Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.
Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties.
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.
Streptomycetes मिट्टी में रहने वाली बैक्टीरिया है कि निष्क्रिय, unigenomic बीजाणुओं 1-3 को एक बहुकोशिकीय, पोषक तत्वों से सफाई फुई से रूपात्मक भेदभाव से जुड़े एक जटिल विकासात्मक चक्र की विशेषता रहे हैं।
अनुकूल विकास शर्तों के तहत, एक ठेठ Streptomyces बीजाणु एक या दो रोगाणु ट्यूब (चित्रा 1) extruding द्वारा उगना शुरू होता है। इन ट्यूबों टिप विस्तार से बढ़ाना और वनस्पति फुई के रूप में जाना एक branched hyphal नेटवर्क में हो जाना। ध्रुवीय विकास और hyphal शाखाओं में आवश्यक प्रोटीन DivIVA द्वारा निर्देशित है। इस coiled-तार प्रोटीन एक बड़ी cytoplasmic परिसर का हिस्सा polarisome, जो विस्तार देने टिप 4-7 पर नए सेल लिफाफा सामग्री की प्रविष्टि के लिए महत्वपूर्ण है कहा जाता है। वनस्पति विकास के दौरान, hyphal तंतु तथाकथित पार दीवारों 8 का निराला गठन से बंटे हो जाते हैं। इन पार दीवारों के गठन को पुनः quires FtsZ, ट्यूबिलिन तरह cytoskeletal प्रोटीन है कि ज्यादातर बैक्टीरिया 9 में कोशिका विभाजन के लिए आवश्यक है। Streptomyces में, हालांकि, इन वनस्पति पार दीवारों कसना और सेल सेल जुदाई के लिए नेतृत्व नहीं है और इसलिए mycelial बड़े पैमाने पर आपस में जुड़े syncytial डिब्बों के एक नेटवर्क के रूप में बनी हुई है। पोषक तत्वों की सीमा और अन्य संकेत है कि अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं के जवाब में, विशेष हवाई hyphae वनस्पति फुई से दूर तोड़ने और हवा 3 में हो जाना। इन संरचनाओं के निर्माण से विकास की प्रजनन चरण है, जो के दौरान लंबे बहु जीनोमिक हवाई hyphae बनने समान रूप से आकार unigenomic prespore डिब्बों के दर्जनों में विभाजित शुरू की। यह बड़े पैमाने पर कोशिका विभाजन घटना एकल sporogenic hyphae 2,10 के भीतर कई FtsZ छल्ले के तुल्यकालिक कसना से प्रेरित है। रूपात्मक भेदभाव निष्क्रिय, मोटी दीवारों, रंजित बीजाणुओं की रिहाई के साथ पूरा हुआ।
टी "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 ">Streptomyces जीवन चक्र के प्रमुख विकासात्मक घटनाओं में अच्छी तरह से 1,3 विशेषता है। लेकिन, क्या अब भी है दुर्लभ सेल जैविक अध्ययन है कि प्रतिदीप्ति समय चूक माइक्रोस्कोपी रोजगार ऐसे प्रोटीन स्थानीयकरण गतिशीलता, गुणसूत्र आंदोलन और विकासात्मक नियंत्रित कोशिका विभाजन के रूप में भेदभाव को मजबूती subcellular प्रक्रियाओं, में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए कर रहे हैं। Streptomyces विकास का लाइव सेल इमेजिंग जीवन चक्र की जटिलता और जीव की शारीरिक विशेषताओं की वजह से चुनौतीपूर्ण हो गया है। वनस्पति विकास पर पिछले अध्ययनों और sporulation दो भागों में विभाजित के प्रारंभिक चरणों ऑक्सीजन पारगम्य इमेजिंग कक्षों, या एक खुर्दबीन मंच पर 11-15 Streptomyces coelicolor की agarose-समर्थित विकास कार्यरत है। इन विधियों, हालांकि, कारकों में से एक नंबर के द्वारा सीमित हैं। कुछ सिस्टम केवल एक सेलुलर विकास की अल्पकालिक इमेजिंग की अनुमतिकोशिकाओं से पहले डी फ्लोरोसेंट प्रोटीन अपर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति से ग्रस्त हैं या hyphal विकास के तीन आयामी पैटर्न के कारण फोकल हवाई जहाज़ से बाहर हो जाना। मामलों में जहां लंबी अवधि इमेजिंग संभव है, agarose पैड सीमा प्रयोगात्मक लचीलापन पर कोशिकाओं की खेती क्योंकि कोशिकाओं वैकल्पिक विकास या तनाव की स्थिति को उजागर नहीं किया जा सकता, और agarose पैड में मध्यम से गंभीर रूप से कमजोर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति फ्लोरोसेंट निगरानी करने की क्षमता की सीमा में संकेत है।
यहाँ हम उत्कृष्ट परिशुद्धता और संवेदनशीलता के साथ पूरा Streptomyces जीवन चक्र के रहते सेल इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन। एक प्रतिदीप्ति widefield माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) से जुड़े एक microfluidic युक्ति में Streptomyces बढ़ रही द्वारा, अब हम करने के लिए 30 घंटे की समय अवधि में अंकुरण, वनस्पति विकास और sporulation दो भागों में विभाजित की निगरानी करने में सक्षम हैं। यह बहुत नया मॉडल जीव Streptomyces के उपयोग से मदद की है </उन्हें> venezuelae क्योंकि यह जलमग्न संस्कृति में पास पूरा करने के लिए और इस तरह sporulates शास्त्रीय मॉडल प्रजातियों एस की सीमा पर काबू coelicolor, जो ठोस मीडिया पर ही 16-20 sporulates। वनस्पति विकास और sporulation कल्पना में मदद करने के लिए, हम सह एक्सप्रेस fluorescently टैग सेल polarity मार्कर DivIVA और चाबी प्रोटीन कोशिका विभाजन FtsZ के संस्करणों।
हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microfluidic युक्ति है कि सफलतापूर्वक माइक्रोबैक्टीरिया, कोलाई, Corynebacterium glutamicum, बेसिलस subtilis और खमीर 21-25 के लिए नियोजित किया गया है का उपयोग कर रहे हैं। प्रणाली एक फोकल हवाई जहाज़ में कोशिकाओं को जाल और विभिन्न जलाशयों से संस्कृति के माध्यम से निरंतर छिड़काव के नियंत्रण की अनुमति देता है। विस्तृत प्रोटोकॉल में हम इस सुविधा का लाभ लेने के एस बेनकाब करने के लिए एक पोषण downshift करने के लिए वनस्पति फुई venezuelae sporulation बढ़ावा देने के लिए।
प्रोटोकॉल deलखा पूरे Streptomyces जीवन चक्र के रहते सेल इमेजिंग के लिए है, लेकिन वैकल्पिक मीडिया की स्थिति या माइक्रोस्कोप सेटिंग्स अगर विशिष्ट विकास के चरणों विशेष रुचि के हैं चुना जा सकता है।
चित्रा 2: योजनाबद्ध चित्रण प्रयोगात्मक कार्य-प्रवाह। तीन मुख्य प्रोटोकॉल में वर्णित चरणों दिखाए जाते हैं। सबसे पहले, बीजाणुओं और खर्च मध्यम एक स्थिर चरण संस्कृति से तैयार किया जाता है। दूसरा, ताजा बीजाणुओं एक microfluidic प्रणाली और एस में लोड कर रहे हैं venezuelae अपने विकास जीवन चक्र एक ऊष्मायन चैम्बर के साथ एक पूरी तरह से स्वचालित औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक इष्टतम विकास तापमान बनाए रखने के लिए भर में imaged है। तीसरा, समय चूक प्राप्त श्रृंखला का विश्लेषण किया और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग कर फिजी कार्रवाई की है।
Streptomyces जीवन चक्र के समय चूक माइक्रोस्कोपी अतीत में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो गया है। यहाँ हम सेल polarity मार्कर DivIVA और कोशिका विभाजन प्रोटीन FtsZ करने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions का उपयोग कर कल्पना और (चित्रा 2) विकास कार्यक्रम के माध्यम से प्रगति का पता लगाने में मदद करने के लिए पूरा जीवन चक्र का जीना सेल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
इस विधि के लिए केंद्रीय एस की खेती है एक microfluidic युक्ति है कि खर्च मध्यम (बिताया एमवाईएम-ते) के साथ लगातार मध्यम छिड़काव और सामान्य मध्यम विकास (एमवाईएम-ते) के आदान-प्रदान की अनुमति देता में venezuelae। संस्कृति हालत बदलने के लिए, क्योंकि संस्कृति के माध्यम से खर्च में किसी भी अभी तक अज्ञात कोशिकी संकेतों के रूप में कुओं (जैसे कोरम संवेदन संकेतों) के रूप में पोषक तत्वों की downshift वर्णित प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है sporulation को बढ़ावा देने, जबकि पोषक तत्वों से भरपूर माध्यम की एक सतत आपूर्ति वनस्पति growt को उत्तेजित करता हैशायद ही कोई बीजाणु गठन के साथ एच (डेटा) नहीं दिखाया। इस प्रकार, इस microfluidic प्रणाली में संवर्धन कोशिकाओं agarose पर संवर्धन कोशिकाओं क्योंकि यह अधिक प्रायोगिक लचीलापन प्रदान करता है और संस्कृति की स्थितियों को बदलने के जवाब में बैक्टीरिया विकास में परिवर्तन की लंबे समय तक निगरानी की अनुमति देता है के लिए बेहतर है। हालांकि microfluidic प्लेटों एकल उपयोग के लिए तैयार कर रहे हैं केवल, चैनलों कि कोशिकाओं बाद के प्रयोगों में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ टीका नहीं किया गया है प्रवाह। हम एक सप्ताह के भीतर एक microfluidic थाली के सभी चैनलों का उपयोग करना चाहिये जैसा कि हम प्लेटें कि अब समय के लिए खोल दिया गया है करने के लिए कई गुना सील समस्याओं का अनुभव किया।
जब एक प्रयोग की स्थापना, हमने पाया है कि हौसले से तैयार बीजाणुओं, प्रवाह कक्ष में लोड किया जा रहा से दो घंटा के भीतर अंकुरित जबकि एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से निकाली गई बीजाणुओं की आवश्यकता कम से कम 6 घंटा पहले रोगाणु नलियों में उभरा (डेटा) नहीं दिखाया। अंकुरण में इस देरी प्रयोग की लंबाई में फैली हुई है और साथ हस्तक्षेप कर सकते हैंउपकरण की उपलब्धता और प्रयोगात्मक शर्तों। यह भी कम से कम 3 घंटे के लिए एमवाईएम ते के छिड़काव के साथ प्रयोग शुरू करने के लिए विकास और रोगाणु ट्यूबों के परिणाम के लिए पर्याप्त पोषक तत्व प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है। MYM-ते के साथ छिड़काव यदि प्रयोग वनस्पति के विकास का अध्ययन करने के लिए बनाया गया है प्रारंभिक 3 घंटा से आगे बढ़ाया जा सकता है। जबकि बीजाणुओं सामग्री शुरू की पहली पसंद प्रदान करते हैं, लघु hyphal टुकड़े भी microfluidic प्लेट में लोड किया जा सकता है। हालांकि, लदान क्षमता जब sheared फुई का उपयोग महत्वपूर्ण कम है और अक्सर कई लोडिंग रन जब गैर sporulating म्यूटेंट की जांच है जो एक सीमा उपस्थित हो सकता है की आवश्यकता है। इस्तेमाल किया inoculum के प्रकार के बावजूद, यह बीजाणुओं या इस रूप में hyphal टुकड़े के साथ संस्कृति कक्ष अधिभार नहीं तेजी से भीड़भाड़ है कि मीडिया के प्रसार के साथ हस्तक्षेप और छवि विश्लेषण जटिल हो सकता है का नेतृत्व करेंगे महत्वपूर्ण है।
यह संवाददाता प्रोटीन के निर्माण की योजना के लिए महत्वपूर्ण है carefully Streptomyces में प्रतिदीप्ति समय चूक इमेजिंग में उपयोग के लिए। लक्ष्य प्रोटीन और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और एन या सी टर्मिनल fusions के चुनाव के बीच लिंकर लंबाई महत्वपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, इमेजिंग आवृत्ति और समय जोखिम सहित इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों, प्रत्येक fluorescently टैग प्रोटीन के लिए पहले से निर्धारित किया जा करने की जरूरत है। एस venezuelae hyphae प्रदर्शनी हरी / पीला चैनल कि समस्याग्रस्त एक fluorescently लेबल प्रोटीन है कि निम्न स्तर पर व्यक्त की है जब इमेजिंग बन सकते में ऑटो प्रतिदीप्ति। इसके अलावा, यह है कि ध्यान दिया जाना चाहिए, अंकुरण और प्रारंभिक वनस्पति के विकास के चरण, एस के दौरान venezuelae विशेष रूप से लघु तरंग दैर्ध्य प्रकाश (उदाहरण के लिए जब सीएफपी करने के लिए प्रोटीन fusions का उपयोग) के प्रति संवेदनशील है।
बैक्टीरिया का जीना सेल इमेजिंग के लिए इमेजिंग तकनीक और फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रणालियों के क्षेत्र में निरंतर प्रगति के बावजूद, सॉफ्टवेयर संकुल के अधिकांश (जैसे MicrobeTracker, Schnitzelcएल, CellProfiler) डेटा सेट के इन प्रकार के बाद स्वचालित प्रसंस्करण के लिए एक बहुकोशिकीय जीवन शैली के साथ 27-29 filamentous बैक्टीरिया से निकाली गई छवियों के विश्लेषण का समर्थन नहीं करते। इस प्रकार, वहाँ Streptomyces और अन्य filamentous बैक्टीरिया से इमेजिंग डेटा के मात्रात्मक उच्च throughput विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त एल्गोरिथ्म विकसित करने की आवश्यकता है।
सारांश में, काम यहाँ वर्णित एस की अपार क्षमता को दर्शाता है क्योंकि तरल में sporulate के लिए अपनी क्षमता का जीनस के लिए एक नया मॉडल विकास प्रणाली, के रूप में venezuelae। microfluidic संवर्धन डिवाइस अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के लिए भी उपयोग करने के लिए सरल है। यह सेल जैविक गतिशील प्रोटीन स्थानीयकरण, ध्रुवीकृत विकास, और unigenomic बीजाणुओं की जंजीरों में एक बहुकोशिकीय फुई की रूपात्मक भेदभाव सहित Streptomyces जीवन चक्र, के लिए केंद्रीय प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मंच प्रदान करता है। इसके अलावा इस प्रयोगात्मक यू सेटपी भी इस तरह के फ्लोरोसेंट डी -amino एसिड पेप्टीडॉग्लीकैन संश्लेषण या propidium आयोडाइड और 4 पर नजर रखने के लिए ', 6-diamidino-2-phenylindole के रूप में विकास में घटनाओं है कि संस्कृति की स्थिति बारी की आवश्यकता होती है, या फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग की जांच करने के लिए एक आकर्षक प्रारंभिक बिंदु प्रदान करता है (DAPI) गुणसूत्र संगठन 30,31 कल्पना करने के लिए।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).
B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells | Merck-Millipore | B04A-03-5PK | Microfluidic culture plates |
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2) | Merck-Millipore | EV-262 | The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com |
Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | 431007-9902-000 | Fully automated and motorized inverted widefield microscope |
Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2 | Zeiss | 411857-9061-000 | Environmental chamber surrounding the microscope |
Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective | Zeiss | 420792-9800-000 | |
Ocra FLASH 4 V2 | Hamamatsu Photonics K.K. | C11440-22CU | |
Illuminator HXP 120V | Zeiss | 423013-9010-000 | |
FL Filter Set 46 HE YFP shift free | Zeiss | 489046-9901-000 | Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm |
FL Filter Set 63 HE RFP shift free | Zeiss | 489063-0000-000 | Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm |
Mounting frame K-M for multiwell plates | Zeiss | 000000-1272-644 | Stage holder for microfluidic plate |
ZEN pro 2012 | Zeiss | 410135-1002-120 | Microscope control software |
ZEN Module Time Lapse | Zeiss | 410136-1031-110 | Software module to set up time-lapse microscopy experiments |
ZEN Module Tiles/Positions | Zeiss | 410136-1025-110 | Software module to save specific stage positions (xzy) |
Fiji | open-source software package | http://fiji.sc/Fiji | Generation of time-lapse movies |
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 4 g Maltose 4 g Yeast extract 10 g Malt extract add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving |
Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60 | ||
R2 Trace element solution (TE) 8 mg ZnCl2 40 mg FeCl3-6H2O 2 mg CuCl2-2H2O 2 mg MnCl2-4H2O 2 mg Na2B4O7-10H2O 2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O add 200 ml H2O Autoclave and store at 4 oC |
Add 0.002 volumes to MYM | ||
PBS (phosphate buffered saline) | Sigma | P4417-100TAB | Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage. |
0.22 µm syringe filters | Satorius stedim | 16532-K | Preparation of spent MYM-TE |
SV60 | John Innes Centre strain collection | S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet |