerinin elektrofizyolojik ve optik özelliklerini tahlil için uygundurfarmakolojik ve / veya genetik manipülasyon gelen sonuçları. bir stiril piridinyum hayati boya ile mekanik stimülasyonu ve etiketleme ile elektrik kayıt birleştirerek bir örneği verilir.

Introduction

duyusal akson hançer terminalleri memelilerde saç köklerinin saç şaft epiteli etrafında palisades oluştururlar innerve. Onların amacı, çevreleyen kılların mekanik deplasman tespit etmektir. Onlar hızlı ve yavaş ağırlıklı saç hareketine karşılık olarak faaliyet öbekler üreten sonlar adapte bir karışımdır. hareket bile devam deplasman varlığında, durduğunda Etkinlik çok hızlı bir şekilde sona erer. Burada yapının karşılıklı çalışmalar için bu fare kulak kepçesi modelinin geliştirilmesi tarif ve mızrak terminallerinde işlev görür. kepçesi, bu uçlarının çalışmak için birçok avantajlı özelliğe sahiptir. Birincisi, kulak kepçesi folikülleri ve terminaller erişime engel arasındaki derinin esasen iki kat az diğer doku ile, back-to-back apposed olduğunu. Cilt nedeniyle sert bağ dokusu minimal miktarda çok ince ve kolay disseke. innervasyon kolayca erişilebilir ve tanımlanabilir. saç follicl ikenes nispeten seyrek mekanik köklerinin tek tek veya küçük gruplar uyarılmasını kolaylaştırmak, dağıtılır, mevcuttur. İnce yatan dermal tabaka farmakolojik ilaçlar ve boyalar ile sinir terminallerine iyi erişilebilirlik verir. Bu floresan mikroskobu kullanarak görüntüleme çalışmaları için onları özellikle idealdir. görüntüleme ya yaşayan terminallerde veya sabitleme ve ileri histolojik işlenmesinden sonra olabilir.

Mechanosensory nöronların yanıtları saç köklerinin geleneksel izole cilt hazırlıkları 3,4, bir dereceye kadar, 1,2 burun kılı kemirgen çalışılmıştır edilmiş ve innerve. Bu saç şaft çevreleyen sinir uçlarında mechanosensory fizyolojisinin genel prensipleri hakkında bize çok öğretti. vibrissal hazırlık Tek bir saç folikülünün hareketi üzerinde nefis kontrol sağlar. Ancak, vibrissal olarak, onun karmaşıklığı nedeniyle çıkış deşifre etmek zor olabilirfolikülleri anatomik farklı mechanosensory biten 5 en az 8 farklı türlerini içeren ve belirli elektrofizyolojik yanıtları bu morfolojik tip eşleştirme hala anlaşmazlık konusudur. Fare deri / safen sinir hazırlığı en sık ağrı ve dokunma yanıtları araştırmak için kendi depilated halde kullanılır. Böyle bir hazırlık saç köklerinin innervasyon daha az karmaşık ama saç köklerinin yoğunluğu, artı yakın 6 üç farklı folikül türleri (bekçi, Awl / auchene ve zikzak kıllar) varlığı, belirli yanıtları okuyan demektir tek bir folikül veya biten tek tip tekrar meydan okuyor. Ayrıca, bu hazırlık kompleks diseksiyon içerir. Son olarak, vibrissal ve diğer cilt preparatlar hem de, preparasyonlar hayatta ex vivo da dahil uçlarının zaman güç olmaktadır. Bu durumda, dokunun kesit GFP-ifade fare hatları da gereklidir. Alternatif, böyle Immünofloresan için fiksasyon ve / veya antikor inkübasyon gibi diğer immünolojik / histolojik işlem gerektirir.

Bu nedenle kulak kepçesi hazırlık geliştirdi ve saç folikülü afferentleri sınırlı bir nüfus elektrik kayıtları yapmak için kullanılan ve membran bisiklet stiril piridinyum boyaların alımını kanıtladığı bu hançer sonlar, meydana göstermektedir var. Son olarak, boya bu mechanotransduction kanallarını bloke etmediğini gösterir mekanik duyarlılık ile birlikte etki etmediğini göstermektedir. Basit uyarıcı ve analiz protokollerinin sonuçları gösterilmiştir.

Protocol

Fare Otopsi doku hasat etik yöntemler onaylanmış kullanmanız gerekir. İngiltere'de, servikal dislokasyon yetişkin farelerin (UK Hayvanlarda bir listede Çizelge 1 yönteme (Bilimsel Prosedürler) Yasası, 1986 ve Avrupa Direktifi 2010/63 / EU) için bir devlet onaylı bir yöntemdir. Bu mevzuat gözden geçirilmiş ve aşağıdaki protokole kullanılan tüm prosedürleri onaylı Hayvan Refahı ve Etik Değerlendirme Kurulu tarafından Aberdeen Üniversitesi'nde yerel uygulanır.

Not: Bu yöntemler Bankalar ve ark bildirilen araştırma kullanılmıştır 7.

Elektrofizyoloji 1. hazırlanması Kulaklar

  1. Diseksiyon önce, bu tür Liley (1956) gibi standart bir serum fizyolojik, hazırlamak ve% 90 O 2 /% 5 CO 2 ile doyurabilecek. NaHCOs 3 (12), KCI (4), KH 2 PO 4 (1), NaCI (138.8), MgCI2 (1), CaCl2 (2) ve glükoz: Liley en tuz (mM) oluşur(11).
  2. Insanca kulaklara yakın kafatası zarar vermeden bir yetişkin fare euthanize. Burada C57 / Bl6J ve MF1 fareleri kullanabilir ancak herhangi bir standart laboratuvar fare suşu kullanılabilir. İdeal olarak, elektriksel kayıt büyük farelerde markalama daha az güvenilir olarak, stiril boya etiketi ile kombine edilecek ise, <25 g olan fareler kullanmak genellikle sadece sınırlı sınırlı alanlarda bulunan edilir.
  3. büyük makas veya kemik makası ile baş kaldırmak.
  4. Stereo diseksiyon mikroskobu aşamasında (50 cm genellikle uygun) geniş tabanlı diseksiyon çanak gaz verilerek Liley en baş dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Düzenli (~ 10 dk) savak veya gazlı tuz ile baş daldırın.
  5. Dikkatle kesilirken ve dış kulak yolu (EAM) ve kıkırdak açığa springbow makas ve 3. forseps ile dış kulak (kulak kepçesi) tabanındaki cilt ayırmak. onlar f ortaya çıktıkça trigeminal dalları (mandibuler bölünme, MDV) ve büyük auricular sinirleri tespitrom kıkırdak tabanı üzerinden mandibular eklem ve projenin aralıktaki kafatası sırasıyla içbükey (ön) ve dışbükey (posterior) kulak kepçesi cilt yönlerini innerve.
  6. Kafatası civarında tespit nerede çene ve mastoid arasındaki oluk iki sinir dalları çıkın. yavaşça kafatası telek çekerek onların uzunluğunu en üst düzeye çıkarmak ve mümkün olduğunca kafatası kadar yakın sinirler kesilir.
  7. bölünmüş sinirlerin distal kütükleri önlemek için özen ve kaldırılır kulağın dibinde yoğun pelage miktarını en aza indirerek, springbow makas ile baş telek çıkarın.
  8. esnek bir silikon kauçuk (PDMS) Gassed Liley en sıvıyla doldurulmuş -lined çanak için telek aktarın. en dar (ön-çoğu) noktasında bölünerek ADM'yi açın. dikkatle ~ 6-8 düzenli aralıklı çok ince (~ 0.2 mm çap) böcek iğneli kenarlarında telek, ön deri (içbükey) PDMS aşağı tarafı ve pin dümdüz.
  9. remTamamen kepçesi arka yönü derisini ove ve kısmen ön cilt değişmeden kalır sağlanması, 3. forseps ile künt diseksiyon ile pinna kıkırdak kaldırın.
  10. ince böcek pin noktası ile nazikçe cilt ve EAM kıkırdaklar arasında posterior ortaya MDV dallarını (genellikle 2) uzatmak, 3. forseps ile kavradı. onların kesilmiş uçlara değil sinir gövdeleri kendilerini bitişik bağ dokusu impaling, en iyi olası böcek iğneli PDMS bu pin.
  11. dikkatlice çekerek aşırı veya kesme zarar kaçınarak, çevrelerindeki çevreleyen bağ dokusu en kaldırın.

2. Elektrofizyolojik Kayıt Kurma

  1. için (kayıt için tek - iki emme elektrotların yakın kulağın dibinde temizlenmiş sinirleri yerleştirerek, (~ kulağa başına 6-8) kenarlarda ince böcek iğneli bir kayıt odasının PDMS kaplı tabanına kulak kepçesi cildi pin sinir) ve ot almakOnun etkisiz bir elektrot (bir diferansiyel yükseltecin nötr bir sinyal sağlamak için, 7).
  2. kayıt elektrot için, dikkatli bir şekilde açıklık ve iki sinir kombine kalınlığının açılma iç çapına uygun, yani mümkün olduğu ve mümkün olduğu kadar büyük bir uzunluğu olduğu gibi bir şekilde oturması.
  3. silikon kauçuk borudan diğer ucuna bağlı bir 2 ml şırınga yumuşak emilerek elektrot içine sinirler çizin. sinirler, düz değil katlanmış veya iki katına olduğundan emin olun.
  4. sıkıca sinir etrafındaki diyafram kapatan bir fiş oluşturmak için bağ dokusu veya yağ dokusu çizmek için güçlü emme kullanarak yüksek elektrik direnci / empedans uyum geliştirin.
  5. (Bu kılcal hareket ile dolabilir) gerekirse emme ile tuzlu su ile diğer (kayıtsız) elektrodu doldurun.
  6. tuzlu ve sinir irtibata kayıt elektrotları iç delik içine özdeş kayıt teller (gümüş veya platin) yerleştirin(Kayıt) ya da elektrot daralmış, yangın cilalı ucu (kayıtsız). Her elektrot iki çekirdekli ekranlı kablo farklı çekirdeklere ayrı lehimlenmiştir. banyoya banyo (toprak) elektrodu (Ag / AgCl topak) yerleştirin ve kayıt elektrotları bağlanmış iki çekirdek kablo ekrana topraklayın.
  7. Bir osiloskop ekranında bir diferansiyel amplifikatör, filtre (bant-geçti 0,2-2 kHz), ve bakış ayrı kanallar içine iki elektrot elektrik aktiviteyi besleyin. Bu kanal A (kayıt) kontrol edin ve kanal B (kayıtsız) Elektrik gürültü seviyeleri benzer. aşamada iki elektrot dengeli önce kanal A normal spontan aksiyon potansiyelleri görmek mümkün olmayabilir.
  8. kayıt (kanal A) veya kayıtsız (kanal B) elektrotların empedansını artırarak elektrotlar arasında arka plan gürültüsü herhangi bir farklılık giderilecek. Her iki elektrodun içine daha fazla areolar (adipoz) bağ dokusu emerek bunu yapın, ve /ya da 50 ml şırınga ile ilgili daha fazla emme kuvveti uygular.
    1. Bu şekilde 'dengeli' bir kez (AB) kayıt diferansiyel ve kulak kepçesi kenarda tüyleri okşayarak spontan eylem izleme potansiyelleri (AP) veya aramak için geri dönün. genellikle sıkı (yüksek direnç) mühür ve iki daha eşit empedans - herhangi bir aktivite (spiking) görülürse, kayıt elektrot sinirin sıkı bir uyum ve kayıtsız elektrot areolar bağ dokusu yeniden kontrol elektrotlar, o kadar iyi. Sinyal: gürültü oranı: Uygulama ile, bu iyi bir kalite (1> 2) başaracaktır.
  9. Bir bilgisayar üzerinde çalışan bir laboratuar arayüzü ve elektrofizyoloji yazılımı ile elektronörogram kaydedin. çivilenmesi bir ses çıkışı çok yararlıdır ve bir ses amplifikatörü ve ilişkili ses hoparlörden neurogram beslenmesiyle elde edilebilir. Sadece beyaz n yokluğu ile belirlenen başlangıç ​​gürültüsü (yukarıda olduğu eşik ayarlamaoise) 'tıs'.
  10. Dermis ve folikül tabanını açığa ~ 5 mm x 5 mm bir pencere açarak, dikkatli, ilaç veya mızrak şeklinde sonları floresan stiril boya erişimi artırmak pinna marjı yakın alt dermal yağ tabakasını soymaya için (Şekil 1A, B ).
  11. (Varsa, sadece üretilen pencere düzeyinde) apposed cilt katmanları arasında net bir tuzlu dolu boşluk bırakarak, lider marjı adipoz-temizlenmiş kulak cilt ~ 1 mm kat geri pin. Yavaşça inme cilt dokunmadan, bir pim ya da topraklı ince forseps ile katlanmış kenarı boyunca çıkıntılı kıllar, ses çıkışı osiloskop ve ayırt edici maksimal AP çıktı alanı 'tıklama' ve 'pops' bulmak için.

3. Kayıt Stimulus uyarılmış Eylem Potansiyelleri

  1. mekanik uyarım probu yerleştirin - Bir Cerami bağlı bir yangın cilalı 10 cm borosilikat cam mikroelektrotc piezo-elektrik aktüatör - yani hareket cilt kat ile paraleldir. bu tüyler değil cilt dokunur, böylece kat bir uca deriden yaklaşık 0.5-1 mm yerleştirin. yavaş yavaş tüyleri saptırmak ve gözlemlemek / spiking dinlemek için el prob ucunu hareket ettirerek etkili stimülasyon doğrulayın.
  2. (Deplasman 200-500 mikron kontrol edin., 5 Hz sinüzoidlerde her 10 saniye gibi 3 sn) 1-3 kılların mekanik uyarılması sürücü yazılımı kullanın ve sinirlerdeki stimülasyon uyarılmış yanıtları kaydedin.
  3. 10 sn aralıklarla birkaç özdeş mekanik uyarım trenler verin. Daha sonra deney protokolü (10 sn 30 sn örn damla tekrar oranı) göre uyarım sıklığını azaltmak, tekrarlanabilirlik için prob pozisyonu optimize edin.
  4. Yüksek frekanslı gürültü genlik ve en büyük AP ~% 25 2x ~ ayarlanmış basit bir eşik kullanarak AP-benzeri aktivite örneğin ayırımcılık yazılımı kullanın.
  5. eşik olarak geçiş AP sayınüretilen AP sıklığını ve özelliklerini miktarının 'olayları',.

N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) piridinyum dibromür Etiketleme ile birlikte 4. Kayıt Stimulus uyarılmış Ateşleme

  1. uyaran-uyarılmış afferent ateş ve terminal etiketleme üzerinde stiril boyaların etkisini incelemek için, deniz çözeltisine, seçtiğiniz bir stiril boya uygun konsantrasyonunu ekleyebilir ve elektrik kayıt ile devam ediyor.
  2. Gerekli maruz kalma süresi (genellikle en az 30 dakika) sonra, folikülleri görüntülemek için hazırlık hazırlar. Tespit işaretçilerine kaldırarak cilt kapağını açın ve terminal etiketleme ortaya çıkarmak için temizlenmiş dermal alanını maruz kalmaktadır.
  3. salin 3 tam değişiklik yapma, boya içermeyen tuzlu su ile dış boya silsin.
  4. En kalıcı boya kontaminasyon maruz / dış membranlar süzülmeye imkan vermek üzere 10-15 dakika süreyle gaz verilerek boya içermeyen tuzlu son değişiklik kuluçkaya yatmaktadır.
  5. Bir kenetleme maddesi (sulfobutylated beta-siklodekstrin, 1 mM, 5 dakika) tuzlu su içinde olan membranlar üzerinde kalan olmayan içsel boya çıkarın.
  6. dik bir Epifloresans mikroskop aşamasında kayıt odasına transfer ve sahne / slayt hareket mekanizması ile odasına girerler.
  7. stiril boya için uyarma ışık uygun olan hazırlık aydınlatır. Folikül etiketleme (Şekil 1) gözlemlemek için bir 10X veya 25X floresan mikroskop objektif kullanın.

Representative Results

Subküten adipoz doku saç köklerinin açığa çıkarılmış elektrofizyolojik kayıt düzeneği, Şekil 1A'da gösterilmiştir. Bu açıklık, bir kısmı Şekil 1B aydınlık aydınlatma daha yüksek bir büyütmede gösterilmiştir. Bu alanda yukarı ve kendi üzerinde geri pinna marjı Katlanır epidermal yüzeyini ortaya çıkarır. Bu Şekil 1C boya maruz kalma ve yeniden açılmış pozisyona marjı döndükten sonra, folikülleri harekete gösteren bir künt prob (gösterilmemiştir). Mekanik stimülasyonu için ideal bir durum, yatay çıkıntı kat kenarında tüyleri konumlandırır Bu pozisyonda bir stiril piridinyum boya ile etiketlenmiştir. Müstahzarlarından Electroneurograms tipik haliyle daha büyük boyutta AP içeren cam elyaf prob uygulanan hareketin, yokluğunda (Şekil 2A'da eden AP aktivitesi gösteren (Şekil 2BI-iii)). Yanıtlar kilitli hangi dalga faz hareketinde hangi noktada, yani kendi konumu üzerine titreşimli prob kişileri saç bağlı olmasına rağmen, oldukça tekrarlanabilir. Basit bir eşik saptama (A neurogram izleri geçen yatay çizgi (I-III)) bu analiz için kullanılmıştır. Bununla birlikte, kayıt yazılımı işlevleri çoğunlukla daha gelişmiş bir şekilde kullanılabilirçivi boyutu ve şekli özellikleri ayırt edebilir. Bu daha sonra sözde tek ünite kayıt analizi yapılmalıdır izin vermek için bu özelliklere göre belirli Afferent liflerin yanıtları izole edebilir.

Şekil 1
Şekil 1:. Elektrofizyolojik Kayıt Düzenleme ve N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) Saç Folikül Afferent hançer uçlarının Piridinyum dibromür Etiketleme (A) A kulak kepçesi hazırlık telek gösteren bir elektrofizyolojik deney için kurulmuş oryantasyon, sinirlerin yeri, kayıt elektrotları ve adipoz doku çıkarıldıktan sonra folikül innervasyon maruz alanı. (B) Çeşitli saç köklerinin dermis aşağı örten yağ dokularının temizlenmiş alanda parlak bir alan aydınlatma görebilir. Karanlık, genellikle bilobe, şekiller yağ bezleri vardır. ( 7'den, izni ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Fare Pinna dan Kaydedilen (A) Uyarıcı-uyarılmış Etkinlik. Standart Liley en tuzlu su çözeltisi içinde memelerine harici olarak sürekli neurograms gelen aktivite, 3 ayrı deneyden alınmıştır (AI-III) örnekleri arasında. Her kayıt bir 5 saniye bölüm olarak sinüzoidal yerinden bir 3 saniye süresi dahil kayıt başladıktan sonra yaklaşık 5 dakika, gösterirsaç milleri alışveriş merkezi sayısı. mekanik stimülasyonu genellikle 1-2 saat süren kesintisiz kayıt boyunca her 30 sn tekrarlandı. Özel komut dosyaları yatay imleç (sivri) tarafından belirlenen bir eşik yanı sıra her sinüzoidal döngüsü (dönem) başlangıcını geçti bireysel olayları işaretlenmiş. (AIV) sinüzoidal deplasman için komut sinyali. (B) Analiz spike aktivitesini Stimulus uyarılmış. 3 ° kutularına (Bi-iii) Çevrim histogramlar cam prob ile saç milleri 5 Hz sinüzoidal deplasman mekanik uyarım tahmin hançer sonları tepkilerini gösteren, (Ai-iii) sırasıyla neurogram örneklerinden inşa edilmiştir. Mekanik sonda başlangıç ​​pozisyonuna kendi konumunda bağlı olarak döngüsünün farklı aşamalarında, işaretlenmiş faz kilitleme edin. (BIV) Normalize sonda yer değiştirme sinusoid; gerçek genlik yaklaşık 100 idi1;. M bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Burada, hızlı bir şekilde çıkarılmasına olanak nispeten basit bir hazırlama geliştirdik düşük saç folikülü bir yoğunluğa sahiptir ve saç köklerinin az sayıda görece seçici bir mekanik uyarıya sağlar. Bu mekanik olarak uyarıldığında saç folikülleri, tanımlanmış elektrofizyolojik yanıtları yani görüntüleme folikülleri görselleştirmek için uygulamayı boya verilen yanıtlar da dahil elektrofizyolojik kayıt ve canlı hücre floresan görüntüleme için kolayca erişilebilir. Biz yapmadıysanız olsa da, bu sistem aynı zamanda tek bir birim (tek duyusal akson) kayıt için duyusal sinir alt-bölünmesi ve duyusal terminali biten morfoloji görselleştirmek için hedeflenen GFP-ifadesini kullanarak kolayca müsait görünüyor.

Biz içselleştirme ve floresan membran stiril Pridinyum boyaların 7 sürümü özelliklerini araştırmak için kulak cilt hazırlığı kullanmış, bir teknik aslında lokalize Vesic incelemek için geliştirilensinaptik terminallerde 8 le membran geri dönüşüm. Sinapslarda, görüntüleme da kolaylıkla tespit terminali 8,9 yanıtların aynı anda elektrofizyolojik kayıt ile birleştirilir. Biz ilk boyalar da mechanosensory sonlar 10 tarafından içselleştirilmiş edildi kaydetti bu ilk çalışmalarda oldu. Kültürde ve koklea saç hücreleri duyusal nöronlar için, stiril piridinyum boyalarla etiketleme çok onlar sonra 11,12 blok mechanosensory kanalları, geçen boyalar dahil görünüyor. boyalar daha sonra hücre içi membranlar etiket ve bu etiketleme geri döndürülemez. Ancak saç hücreleri mekanik 13,14 uyarılmış olmadığını ve tamamen farklılaşmış birincil duyu siniri kas iğ 15 la sonlara olarak yerinde terminalleri, ve burada 7 hançer sonlara içinde stiril boya etiketleme membran endositoz yansıtacak gibi görünüyor etiketleme geri dönüşümlüdür ve mechanosensory res bloke olmadığından7,15,16 ponses. Bu sonlar kanal nüfuz bazı boya içselleştirilmesi tamamen göz ardı edilemez iken, in situ farklılaşmış terminallerde etiketleme büyük çoğunluğu geri dönüşüm vezikül ile içselleştirme tarafından olduğu boya inkübasyon sırasında devam eden ateş ve etiketleme tersine çevrilme açıktır zar. Bu nedenle, bu basit bir teknik hali hazırda ex vivo doku mechanosensory terminal fonksiyonları bir dizi kombine elektrikli ve optik izleme için kullanılır.

En pratik tekniklerle olduğu gibi, tekrarlanabilirlik tekrarı ve pratik gerektirir. Bazı önemli noktalar değer özellikle dikkat tarif edilecektir. Diseksiyon ve kayıt oturum boyunca, hazırlık sürekli tam% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile doymuş tuz ile perfüze sağlayarak doku canlılığını ve hayatta kalma en üst düzeye çıkarmak. WH folikülleri Bu işlem sırasında yerinden değil saç sağlamakich duyusal bitiş ateş teşvik edecektir. Her iki preparasyon bir mesafede ince boru organ banyosu boyunca bir sürekli, laminer akış perfüzyon sistemine veya dikkatli bir balon gaz kullanmak ya da dikkatli bir şekilde her zaman tuzlu su yüzeyinin altında hazırlanması tutulması, çözelti 20-30 dk yenileyin. Emme kayıt elektrotları normal hücre içi kayıt için kullanılan keskin elektrot borosilikat pipetler değiştirerek yapılır. İlk olarak, dikkatli bir Bunsen beki alev çok kısa (<1 sn) maruz kalma sinirler ve yangın lehçe sığdırmak için uygun iç çapını vermek için # 3 forseps keskin ipuçları kesiyorum (2.4 ve 2.5 bakınız). kayıt iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, bu iki elektrot elektrik empedansı (direnç) maksimum ve eşit her iki esastır. iki elektrot aşağıdaki dikkat ederek bunu yapın. kayıt elektrot için, iç çapı sinirde rahat bir uyum ve KD maksimum uzunluğu sağlamakrve kayıt elektrotu içine çekilir. etkin bir elektrot ucu mühür sinir çevreleyen bağ dokusu kullanmayı deneyin. Alternatif olarak veya ek olarak, sinir birlikte adipoz doku uygun boyutlu bir konik parçanın dar ucuna çeker. Daha sonra, boru bağlanmış bir 50 ml şırınga ile yaklaşık 1 dakika boyunca güçlü bir emme uygulanarak elektrot ucunu takın. iyi mühürlü ucu, güçlü emme uygulayarak basitçe fiş etkinliğini güçlendirecek ve daha sıvı veya sinir çekmek olmaz. sinir hasarı önlemek için, ancak, bağ dokusu çevreleyen malzeme ve EAM kıkırdak üzerinde sıkıştırma sinir yastıklama emin olun. kayıtsız elektrot mümkün olduğunca yakın kayıt elektrot direnci / empedansı taklit etmelidir. Bu dikkatle yangın parlatma aslında sızdırmazlık olmadan mümkün olduğunca küçük bir diyafram ucu ile katkıda bulunuyor. Daha fazla direnç gerekiyorsa, o zaman adipo ile kayıtsız elektrot ucunuSE bağ dokusu, kayıt elektrot için yukarıda anlatıldığı gibi.

elektroseramik hem mekansal ve zamansal olarak, mekanik deplasman üzerinde nefis kontrol sağlar. yüksek sıcaklık onları yok, çok sıcak lehim kullanmayın - Bununla birlikte, elektrik bağlantı yapmadan özen gösterin. metal yüklü epoksi yapıştırıcı kullanın veya tedarikçi tarafından tavsiye edilen bir uzman itme-fit soketi kullanın. Bu ikisi de sıkıca tutun ve elektrik bağlantı kuracak. Standart epoksi reçine ile elektroseramik cam uyarıcı prob takın. Yangın lehçe standart 10 cm uç doku hasarı riskini en aza indirmek için elektrofizyolojik kayıt için yama veya keskin elektrotları yapımında kullanılan 1,5 mm çaplı borosilikat cam kılcal boru x. tek saç folikülünün uyarılması gerekiyorsa, yangın lehçe ucu tek bir saç sığacak ve açık diyafram içinde tek saçlı prob konumuna getirin. Bu, tek bir saç üzerinde nefis kontrol sağlar. stiril dy İçine etiketleme, bu daha küçük olan hayvanlardan elde edilen dokularda genellikle daha düzgündür. Bu neden tam olarak belli değil, ama bu büyük olasılıkla genç dokulardan daha az mekanik travma ve daha etkin derin doku çıkarılmasını yansıtır. saç folikülü üsleri örten köpüklü tabaka benzeyen genişletilmiş polistiren giderilmesinde eksiksiz olması. Bu sinir pleksus tabakası ve ilgili hançer terminalleri çıkarmadan riskleri Ancak, çok dinç önlemek. az veya hiç elektrik saç folikülü hareketi tepki ve stiril boya uygulaması varsa, (turuncu / sarı) yerine hançer sonlar daha kıl şaftının tabanının farklı otofloresans ile (sarı / beyaz) yağ bezlerinin baskın etiketleme yol açar aşırı hevesli boşluk altındaki dokuları zarar verdi. Son olarak, görüntüleme önce bir boya kenetleme ajanı kullanılarak büyük ölçüde nihai görüntü görüntü kontrastım ve kalitesini arttırır.

Bu teknik bundan başka çalışmalarda, bir dizi yararlı olabilir. Bu koULD aday kanalları için seçici farmakolojik ligandlarla preparatını inkübe ya da genetik olarak silinmiş bu tür kanallar fare hatları tarama ile, germe uyarılmış tepkilerden sorumludur mechanosensory kanal (lar) için tarama, örneğin, yer alır. Ikincisi, Npy2r bağlı GFP 17, örneğin fare hatları, genetik manipülasyon terminal morfolojisinde herhangi bir değişiklik floresan değerlendirilmesi ile birleştirilebilir. Son bir örnek, SLV ciro modülatörlerinin etkisi incelenerek bu mızrak şeklinde terminallere sinaptik benzer kesecikler rolü (SLV) 7 araştıran olabilir (Ca, Mg, latrotoxin, glutamat reseptör ligandlar) esnetilebilir-uyarılmış tepkiler ve stiril boya alımı üzerindeki / release. Böylece, bu yeni tekniğin mechansensory nörobilim araştırma potansiyel olarak ilginç caddeleri bir dizi açılır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS - Sylgard 184 Dow Corning Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps Fine Science Tools 11231-20
Austerlitz Insect pins Fine Science Tools 26002-10 Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier Digitimer Neurolog NL104A Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. 
High/Low-pass Filter Digitimer Neurolog NL125 Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger Digitimer Neurolog NL201 Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. 
Audio Amplifier & speakers Digitimer Neurolog NL120S Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope 
Oscilloscope Digitimer PM3380A We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer Morgan Electroceramics, Southampton UK PZT507 Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply Home made 0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software Cambridge Electronic Design (CED) Spike2 v7 Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface Cambridge Electronic Design (CED) 1401 micro Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4 Biotium/Cambridge Bioscience BT70020 Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7 Biotium/Cambridge Bioscience BT70029 A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394 Qimaging Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software Perkin Elmer Volocity 6.3 Image capture and analysis software.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14, (4), 300-309 (2009).
  2. Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
  3. Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407, (6807), 1007-1011 (2000).
  4. Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516, (7529), 121-125 (2014).
  5. Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449, (2), 103-119 (2002).
  6. Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
  7. Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591, (10), 2523-2540 (2013).
  8. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, (5041), 200-203 (1992).
  9. Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
  11. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
  12. Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (1), 1 (2007).
  13. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  14. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20, (1), 41-50 (2004).
  15. Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562, (2), 381-394 (2005).
  16. Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21, (PC22), (2010).
  17. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, (7), 1615-1627 (2011).
Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).More

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter