Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.
Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties.
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.
Streptomycetes sono batteri che vivono nel suolo che sono caratterizzati da un ciclo di sviluppo complesso che coinvolge la differenziazione morfologica da un multicellulare, nutriente-lavaggio micelio di dormienti, spore unigenomic 1-3.
In condizioni di crescita favorevoli, una spora tipici Streptomyces comincia a germinare estrudendo uno o due tubi germinali (Figura 1). Questi tubi allungare per estensione punta e crescono in una rete ramificata ifale conosciuto come il micelio vegetativo. la crescita polare e ifale ramificazione è diretto dal DivIVA essenziale delle proteine. Questa proteina coiled-coil è parte di un grande complesso citoplasmatico chiamato polarisome, che è cruciale per l'inserimento di nuovo materiale dell'involucro cellulare sulla punta estendentesi 4-7. Durante la crescita vegetativa, i filamenti ifali diventano compartimentato dalla formazione infrequente dei cosiddetti trasversali pareti 8. La formazione di queste pareti trasversali ri quaderni FtsZ, la tubulina, come le proteine del citoscheletro che è essenziale per la divisione cellulare nella maggior parte dei batteri 9. In Streptomyces, tuttavia, questi vegetative trasversali pareti non portano ad costrizione e cellula-cellula separazione e quindi la massa miceliari rimane come una rete di compartimenti sinciziale interconnessi. In risposta alla limitazione di nutrienti e altri segnali che non sono ben compresi, ife aerea specializzata staccarsi dal micelio vegetativo e crescere in aria 3. La costruzione di queste strutture avvia la fase riproduttiva dello sviluppo, durante la quale il lungo ife aeree multi-genomica diventare diviso in decine di uguali dimensioni compartimenti prespore unigenomic. Questo massiccio evento divisione cellulare è guidato dalla costrizione sincrono di anelli multipli FtsZ all'interno singolo 2,10 ife sporigeni. differenziazione morfologica si completa con il rilascio di dormienti, spore, pigmentate spesse pareti.
t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">I principali eventi di sviluppo del ciclo di vita Streptomyces sono ben caratterizzati 1,3. Tuttavia, ciò che è ancora scarse sono studi sulle cellule biologiche che utilizzano la fluorescenza time-lapse microscopia a fornire una conoscenza dei processi alla base subcellulari differenziazione, come ad esempio le dinamiche di localizzazione della proteina, il movimento dei cromosomi e la divisione cellulare evolutivamente controllata. Live-cell imaging di sviluppo Streptomyces è difficile a causa della complessità del ciclo di vita e le caratteristiche fisiologiche dell'organismo. Precedenti studi sulla crescita vegetativa e le fasi iniziali di sporulazione septation hanno impiegato camere di imaging ossigeno-permeabile, o la crescita agarosio supportata di Streptomyces coelicolor su un palco microscopio 11-15. Questi metodi, tuttavia, sono limitati da una serie di fattori. Alcuni sistemi consentono solo di imaging a breve termine di una crescita cellulareproteine fluorescenti D Prima cellule soffrono di apporto di ossigeno insufficiente o crescere fuori del piano focale dovuta al modello tridimensionale di sviluppo ifale. Nei casi in cui l'imaging a lungo termine è possibile, coltivando le cellule sui rilievi agarosio limiti di flessibilità sperimentale perché le cellule non possono essere esposti a condizioni di crescita o di stress alternativi, e la fluorescenza di fondo dalla media delle pastiglie agarosio limita fortemente la possibilità di monitorare a fluorescenza più debole segnali.
Qui si descrive un protocollo per live-cell imaging del ciclo di vita completo Streptomyces con ottima precisione e sensibilità. Con crescente Streptomyces in un dispositivo microfluidica collegato ad un microscopio a fluorescenza widefield (figura 2), siamo ora in grado di monitorare la germinazione, crescita vegetativa e la sporulazione septation per un periodo di tempo fino a 30 ore. Questo è notevolmente facilitata dall'utilizzo dei nuovi Streptomyces organismo modello </em> venezuelae perché sporulates al di completamento nella cultura sommersa e quindi supera la limitazione della specie modello classico S. coelicolor, che sporulates solo su terreni solidi 16-20. Per aiutare a visualizzare la crescita vegetativa e la sporulazione, abbiamo co-Express fluorescente tagged versioni del marcatore DivIVA polarità cellulare e la chiave di proteine divisione cellulare FtsZ.
Stiamo utilizzando un dispositivo di microfluidica disponibile in commercio che è stato impiegato con successo per micobatteri, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis e lievito 21-25. Il sistema intrappola cellule in un unico piano focale e permette il controllo di perfusione continua di terreno di coltura da diversi serbatoi. Nel protocollo dettagliato approfittiamo di questa funzione per esporre S. venezuelae micelio vegetativo ad una scalata nutrizionale per promuovere la sporulazione.
Il protocollo deScribed è per l'imaging dal vivo di cellule di tutto il ciclo di vita Streptomyces, ma le condizioni di media alternativi o le impostazioni del microscopio può essere scelto se specifici stadi di sviluppo sono di particolare interesse.
Figura 2: Schema che descrive il flusso di lavoro sperimentale. Vengono visualizzati i tre passaggi principali descritti nel protocollo. Innanzitutto, spore e mezzo trascorso sono preparati da una cultura fase stazionaria. In secondo luogo, le spore freschi vengono caricati in un sistema di microfluidica e S. venezuelae viene esposta in tutto il suo ciclo di vita di sviluppo utilizzando un microscopio invertito completamente automatica con camera di incubazione a mantenere una temperatura di crescita ottimale. In terzo luogo, la serie di time-lapse ottenuto viene analizzato ed elaborati utilizzando il software open-source Fiji.
Time-lapse microscopia del ciclo di vita Streptomyces è tecnicamente impegnativo in passato. Qui vi presentiamo un protocollo robusto per eseguire l'imaging dal vivo di cellule del ciclo di vita completo utilizzando fusioni proteina fluorescente al marcatore DivIVA polarità delle cellule e la proteina divisione cellulare FtsZ per aiutare a visualizzare e tracciare la progressione attraverso il programma di sviluppo (Figura 2).
Al centro di questo metodo è la coltivazione di S. venezuelae in un dispositivo a microfluidi che permette costante perfusione media e lo scambio di normale mezzo di crescita (MYM-TE) con il mezzo trascorso (speso MYM-TE). Il cambio di condizione di cultura è importante per il protocollo descritto perché la scalata nutrizionale come pozzi come eventuali segnali extracellulari ancora non identificati (ad esempio il quorum sensing segnali) nel terreno di coltura speso, promuovere la sporulazione, mentre una fornitura continua di media ricchi di nutrienti stimola growt vegetativoh con quasi nessuna formazione di spore (dati non riportati). Così, coltura di cellule in questo sistema microfluidico è superiore alla coltura di cellule in agarosio in quanto offre la flessibilità più sperimentali e consente il monitoraggio a lungo termine delle variazioni di crescita batterica in risposta alle mutevoli condizioni di coltura. Sebbene le piastre microfluidica sono progettati per uso singolo, flusso canali che non sono stati inoculati con cellule possono essere utilizzati in esperimenti successivi. Si consiglia di utilizzare tutti i canali di una piastra microfluidica entro una settimana, come abbiamo sperimentato problemi di tenuta del collettore di piatti che sono stati aperti per tempi più lunghi.
Quando si imposta un esperimento, abbiamo scoperto che le spore preparate al momento germinati entro due ore di essere caricati nella camera di flusso, mentre le spore provenienti da uno stock di glicerolo congelato necessari almeno 6 ore prima di tubi germinali sono emersi (dati non riportati). Questo ritardo nella germinazione estende la durata dell'esperimento e può interferire condisponibilità di attrezzature e condizioni sperimentali. E 'anche importante iniziare l'esperimento con perfusione di MYM-TE per almeno 3 ore per fornire nutrienti sufficienti per lo sviluppo e la conseguenza di tubi germinali. Perfusione con MYM-TE può essere esteso al di là della iniziale di 3 ore se l'esperimento è stato progettato per studiare la crescita vegetativa. Mentre spore forniscono la scelta preferita di materiale di partenza, frammenti breve ifali possono essere caricati nella piastra microfluidica. Tuttavia, l'efficienza di carico quando si utilizza micelio tosato è significativa più bassa e spesso richiede diversi percorsi di carico che possono presentare una limitazione in sede di esame mutanti non sporulanti. Indipendentemente dal tipo di inoculo utilizzato, è importante non sovraccaricare la camera di coltura con spore o frammenti ifali come questa di una rapida sovraffollamento che possono interferire con la diffusione multimediale e complicare analisi dell'immagine.
È importante pianificare la costruzione di proteine reporter carefully per l'uso della fluorescenza time-lapse imaging in Streptomyces. Lunghezza Linker tra la proteina bersaglio e il reporter fluorescente e la scelta di N- o fusioni C-terminale può essere critico. Inoltre, le condizioni sperimentali ottimali, tra cui la frequenza delle immagini e il tempo di esposizione, devono essere determinati in anticipo per ogni proteina fluorescente-tag. S. venezuelae ife mostra auto-fluorescenza nel verde dei canali / giallo che può diventare problematico quando l'imaging una proteina fluorescente che si esprime a livelli bassi. Inoltre, si deve notare che, durante la germinazione e la fase di crescita vegetativa iniziale, S. venezuelae è particolarmente sensibile alla luce a breve lunghezza d'onda (ad esempio quando si utilizza fusioni di proteine per PCP).
Nonostante i continui progressi nelle tecniche di imaging e di sistemi reporter fluorescente per l'imaging dal vivo di cellule di batteri, la maggior parte dei pacchetti software (ad esempio MicrobeTracker, Schnitzelcells, CellProfiler) per un successivo trattamento automatizzato di questi tipi di insiemi di dati non supportano l'analisi di immagini derivate da batteri filamentosi con uno stile di vita pluricellulare 27-29. Pertanto, vi è la necessità di sviluppare un algoritmo adatto per l'analisi quantitativa ad alta produttività dei dati di imaging di Streptomyces e altri batteri filamentosi.
In sintesi, il lavoro descritto qui dimostra l'immenso potenziale di S. venezuelae come un nuovo sistema di sviluppo di modello per il genere, a causa della sua capacità di sporulare in liquido. Il dispositivo di coltura microfluidica è semplice da usare anche per gli utenti meno esperti. Esso fornisce una piattaforma eccellente per studiare i processi biologici cellulari centrali al ciclo di vita Streptomyces, tra cui localizzazione dinamica delle proteine, la crescita polarizzata, e la differenziazione morfologica di un micelio multicellulare in catene di spore unigenomic. Inoltre questo sperimentale u setp fornisce anche un punto di partenza allettante per indagare gli eventi nello sviluppo che richiedono alternano condizioni di coltura, o l'uso di coloranti fluorescenti come acidi fluorescenti D -ammino per monitorare sintesi del peptidoglicano o ioduro di propidio e 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per visualizzare l'organizzazione dei cromosomi 30,31.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).
B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells | Merck-Millipore | B04A-03-5PK | Microfluidic culture plates |
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2) | Merck-Millipore | EV-262 | The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com |
Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | 431007-9902-000 | Fully automated and motorized inverted widefield microscope |
Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2 | Zeiss | 411857-9061-000 | Environmental chamber surrounding the microscope |
Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective | Zeiss | 420792-9800-000 | |
Ocra FLASH 4 V2 | Hamamatsu Photonics K.K. | C11440-22CU | |
Illuminator HXP 120V | Zeiss | 423013-9010-000 | |
FL Filter Set 46 HE YFP shift free | Zeiss | 489046-9901-000 | Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm |
FL Filter Set 63 HE RFP shift free | Zeiss | 489063-0000-000 | Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm |
Mounting frame K-M for multiwell plates | Zeiss | 000000-1272-644 | Stage holder for microfluidic plate |
ZEN pro 2012 | Zeiss | 410135-1002-120 | Microscope control software |
ZEN Module Time Lapse | Zeiss | 410136-1031-110 | Software module to set up time-lapse microscopy experiments |
ZEN Module Tiles/Positions | Zeiss | 410136-1025-110 | Software module to save specific stage positions (xzy) |
Fiji | open-source software package | http://fiji.sc/Fiji | Generation of time-lapse movies |
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 4 g Maltose 4 g Yeast extract 10 g Malt extract add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving |
Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60 | ||
R2 Trace element solution (TE) 8 mg ZnCl2 40 mg FeCl3-6H2O 2 mg CuCl2-2H2O 2 mg MnCl2-4H2O 2 mg Na2B4O7-10H2O 2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O add 200 ml H2O Autoclave and store at 4 oC |
Add 0.002 volumes to MYM | ||
PBS (phosphate buffered saline) | Sigma | P4417-100TAB | Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage. |
0.22 µm syringe filters | Satorius stedim | 16532-K | Preparation of spent MYM-TE |
SV60 | John Innes Centre strain collection | S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet |