Protocol
embriões de aves não são considerados animais vertebrados nos termos da regulamentação IUCAC.
1. A obtenção de embriões para Cirurgia
- Incubar 80 - 90 ovos de galinha fertilizados Bovan (sem corte final para cima) em um umidificado (60%) incubadora roqueiro a 40 ° C durante aproximadamente 72 horas para se obter embriões em Hamilton e Hamburger (HH) estágio 17. Determinar o número exato de ovos com base em análise de poder e taxa de sobrevivência de embriões 17. Use bandejas de ovos de plástico para a incubação para permitir a circulação de ar adequada.
- Uma vez que esta fase de desenvolvimento desejado é atingido, coloque aproximadamente 20 ml de tampão quente (37 ° C) de Tyrode (suplementado com bicarbonato de sódio (1 g / L)) em 100 mm x 26 mm de placa de petri.
- Esterilizar uma casca de ovo com 70% de etanol.
- Suavemente quebrar a casca com um cabo de bisturi e solte cuidadosamente o seu conteúdo para o prato contendo tampão de Tyrode. Descartar embriões se (i) que visualmente parece anormal (ii)não estão na fase de desenvolvimento direita (iii) forem mal orientados sobre a gema e / ou (iv) ocorre o sangramento. Reter quaisquer embriões não sujeitos a cirurgia imediatamente após ser colocado ex ovo a 40 ° C de modo a não comprometer o desenvolvimento.
Nota: Staging é realizada com base em Hamilton e Hamburger 18. A anormalidade de embriões de galinha é determinada a olho nu e sob o escopo de dissecação. Certifique-se que o embrião tem dobragem apropriada e flexão e vasculatura.
2. OFT Banding
- Tweeze out individuais tópicos de 1 cm de comprimento de um único 11/0 nylon sutura cirúrgica e formar um nó frouxo. UV esterilizar todos nós pré-formados.
- Sob um microscópio de dissecção, visualmente assegurar que o coração está a bater, a uma taxa normal (~ 120 batimentos / min). Se não, descartar o embrião.
- Imediatamente antes da cirurgia, aplica 5 - 6 ml de tampão quente (37 ° C) de Tyrode à superfície do embrião utilizando uma pipeta de transferência.
- Passe uma extremidade livre do nó pré-formada sob o OFT, posicione a sutura na junção OFT / ventrículo (OVJ) (ou local desejado), e passar a extremidade livre para o nó contraindo assim o OFT incluindo as membranas que envolvem o coração.
- Após a cirurgia, molhar a superfície da gema com 5 - 6 mL de água morna (37 ° C) utilizando tampão de Tyrode uma pipeta de transferência.
- Manter embriões de controlo ex ovo como os embriões faixas; no entanto, não submetê-las com o procedimento cirúrgico.
- Incubar os embriões, durante o período de tempo desejado, a 40 ° C em um (60%) incubador humidificado.
- Uma vez que o ponto de tempo desejado seja alcançado, extirpar o embrião da gema com uma tesoura reta. Dissecar o coração com uma pinça fina e usar para diversos estudos a jusante, tais como alterações na morfologia cardíaca devido a hemodinâmica alterada 17.
3. Afirmar que a intervenção Banding provoca uma mudança na Hemodinâmica
Nota: A constrição parcial causado pela intervenção bandas leva a um aumento da velocidade do fluxo sanguíneo na OVJ. Este parâmetro hemodinâmico é convenientemente avaliada utilizando ecografia 2D de imagem, a qual é realizada no ponto de tempo desejado do experimento.
- Uma vez que apenas um único embrião pode ser trabalhada ao mesmo tempo, manter todas as outras embriões designados para imagiologia de ultra-sons numa incubadora a 40 ° C.
- Colocar a placa de petri contendo o embrião a ser trabalhada sobre uma almofada de aquecimento para 40 ° C.
- Encha o prato, até a borda, com tampão quente (37 ° C) de Tyrode. Lentamente, deitar a solução de tampão para o prato de modo a manter a gema intacta. Se, no entanto, a integridade da gema seja comprometida durante este passo, descartar o embrião.
- Oriente o embrião de tal modo que o eixo central do embrião é perpendicular à sonda de ultra-sons, que está suspensa a partir de um suporte ajustável.
- Com a ópera máquina de ultra-somting no modo B, obter uma imagem 2D do coração batendo na tela e mover o palco (almofada de aquecimento) de tal forma que o OFT, ventrículo e OVJ são claramente visíveis.
- Mudar para o modo pulsado de ondas (PW), com a frequência de repetição do pulso desejado (por exemplo, 20 kHz) e obter dados de velocidade exatamente no OVJ. Uma imagem em modo B do batimento cardíaco é obtido na tela.
- Mova o palco para ver o OFT, ventrículo e da OVJ. Usando o software da máquina de ultra-som, obter medições de velocidade exatamente no OVJ.
Nota: Se a frequência cardíaca de um embrião diminui durante a imagem, dados de velocidade assim obtidos não devem ser utilizados para a análise. Todos os embriões utilizados para medições de velocidade devem, preferencialmente, ser utilizados para quaisquer outros experimentos após ultra-sonografia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mostrado na Figura 1 são os instrumentos necessários para OFT banding recomendado. A placa de petri (Figura 1A), contendo o embrião ex ovo deve ser suficientemente profundo, de forma a não destruir o embrião quando coberta com a tampa. As placas de Petri profundas (Figura 1C) também deve ser utilizado para imagiologia de ultra-sons para permitir um volume adequado de tampão de Tyrode para ser derramado sobre a gema.
Um único fio de 1 centímetro (Figura 2A) é tweezed para fora a partir de um 11/0 nylon de sutura (Figura 1A) e atado com um nó frouxa (Figura 1B). Todos os pré-formados são nós UV esterilizado. A Figura 3A mostra uma câmara humidificada balancim em que os ovos de galinha fertilizados são incubados até à fase desejada. A Figura 3B mostra uma incubadora embrião, onde unida e embriões de controlo são mantidas ex ovo
Mostrado na Figura 4A é um embrião HH17 em cima da gema ex ovo. A Figura 4B é uma representação esquemática que mostra a posição do fio de sutura (banda) na OVJ de um embrião HH17. A Figura 4C é uma imagem representativa de um embrião em faixas fotografada 48 horas após a cirurgia.
O efeito da intervenção de bandas da velocidade de fluxo sanguíneo através do local de constrição é medido por ultra-sonografia 2D. Como esperado, a velocidade no OVJ é maior no embrião em faixas relativamente ao controlo (Figura 5). Temos análise Dinâmica de Fluidos Computacional (CFD) em corações faixas e controle recentemente realizada no ponto de tempo de 24 horas mostrando os efeitos da OFT formação de bandas em velocidade do fluxo sanguíneo e de cisalhamento de parede estresse 17.
<p class = "jove_content" fo: manter-together.within-page = "1">
Figura 1. instrumentos cirúrgicos. (A) de sutura 11/0 nylon. (B) placa de Petri contendo nós pré-formado. (C) de prato petri profundo para a cultura do embrião ex ovo e ultra-sonografia. (D) Transferência pipeta. (E) bisturi lidar para quebrar a casca do ovo. (F) tesoura reta para excisão de embriões para estudos de pós-operatório. (G) uma pinça fina por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Sutura para OFT Banding. (A) Um único segmento um centímetro tweezed a partir de uma sutura.
Figura 3. Incubação Chambers. (A) incubadora roqueiro umidificada por ovos fertilizados. (B) câmara úmida por ex ovo cultura de embriões em faixas e controle. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. OFT Banding. (A) embrião de galinha inteiro HH17 mantida ex ovo, barra de escala = 10 mm (B) Representação esquemática representando a constriçãolocal (vermelho). (C) Banded embrião fotografada 48 horas após o OFT bandas, barra de escala = 0,5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Medições de velocidade Figura 5. Ultrasound-derivadas. Perfis de velocidade representativo de controlo (A) e (B) em faixas embriões obtidos em um ponto de tempo de 1 hora. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Esta técnica é relativamente rápido e fácil de executar, no entanto alguns pontos essenciais precisam ser mantidos em mente, de modo a obter resultados a jusante precisos. Os embriões deve ser mantido ex ovo numa placa de Petri que contém tampão de Tyrode para proporcionar re-hidratação adequada. Também é importante para hidratar a gema de pós-operatório com tampão de Tyrode e para garantir que a câmara de incubação é adequadamente hidratado. Cirurgias não deve ser realizada em um embrião se houver sangramento é visível ou a gema é ainda um pouco quebrado. Isto afecta a sobrevivência dos embriões, especialmente para experiências a longo prazo. Outra causa potencial de letalidade de embriões, é se a banda ao redor do OFT é muito apertado, quando aplicada pela primeira vez, assim, comprometer significativamente a função cardíaca.
Actualmente, usamos ultra-som como uma ferramenta de confirmação para determinar a mudança na velocidade do fluxo sanguíneo em cima OFT bandas. No futuro, vamos confirmar por meio de tomografia computadorizada de micro (CT). Nós também determinar visualmente o aperto banda ao redor do OFT em imagens 2D em modo B. É importante ressaltar que não se observam diferenças na frequência cardíaca e fluxo volumétrico (calculado usando CFD) entre embriões nos grupos de faixas e controlo 17. Estes dados indicam que a fisiologia do sistema cardiovascular não é comprometida nos embriões com faixas, assim, ainda mais a validação intervenção bandas.
No ponto de tempo desejado, após a bandagem, várias análises podem ser realizados para compreender o efeito da hemodinâmica alterada em processos de desenvolvimento de válvulas crítica. Estes incluem, mas não estão limitados a, determinação de alterações em níveis de transcrição de genes reguladores-chave envolvidas no desenvolvimento da válvula, determinando a localização de componentes da matriz extracelular e a determinação da ultra-estrutura do OFT.
Finalmente, esta técnica melhora o método atual de bandas do OFT no embrião dentro do ovo de janela 19. Esse método é graveLY dificultado pela incapacidade para acumular embriões necessárias para fazer análises moleculares a jusante. Esta nova técnica pode ser usada em experiências de salvamento bem. Esta aplicação permite a faixas OFT a ser resgatado e embriões permitidos para se recuperar do insulto. No método atual pode fazer isso e ainda ser capaz de realizar análises a jusante estatisticamente significativos.
Nós empregamos com sucesso esta técnica para alterar os estímulos hemodinâmicos, no coração de embriões de galinha em um estágio de desenvolvimento muito cedo (HH 16-17). O protocolo de bandagem pode apresentar um desafio ao realizar a cirurgia em fases posteriores do desenvolvimento, devido ao risco de entalhar qualquer um dos vasos sanguíneos extraembryonic. Além disso, nos últimos estágios do desenvolvimento, é muitas vezes difícil de manter o saco vitelino intacta quando os conteúdos do ovo são transferidos para a placa de Petri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
- Neeb, Z., Lajiness, J., Bolanis, E., Conway, S.
- Combs, M., Yutzey, K. Heart valve development: regulatory networks in development and disease. Circ Res. 105 (5), 408-421 (2009).
- Hinton, R., Yutzey, K. Heart valve structure and function in development and disease. Annu Rev Physiol. 73, 29-46 (2011).
- von Gise, A., Pu, W. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110 (12), 1628-1645 (2012).
- Person, A., Klewer, S., Runyan, R. Cell biology of cardiac cushion development. Int Rev Cytol. 243, 287-335 (2005).
- de Vlaming, A., et al. Atrioventricular valve development: new perspectives on an old theme. Differentiation. 84 (1), 103-116 (2012).
- Butcher, J., McQuinn, T., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100 (10), 1503-1511 (2007).
- Hove, J., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- Tan, H., et al. Fluid flow forces and rhoA regulate fibrous development of the atrioventricular valves. Dev Biol. 374 (2), 345-356 (2013).
- Biechler, S., et al. The impact of flow-induced forces on the morphogenesis of the outflow tract. Front Physiol. 5, (2014).
- Hu, N., Clark, E. Hemodynamics of the stage 12 to stage 29 chick embryo. Circ Res. 65 (6), 1665-1670 (1989).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Unilateral vitelline vein ligation alters intracardiac blood flow patterns and morphogenesis in the chick embryo. Circ Res. 80 (4), 473-481 (1997).
- Hogers, B., DeRuiter, M., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R. Extraembryonic venous obstructions lead to cardiovascular malformations and can be embryolethal. Cardiovasc Res. 41 (1), 87-99 (1999).
- Reckova, M., et al. Hemodynamics is a key epigenetic factor in development of the cardiac conduction system. Circ Res. 93 (1), 77-85 (2003).
- Stekelenburg-de Vos, S., et al. Acutely altered hemodynamics following venous obstruction in the early chick embryo. J Exp Biol. 206 (pt 6), 1051-1057 (2003).
- Lucitti, J., Tobita, K., Keller, B. Arterial hemodynamics and mechanical properties after circulatory intervention in the chick embryo. J Exp Biol. 208 (pt 10), 1877-1885 (2005).
- Menon, V., Eberth, J., Goodwin, R., Potts, J. Altered Hemodynamics in the Embryonic Heart Affects Outflow Valve Development. J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2 (2), 108-124 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 473-481 (1951).
- Midgett, M., Goenezen, S., Rugonyi, S. Blood flow dynamics reflect degree of outflow tract banding in Hamburger-Hamilton stage 18 chicken embryos. J R Soc Interface. 11 (100), (2014).
