Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.
Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties.
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.
Streptomycetes er jord-bolig bakterier som er preget av en kompleks utviklingssyklus som involverer morfologisk differensiering fra en flercellet, nærings-scavenging mycel til sovende, unigenomic sporer 1-3.
Under gunstige vekstbetingelser, er en typisk Streptomyces spore begynner å spire ved ekstrudering av en eller to bakterie rør (figur 1). Disse rørene forlenges etter tips forlengelse og vokse til en forgrenet hyphal nettverk kjent som vegetative mycelium. Polar vekst og hyphal forgrening er regissert av den essensielle proteiner DivIVA. Denne kveil-kveil-protein er en del av et stort cytoplasmatisk kompleks kalt polarisome, som er avgjørende for innsetting av nye celle konvolutt materiale på forløpende spiss 4-7. Under vegetativ vekst, de hyphal filamenter bli compartmentalized av sjeldne dannelsen av såkalte kryss vegger 8. Dannelsen av disse kryss vegger re quires FtsZ, den tubulin-lignende cytoskeletal protein som er viktig for celledeling i de fleste bakterier 9. I Streptomyces, men disse vegetative tverrvegger ikke fører til innsnevring og celle-celleseparasjon og derfor myseliemassen forblir som et nettverk av sammenhengende syncytial kammere. Som svar på næringsbegrensning og andre signaler som ikke er godt forstått, antenne hyfer bryte vekk fra den vegetative mycelium og vokse opp i luften tre. Oppsetting av disse strukturene initierer den reproduktive fase av utviklingen, hvorunder lang multi-genomisk lufthyfer bli delt inn i en rekke like store unigenomic prespore kammere. Denne massive celledeling arrangementet er drevet av synkron innsnevring av flere FtsZ ringer innenfor enkelt sporogenic hyfer 2,10. Morfologiske differensiering er fullført ved utgivelsen av sovende, tykke vegger, pigmenterte sporer.
t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">De viktigste utviklings hendelsene i Streptomyces livssyklus er godt karakteriseres 1,3. Men det er fortsatt mangelvare er cellebiologiske studier som benytter fluorescens time-lapse mikroskopi for å gi innsikt i de subcellulære prosessene som ligger til grunn differensiering, for eksempel protein lokalisering dynamikk, kromosom bevegelse og utviklingsmessig kontrollert celledeling. Lever-celle avbildning av Streptomyces utvikling har vært vanskelig på grunn av kompleksiteten av livssyklusen og de fysiologiske egenskapene til organismen. Tidligere studier på vegetativ vekst og den innledende fasen av sporulation septumdannelse har ansatt oksygenpermeabel bilde kamre, eller agarose-støttet veksten av Streptomyces coelicolor på et mikroskop scenen 11-15. Disse fremgangsmåter er imidlertid begrenset av en rekke faktorer. Noen systemer bare tillate kortsiktig avbildning av cellevekst end fluorescerende proteiner før celler lider av utilstrekkelig oksygentilførsel eller vokse ut av fokalplanet på grunn av den tre-dimensjonale mønster av hyphal utvikling. I de tilfeller hvor langvarig avbildning er mulig, dyrking av cellene på agarose klosser grenser eksperimentelt fleksibilitet fordi cellene ikke kan utsettes for alternative vekst eller stressbetingelser, og bakgrunnsfluorescens fra mediet i agarose elektrodene sterkt begrenser muligheten til å overvåke svakere fluorescerende signaler.
Her beskriver vi en protokoll for live-cell imaging av komplette Streptomyces livssyklus med utmerket presisjon og følsomhet. Ved økende Streptomyces i et mikrofluid enhet som er koblet til en fluorescens Widefield mikroskop (figur 2), er vi nå i stand til å overvåke spiring, vegetativ vekst og sporulation septumdannelse over en periode på opptil 30 timer. Dette er mye lettere ved bruk av de nye modellorganisme Streptomyces </em> venezuelae fordi det sporulates til nær ferdigstillelse i neddykket kultur og dermed over begrensning av den klassiske modellen arter S. coelicolor, som bare sporulates på faste medier 16-20. For å hjelpe visualisere vegetativ vekst og sporulation, vi co-express fluorescens-merket versjoner av cellen polaritet markør DivIVA og nøkkelen celledeling protein FtsZ.
Vi bruker et kommersielt tilgjengelig microfluidic enhet som har blitt ansatt for mykobakterier, Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis og gjær 21-25. Systemet feller celler i et enkelt fokusplanet og muliggjør kontroll av kontinuerlig perfusjon av dyrkningsmedium fra forskjellige reservoarer. I den detaljerte protokollen kan vi dra nytte av denne funksjonen til å utsette S. venezuelae vegetative mycelium til en ernæringsmessig nedgiring for å fremme sporulation.
Protokollen derives er for levende celle avbildning av hele Streptomyces livssyklus, men alternative media forhold eller mikroskopinnstillinger kan velges hvis spesifikke utviklingsstadier er av spesiell interesse.
Figur 2: Skjematisk viser det eksperimentelle arbeidet-strømning. De tre viktigste trinnene som er beskrevet i protokollen vises. Først blir sporer og brukt medium fremstilt fra en stasjonær-fase-kultur. For det andre, blir de friske sporer lastet inn i et mikrofluidsystem og S. venezuelae avbildes gjennom hele dens utviklingsmessige livsløpet ved hjelp av en helautomatisk invertert mikroskop med en inkubasjon kammer for å opprettholde en optimal veksttemperatur. For det tredje er det time-lapse-serien fått analysert og behandlet ved hjelp av open-source programvare Fiji.
Time-lapse mikroskopi av Streptomyces livssyklus har vært teknisk utfordrende i det siste. Her presenterer vi en robust protokoll for å opptre live-cell imaging av hele livssyklusen ved hjelp av fluorescerende protein fusjoner til cellen polaritet markør DivIVA og celledeling protein FtsZ å visualisere og spore progresjon gjennom utviklingsprogram (figur 2).
Sentralt i denne metoden er dyrking av S. venezuelae i en microfluidic enhet som gjør konstant medium perfusjon og utveksling av normal vekst medium (MYM-TE) med brukt medium (brukt MYM-TE). Endringen av kultur tilstand er viktig for den beskrevne protokollen fordi den ernæringsmessige nedgiring som brønner som noen ennå uidentifiserte ekstracellulære signaler (f.eks quorum sensing signaler) i det brukte kulturmediet, fremme sporulation, mens en kontinuerlig tilførsel av næringsrikt medium stimulerer vegetativ growtt med nesten ingen sporedannelse (data ikke vist). Således dyrking av cellene i denne mikrofluidsystem er overlegen i forhold til dyrkning av celler i agarose, fordi det gir mer fleksibilitet eksperimentelt og tillater langtidsovervåking av endringer i bakterievekst i respons til endring av dyrkningsforhold. Selv om microfluidic platene er konstruert for engangsbruk, strømningskanaler som ikke er blitt inokulert med celler som kan anvendes i de etterfølgende eksperimenter. Vi anbefaler å bruke alle kanaler for en microfluidic plate innen en uke, som vi har opplevd problemer tetting manifolden til plater som er åpnet for lengre tid.
Når du setter opp et eksperiment, fant vi at nylagede sporer spirer innen to timer for å bli lastet inn i flyten kammeret, mens sporer stammer fra en frossen glyserol lager kreves minst seks timer før bakterie rør dukket opp (data ikke vist). Denne forsinkelsen i spiring strekker seg over lengden av eksperimentet, og kan forstyrreutstyr tilgjengelighet og eksperimentelle forhold. Det er også viktig å starte forsøket med perfusjon av MYM-TE i minst 3 timer for å gi tilstrekkelig næringsstoffer for utvikling og utvekst av bakterie rør. Perfusjon med MYM-TE kan utvides utover den opprinnelige 3 timer dersom forsøket er utformet for å studere vegetative vekst. Mens sporer tilveiebringe det foretrukne valg av utgangsmateriale, kan kort hyphal fragmenter også bli lastet inn i mikrofluid plate. Men lasteeffektivitet ved bruk skåret mycel er betydelig lavere og ofte krever flere laste løper som kan utgjøre en begrensning når undersøke ikke-sporedannende mutanter. Uavhengig av den type som ble anvendt, er det viktig ikke å overbelaste kulturen kammer med sporer eller hyphal fragmenter, da dette vil føre til rask overbefolkning som kan forstyrre mediene diffusjon og komplisere bildeanalyse.
Det er viktig å planlegge byggingen av reporter proteiner carefully for bruk i fluorescens time-lapse bildebehandling i Streptomyces. Linkerlengde mellom målproteinet og det fluorescerende reporter og valg av N- eller C-terminale fusjoner kan være kritisk. Videre optimale forsøksbetingelser, herunder bildefrekvens og eksponeringstid, må bestemmes på forhånd for hvert fluorescent-merket protein. S. venezuelae hyfer oppviser auto-fluorescens i det grønn / gul kanal som kan bli problematisk når avbildning av et fluorescensmerket protein som blir uttrykt på lave nivåer. I tillegg bør det bemerkes at, under spiring og den første vegetative vekstfase, S. venezuelae er spesielt følsomme for kortbølget lys (for eksempel når du bruker proteinfusjoner til CFP).
Til tross for de kontinuerlige fremskritt i bildeteknikker og fluorescerende reporter systemer for live-cell imaging av bakterier, de fleste av programvarepakker (f.eks MicrobeTracker, Schnitzelcalen, CellProfiler) for den etterfølgende automatisk behandling av slike datasettene støtter ikke analysen av bilder avledet fra trådformede bakterier med et flercellet livsstil 27-29. Det er således et behov for å utvikle en egnet algoritme for kvantitativ high-throughput-analyse av bildedata fra Streptomyces og andre trådformede bakterier.
Oppsummert er arbeidet som er beskrevet her demonstrerer det enorme potensialet av S. venezuelae som en ny modell utviklingssystem for slekten, på grunn av dens evne til å sporulere i væske. Den microfluidic dyrking enheten er enkel å bruke selv for uerfarne brukere. Det gir en utmerket plattform for å studere cellebiologiske prosesser som er sentrale for Streptomyces livssyklus, inkludert dynamisk protein lokalisering, polarisert vekst, og den morfologiske differensiering av en flercellet mycel i varetekt i unigenomic sporer. I tillegg denne eksperimentelle satt up bringer også en fristende utgangspunkt for å undersøke hendelser i utviklingen som krever vekslende dyrkingsbetingelser, eller bruken av fluorescerende fargestoffer som for eksempel fluoriserende D-aminosyrer for å overvåke peptidoglykansyntesen eller propidiumjodid og 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) for å visualisere kromosom organisasjon 30,31.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).
B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells | Merck-Millipore | B04A-03-5PK | Microfluidic culture plates |
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2) | Merck-Millipore | EV-262 | The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com |
Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | 431007-9902-000 | Fully automated and motorized inverted widefield microscope |
Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2 | Zeiss | 411857-9061-000 | Environmental chamber surrounding the microscope |
Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective | Zeiss | 420792-9800-000 | |
Ocra FLASH 4 V2 | Hamamatsu Photonics K.K. | C11440-22CU | |
Illuminator HXP 120V | Zeiss | 423013-9010-000 | |
FL Filter Set 46 HE YFP shift free | Zeiss | 489046-9901-000 | Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm |
FL Filter Set 63 HE RFP shift free | Zeiss | 489063-0000-000 | Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm |
Mounting frame K-M for multiwell plates | Zeiss | 000000-1272-644 | Stage holder for microfluidic plate |
ZEN pro 2012 | Zeiss | 410135-1002-120 | Microscope control software |
ZEN Module Time Lapse | Zeiss | 410136-1031-110 | Software module to set up time-lapse microscopy experiments |
ZEN Module Tiles/Positions | Zeiss | 410136-1025-110 | Software module to save specific stage positions (xzy) |
Fiji | open-source software package | http://fiji.sc/Fiji | Generation of time-lapse movies |
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 4 g Maltose 4 g Yeast extract 10 g Malt extract add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving |
Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60 | ||
R2 Trace element solution (TE) 8 mg ZnCl2 40 mg FeCl3-6H2O 2 mg CuCl2-2H2O 2 mg MnCl2-4H2O 2 mg Na2B4O7-10H2O 2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O add 200 ml H2O Autoclave and store at 4 oC |
Add 0.002 volumes to MYM | ||
PBS (phosphate buffered saline) | Sigma | P4417-100TAB | Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage. |
0.22 µm syringe filters | Satorius stedim | 16532-K | Preparation of spent MYM-TE |
SV60 | John Innes Centre strain collection | S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet |