Protocol
embriones de aves no se consideran animales vertebrados bajo las regulaciones IUCAC.
1. La obtención de embriones para la cirugía
- Incubar 80 - 90 huevos de gallina fertilizados Bovan (romo) terminan en un humidificado (60%) del eje de balancín incubadora a 40 ° C durante aproximadamente 72 h para obtener embriones a Hamilton y Hamburger (HH) etapa 17. Determinar el número exacto de los huevos sobre la base de el análisis del poder y la tasa de supervivencia de los embriones 17. Use bandejas de huevos de plástico para la incubación para permitir la circulación de aire adecuada.
- Una vez que se alcanza esta etapa de desarrollo deseada, vierta aproximadamente 20 ml de (37 ° C) de tampón caliente de Tyrode (suplementado con bicarbonato de sodio (1 g / L)) en un 100 mm x 26 mm placa de Petri.
- Esterilizar una cáscara de huevo con un 70% de etanol.
- Suavemente romper la cáscara con un mango de bisturí y liberar cuidadosamente su contenido en el plato que contiene tampón de Tyrode. Desechar los embriones si (i) que aparecen visualmente anormal (ii)No están en fase de desarrollo a la derecha (iii) que están orientadas incorrectamente sobre la yema y / o (iv) se produce cualquier sangrado. Retener cualquier embriones no sometidos a cirugía inmediatamente después de ser colocado ex ovo a 40 ° C con el fin de no comprometer el desarrollo.
Nota: La estadificación se realiza en base a Hamilton y Hamburger 18. Anormalidad de embriones de pollo se determina por el ojo desnudo y en el ámbito de la disección. Asegúrese de que el embrión tiene plegamiento apropiado y flexión y la vasculatura.
2. OFT Bandas
- Con pinzas individuales hilos de 1 cm de largo de una sola sutura quirúrgica 11/0 de nylon y formar un nudo flojo. UV esterilizar todos los nudos preformados.
- Bajo un microscopio de disección, asegurar visualmente que el corazón late a un ritmo normal (~ 120 latidos / min). Si no es así, desechar el embrión.
- Justo antes de la cirugía, aplique 5 - 6 ml de (C 37 °) tampón de Tyrode caliente a la superficie del embrión utilizando una pipeta de transferencia.
- Pase un extremo libre del nudo preformado bajo la OFT, la posición de la sutura en el OFT / unión ventrículo (OVJ) (o la ubicación deseada), y pasar el extremo libre en el nudo de la constricción de este modo la OFT incluyendo las membranas que rodean el corazón.
- Después de la cirugía, mojar la superficie de la yema con 5 - 6 ml de tibia (37 ° C) tampón de Tyrode utilizando una pipeta de transferencia.
- Mantener el control de embriones ex ovo ya que los embriones en bandas; Sin embargo no someterlas al procedimiento quirúrgico.
- Incubar los embriones, por la cantidad deseada de tiempo, a 40 ° C en un incubador humidificado (60%).
- Una vez que se alcanza el punto de tiempo deseado, escindir el embrión a partir de la yema de huevo con unas tijeras rectas. Diseccionar el corazón con unas pinzas finas y el uso de varios estudios posteriores, tales como cambios en la morfología cardiaca debido a la alteración hemodinámica 17.
3. Confirmación de que la intervención de las bandas provoca un cambio en Hemodinámica
Nota: La constricción parcial causada por la intervención de bandas conduce a un aumento de la velocidad del flujo sanguíneo en el OVJ. Este parámetro hemodinámico se evalúa convenientemente usando imágenes por ultrasonido 2D, que se realiza en el punto de tiempo deseado del experimento.
- Dado que sólo un único embrión se pueden obtener imágenes a la vez, mantener todos los otros embriones designados para formación de imágenes de ultrasonidos en un 40 ° C incubadora.
- Coloque la placa de Petri que contiene el embrión para formar una imagen sobre una almohadilla térmica a 40 ° C.
- Llenar el recipiente, hasta el borde, con tampón caliente (37 ° C) de Tyrode. Verter lentamente la solución tampón en el plato con el fin de mantener intacta la yema. Si, sin embargo, la integridad de la yema se ve comprometida durante este paso, desechar el embrión.
- Orient el embrión de manera que el eje central del embrión es perpendicular a la sonda de ultrasonido que está suspendido de un soporte ajustable.
- Con la ópera máquina de ultrasonidoting en modo B, la obtención de una imagen 2D del corazón que late en la pantalla y mover la etapa (almohadilla térmica) de tal manera que la OFT, ventrículo y OVJ son claramente visibles.
- Cambiar al modo de onda pulsada (PW), en la frecuencia de repetición de impulsos deseada (por ejemplo, 20 kHz) y obtener datos de velocidad exactamente en el OVJ. Una imagen en modo B de los latidos del corazón se obtiene en la pantalla.
- Mover el escenario para ver la OFT, ventrículo y la OVJ. Usando el software de la máquina de ultrasonido, obtener mediciones de la velocidad exactamente en el OVJ.
Nota: Si la frecuencia cardíaca de un embrión disminuye durante la proyección de imagen, datos de velocidad así obtenidos no deben ser utilizados para el análisis. Todos los embriones utilizados para mediciones de velocidad no deberían preferentemente ser utilizados para ningún otro experimentos después de la ecografía.
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Representative Results
Se muestra en la Figura 1 son instrumentos necesarios para bandas OFT recomendado. La placa de Petri (Figura 1A) que contiene el embrión ex ovo debe ser lo suficientemente profunda como para no destruir el embrión cuando se cubre con la tapa. Placas de petri profundas (Figura 1C) también deberían utilizarse para obtener imágenes de ultrasonido para permitir un volumen adecuado de tampón de Tyrode que se vierte encima de la yema.
Un solo 1 cm de hilo (Figura 2A) se tweezed a cabo a partir de un 11/0 sutura de nylon (Figura 1A) y atado en un nudo flojo (Figura 1B). Todos los nudos están preformados UV esterilizados. La figura 3A muestra una cámara humidificada basculante donde los huevos de gallina fertilizados se incuban hasta que la etapa deseada. Figura 3B muestra un incubador de embriones, donde anillados y control de los embriones se mantienen ex ovo
Se muestra en la Figura 4A es un embrión HH17 en la parte superior de la yema ex ovo. La figura 4B es una representación esquemática que muestra la posición de la sutura (banda) en el OVJ de un embrión HH17. La Figura 4C es una imagen representativa de un embrión de bandas fotografiado 48 horas después de la cirugía.
El efecto de la intervención de bandas en la velocidad del flujo sanguíneo a través del sitio de constricción se mide por imágenes de ultrasonido 2D. Como era de esperar, la velocidad en el OVJ es más alta en el embrión en bandas en relación con el control (Figura 5). Hemos llevado a cabo recientemente un análisis de dinámica de fluidos computacional (CFD) en corazones con bandas y control en el punto de tiempo de 24 horas que muestra los efectos de bandas OFT en la velocidad del flujo sanguíneo y la tensión cortante en la pared 17.
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Figura 1. instrumentos quirúrgicos. (A) de sutura de nylon 11/0. (B) la placa de Petri que contiene nudos preformado. (C) placa de Petri profunda para el cultivo de embriones ex ovo y de imágenes por ultrasonido. (D) de pipeta de transferencia (E). bisturí manejar para romper la cáscara del huevo. (F) tijeras rectas para la escisión de embriones para estudios posteriores a la cirugía. (G) unas pinzas finas Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La sutura de las bandas OFT. (A) Un solo hilo 1 cm tweezed hacia fuera de una sutura.
Figura 3. cámaras de incubación. (A) incubador humidificado basculante para los huevos fertilizados. (B) cámara húmeda para la ex ovo cultivo de embriones en bandas y control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. OFT las bandas. (A) Total de embrión de pollo HH17 mantenido ex ovo, barra de escala = 10 mm (B) Representación esquemática que representa la constricciónEl sitio (rojo). (C) en bandas de embriones fotografiada 48 horas después de anillamiento OFT, barra de escala = 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5.-El ultrasonido deriva Mediciones de velocidad. Perfiles de velocidad Representante de control (A) y (B) anillados embriones obtenidos en un punto de tiempo de 1 hora. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Esta técnica es relativamente rápida y fácil de realizar, sin embargo ciertos puntos clave deben ser tenidos en cuenta a fin de obtener resultados precisos aguas abajo. Los embriones deben mantenerse ex ovo en una placa de Petri que contiene tampón de Tyrode para proporcionar una adecuada rehidratación. También es importante para hidratar la yema después de la cirugía con tampón de Tyrode y para asegurarse de que la cámara de incubación se hidrata adecuadamente. Las cirugías no deben realizarse en un embrión si el sangrado es visible o la yema es incluso un poco roto. Esto afecta a la supervivencia del embrión, especialmente para experimentos a largo plazo. Otra causa potencial de letalidad de embriones, es si la banda alrededor de la OFT está demasiado apretado cuando se aplica en primer lugar, por tanto, comprometer significativamente la función cardiaca.
En la actualidad, se utiliza el ultrasonido como una herramienta de confirmación para determinar el cambio en la velocidad del flujo sanguíneo en las bandas OFT. En el futuro, vamos a confirmar mediante tomografía computarizada micro-(CONNECTICUT). También determinamos visualmente la estanqueidad banda alrededor de la OFT en modo B de imágenes 2D. Es importante destacar que no hay diferencias en la frecuencia cardíaca y el flujo volumétrico (calculada utilizando CFD) se observan entre embriones en los grupos con bandas y de control 17. Estos indican que la fisiología del sistema cardiovascular no se ve comprometida en los embriones en bandas diseño, validando la intervención de bandas.
En el punto de tiempo deseado, después de anillado, varios análisis se pueden realizar para entender el efecto de la hemodinámica alterados en los procesos de desarrollo de válvula crítico. Estos incluyen, pero no se limitan a, la determinación de los cambios en los niveles de transcripción de genes reguladores clave implicados en el desarrollo de la válvula, la determinación de la localización de los componentes de ECM y la determinación de la ultraestructura de la OFT.
Por último, esta técnica mejora en el método actual de bandas del OFT en el embrión dentro del huevo de ventana 19. Ese método es graveLy obstaculizado por la incapacidad de acumular embriones necesarios para realizar los análisis moleculares aguas abajo. Esta nueva técnica se puede utilizar en experimentos de rescate también. Esta aplicación permite la OFT bandas a ser rescatados y el embrión les permitió recuperarse de la lesión. Ningún método actual puede hacer esto y aún así ser capaz de realizar análisis posteriores estadísticamente significativas.
Hemos utilizado con éxito esta técnica para cambiar los estímulos hemodinámicos en el corazón de embriones de pollo en una fase de desarrollo muy temprana (HH 16 - 17). El protocolo de bandas podría presentar un reto a la hora de realizar la cirugía en etapas posteriores del desarrollo, debido al riesgo de mellar cualquiera de los vasos sanguíneos extraembrionarias. Asimismo, en las últimas etapas de desarrollo, a menudo es difícil mantener el saco vitelino intacto cuando los contenidos de los huevos se transfieren a la placa de Petri.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized Bovan chicken eggs | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Nylon suture | Ashaway | S30001 | UV sterilize knots before surgery |
| 100 x 26 mm petri dish | VWR | 25387-030 | |
| Transfer pipettes | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Straight scissor | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tyrodes buffer | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Filter sterlize before use |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Ultrasound Imaging system | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Ultrasound transducer | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
References
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