यह पांडुलिपि एक तकनीकी प्रक्रिया है कि इन विट्रो और तीव्र ल्यूकेमिया उनकी इंजेक्शन के बाद चूहों में प्रेरित में C1498 सेल संस्कृतियों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्ररूपी और कार्यात्मक विश्लेषण से फ्लो, immunofluorescence माइक्रोस्कोपी, cytochemistry और मई-Grünwald Giemsa धुंधला का उपयोग किया जाता है।
syngeneic या congenic चूहों में C1498 कोशिकाओं की नसों में इंजेक्शन के बाद से 1941 ये इंजेक्शन तीव्र ल्यूकेमिया के विकास में परिणाम प्रदर्शन किया गया है। हालांकि, इस रोग की प्रकृति में अच्छी तरह से साहित्य में दर्ज़ नहीं किया गया है। यहाँ, हम इन विट्रो में C1498 कोशिकाओं निस्र्पक के लिए और इन विवो में प्रेरित ल्यूकेमिया की प्रकृति का निर्धारण करने के लिए एक तकनीकी प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रक्रिया के पहले भाग hematopoietic वंश और सुसंस्कृत C1498 कोशिकाओं के भेदभाव के मंच का निर्धारण करने पर केंद्रित है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, मल्टी पैरामीट्रिक प्रवाह cytometric धुंधला hematopoietic सेल मार्कर पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। Immunofluorescence माइक्रोस्कोपी, cytochemistry और एक मई-Grünwald Giemsa धुंधला तो myeloperoxidase की अभिव्यक्ति, esterases और सेलुलर आकृति विज्ञान की गतिविधि को क्रमश: आकलन करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में प्रेरित किया है कि ल्यूकेमिया बीमारी का वर्णन करने के लिए समर्पित हैविवो। बाद के रक्त में लयूकेमिक और निहित कोशिकाओं की आवृत्तियों का निर्धारण करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, hematopoietic अंगों (जैसे, अस्थि मज्जा और तिल्ली) और गैर-लसीकावत् ऊतकों (जैसे, जिगर और फेफड़ों) विशिष्ट धुंधला का उपयोग और प्रवाह cytometry विश्लेषण करती है। ल्यूकेमिया की प्रकृति तो अस्थि मज्जा में विशिष्ट esterases के लिए मई-Grünwald Giemsa धुंधला और धुंधला का उपयोग कर पुष्टि की है। यहाँ, हम परिणाम है कि उम्र से मिलान C1498- और पीबीएस इंजेक्शन चूहों में इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्राप्त किया गया प्रस्तुत करते हैं।
तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) hematopoietic माइलॉयड कोशिकाओं है कि परिपक्वता के विभिन्न चरणों में अवरुद्ध कर रहे हैं के अनियंत्रित प्रसार की विशेषता है। इस अनियंत्रण granulocytic, monocytic, एरिथ्रोसाइटिक या megaryocytic भेदभाव रास्ते 1 को प्रभावित कर सकते हैं। एएमएल कोशिकाओं अस्थि मज्जा में जमा है, बिगड़ा hematopoiesis, जो thrombopenia, lymphopenia और एनीमिया में परिणाम के लिए अग्रणी। लयूकेमिक कोशिकाओं को भी रक्त और गैर-लसीकावत् अंगों पर आक्रमण।
C1498 माउस मॉडल तीव्र ल्यूकेमिया के बाद से कैंसर की कोशिकाओं को 1941 में एक लयूकेमिक 10 महीने की उम्र में C57BL / 6 (एच -2 बी) महिला माउस से अलग थे के लिए एक मॉडल के रूप में दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है साहित्य खून में आक्रमण का वर्णन , hematopoietic अंगों (जैसे, प्लीहा और लिम्फ नोड्स) और गैर hematopoietic अंगों (जैसे, यकृत, फेफड़े, अंडाशय, और गुर्दे) अत्यधिक proliferative C1498 कोशिकाओं द्वारा करने के बाद वे एक में के माध्यम से इंजेक्ट किया गयाtravenous, चमड़े के नीचे या अतिसंवेदनशील चूहों 2-4 में इंट्रा-पेरिटोनियल मार्ग। हालांकि, इस माउस मॉडल प्रेरित करने के लिए या तो granulocytic 2,5 या myelomonocytic 6 ल्यूकेमिया की सूचना मिली थी। हाल ही में, 2002 में प्रकाशित एक अध्ययन murine NKT सेल ल्यूकेमिया 7 के रूप में कैंसर के इस प्रकार का वर्णन किया। इस प्रकार, साहित्य इस C1498 सेल लाइन की प्रकृति और संबद्ध ल्यूकेमिया यह चूहों में लाती है के विषय में अलग है। 70 के दशक – इन विसंगतियों मुख्य रूप से विस्तृत की कमी और कोशिकाओं के बारे में अद्यतन जानकारी प्रकाशित और सामान्य में लयूकेमिक रोग क्योंकि कई अध्ययनों 1950 में प्रदर्शन किया गया के कारण हैं।
यहाँ हम कैसे C1498 कोशिकाओं विशेषताएँ और है कि चूहों में उनकी नसों में इंजेक्शन से प्रेरित है लयूकेमिक रोग की प्रकृति का विश्लेषण करने का वर्णन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल का पहला खंड है कि इन विट्रो में संवर्धित किया गया है C1498 कोशिकाओं का एक विवरण के लिए समर्पित है। फ्लोरोसेंट विरोधीसतह और intracellular hematopoietic मार्कर के खिलाफ निर्देशित शव प्रवाह cytometry का उपयोग कर अपने phenotype निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। myeloperoxidase की उपस्थिति immunofluorescence माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था, उनके hematopoietic वंश और भेदभाव चरण esterases की गतिविधि का आकलन करने के cytochemistry का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था, और मई-Grünwald Giemsa धुंधला प्रदर्शन किया गया था। C1498 कोशिकाओं तो चूहों में इंजेक्ट किया गया है, और तीव्र ल्यूकेमिया बीमारी है जो प्रेरित किया गया था इस पांडुलिपि के दूसरे खंड में वर्णित है। एक ही तकनीक आवृत्तियों और अस्थि मज्जा में लयूकेमिक और निहित कोशिकाओं, परिधीय रक्त, प्लीहा और गैर hematopoietic अंगों (जिगर और फेफड़ों) के phenotypes निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया।
इस प्रोटोकॉल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, और यहाँ प्रस्तुत डेटा शोधकर्ताओं ने नई चिकित्सकीय रणनीति के प्रभाव का आकलन करने में मदद मिलेगी। यह ल्यूकेमिया माउस मॉडल पहले से ही immunotherapy एक दृष्टिकोण का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएन डी विभिन्न कैंसर कीमोथेरेपी दवाओं 8,9। उनकी प्रभावकारिता ट्यूमर बोझ और जीवित रहने की दरों के विकास के निर्धारण से मूल्यांकन किया गया था। इस प्रोटोकॉल उपचार के दौरान वितरण और लयूकेमिक और अन्य hematopoietic सेल आबादी के निर्वाह के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
पिछले अध्ययनों में, C1498 सेल लाइन तीव्र granulocytic 5, myelomonocytic 6 या 7 NKT सेल ल्यूकेमिया के एक inducer के रूप में वर्णित किया गया था। हालांकि, साहित्य में ठोस डेटा या तो अनुपस्थित या अधूरा थे। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऐसे प्रवाह cytometry, immunofluorescence, MGG धुंधला और cytochemical assays के रूप में विभिन्न तकनीकों, सुसंस्कृत C1498 कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए और है कि चूहों में प्रेरित किया है के बाद वे इंजेक्शन हैं ल्यूकेमिया की प्रकृति का निर्धारण करने के लिए उपयोग करता है।
जब हम immunostaining के बाद इन विट्रो सुसंस्कृत C1498 कोशिकाओं में phenotyped और प्रवाह cytometry विश्लेषण प्रदर्शन किया गया है, हम कुछ सीमाएं मनाया क्योंकि इन कोशिकाओं कुछ कोशिका की सतह hematopoietic मार्करों है कि पहले साहित्य 6.7 में वर्णित किया गया व्यक्त किया। हमारे परिणामों के साथ समझौते में, Labelle एट अल। प्रवाह cytomet का उपयोग कर C1498 कोशिकाओं पर परिपक्व TCR की कोशिका की सतह अभिव्यक्ति का पालन नहीं कियाRY धुंधला हो जाना। हालांकि, वे उन्हें विचार के लिए एक NKT सेल लाइन हो जाने के बाद वे CD3ε और TCRVβ8.2 mRNAs 7 का पता चला। हम यह भी कोशिकाओं (> 70%) के अधिकांश में TCRVβ चेन और CD3ε अणुओं के intracellular अभिव्यक्ति मनाया, लेकिन उनके hematopoietic प्रजातियों निर्धारित नहीं किया जा सकता है, क्योंकि वहाँ भी था मैक 3 अणु के सहवर्ती intracellular अभिव्यक्ति।
Myeloperoxidase, MGG धुंधला और आकलन cytochemistry का उपयोग कर कार्यात्मक esterases विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन किया है कि C1498 सेल लाइन एक माइलॉयड मूल था और monoblasts और myeloblasts से बना था। इन परिणामों के मैक 3 + कोशिकाओं का प्रतिशत है कि धुंधला प्रवाह cytometry विश्लेषण में प्राप्त किया गया साथ सहमत थे। हालांकि मात्रात्मक नहीं, इन चरणों कुंजी प्रयोगों का प्रतिनिधित्व प्रदर्शन किया जाएगा। दरअसल, वे रहते हैं, अब तक, hematopoietic कोशिकाओं कि व्यक्त नहीं या एफ के वंश और भेदभाव चरण निस्र्पक के लिए सबसे अच्छा मौजूदा तरीकोंईडब्ल्यू विशिष्ट प्ररूपी मार्करों।
धुंधला प्रवाह cytometry congenic चूहों में तीव्र ल्यूकेमिया के विकास का प्रदर्शन C1498 कोशिकाओं नसों में इंजेक्शन थे के बाद के लिए मददगार थे। CD45.2 + C1498 कोशिकाओं है कि परिधीय रक्त और विभिन्न अंगों में घुसपैठ अलग थे, और उनके आवृत्तियों निर्धारित किया गया है। मात्रा का ठहराव भी immunophenotyping के बाद निहित दिमाग़ी और प्लीहा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। जब C1498 सेल phenotype अंगों में जांच की गई थी के रूप में वे कुछ hematopoietic मार्कर व्यक्त की सीमाओं का सामना करना पड़ा रहे थे (केवल एक उनमें से कुछ B220 + थे)। मनाया तीव्र ल्यूकेमिया की प्रकृति, मई-Grünwald Giemsa धुंधला और monocytic की गतिविधियों के एक विश्लेषण परिभाषित करने के लिए और granulocytic esterases अस्थि मज्जा का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। नतीजे बताते हैं कि C1498 कोशिकाओं उनके माईलोब्लास्टिक और monoblastic आकृति विज्ञान और समारोह संरक्षित, myelomonocytic ल्यूकेमिया की शुरुआत खुलासा।
<p clasएस = "jove_content"> इस प्रोटोकॉल में वर्णित महत्वपूर्ण कदम के लिए विचार में जब cytochemical प्रतिक्रियाओं और MGG धुंधला प्रदर्शन क्योंकि पीएच में त्रुटियों के परिणाम की गलत व्याख्या करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, विशेष रूप से ध्यान देने की पीएच को दी जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, α-naphthyl butyrate esterase गतिविधि क्योंकि granulocytes और लिम्फोसाइट भी उच्च पीएच मान पर इस परीक्षण के लिए सकारात्मक दाग कर सकते हैं केवल 6.0 की एक पीएच पर monocytic कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है। कोशिकाओं fixating MGG धुंधला प्रदर्शन से पहले की सिफारिश नहीं है, और हम से पता चला है कि केवल सीएएफ निर्धारण संतोषजनक परिणाम जब esterases प्रदर्शन cytochemical प्रतिक्रियाओं C1498 कोशिकाओं का उपयोग प्रदान की है। CD115 अणु की अभिव्यक्ति और प्रवाह से अपनी पहचान cytometry, नमूने (जैसे, रक्त, अस्थि मज्जा, और तिल्ली कोशिकाओं) के सभी प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा जाना चाहिए बचाने के लिये। कोई धुंधला से फ्लो या / और immunofluorescence प्रयोगों, एंटीबॉडी के संदर्भ, उनके भंडारण पुनः में मनाया जाता हैप्रशस्तियां और उनके dilutions जाँच की जानी चाहिए। सामग्री / उपकरण तालिका में निर्दिष्ट संदर्भों से फ्लो या immunofluorescence अनुप्रयोगों के लिए चयनित किया गया है। प्राथमिक / माध्यमिक एंटीबॉडी या उनके संयुग्मित fluorophores अनुचित भंडारण की वजह से उनकी गतिविधियों को खो सकता है (उदाहरण के लिए, प्रकाश या गर्मी के लिए जोखिम), अनुचित कमजोर पड़ने, व्यापक ठंड / विगलन या दूषित बफ़र्स का उपयोग करें। सकारात्मक नियंत्रण चलाने के लिए सुनिश्चित करें कि वे ठीक से काम कर रहे हैं। माउस अस्थि मज्जा या तिल्ली व्युत्पन्न कोशिकाओं है कि ब्याज की प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जाना जाता है का प्रयोग करें। उच्च पृष्ठभूमि और गैर विशिष्ट धुंधला से बचने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को ठीक से धो रहे हैं और उच्च आर्द्रता (immunofluorescence के लिए) पर रखा है और एंटीबॉडी के रूप में निर्देश पतला कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें। निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी और प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक ही एकाग्रता और कमजोर पड़ने का उपयोग सही ढंग से नमूने में पृष्ठभूमि के स्तर को निर्धारित करने के लिए। esterase cytochemistry प्रयोगों के लिए,अभिकर्मकों सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शुद्ध माउस प्लीहा granulocytic (Ly6G +) और monocytic (CD115 +) कोशिकाओं से युक्त स्लाइड्स का उपयोग करके परीक्षण किया जा सकता है।प्रक्रिया इस अध्ययन में बताया गया है कि पता चला C1498 कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद चूहों में मनाया लयूकेमिक सुविधाओं के कई मानव तीव्र myelomonocytic ल्यूकेमिया 11,12 के साथ आम पहचान साझा की है। आक्रमण leukemic कोशिकाओं परिपक्व और अपरिपक्व (progenitors और व्यापारियों) दिमाग़ी hematopoietic कोशिकाओं की कमी के परिणामस्वरूप। के रूप में monocytic कोशिकाओं रहे हैं C1498 कोशिकाओं, परिधीय रक्त में उच्च आवृत्ति (> 20%) में मौजूद हैं। हिपेटोमिगेली और तिल्ली का बढ़ना leukemic कोशिकाओं की घुसपैठ से परिणाम के लिए मनाया गया, और बी लिम्फोसाइट और माइलॉयड कोशिकाओं में उल्लेखनीय वृद्धि भी तिल्ली का बढ़ना साथ देने के लिए मनाया गया। Thrombopenia भी जब ब्लड प्लेटलेट्स की संख्या एक रुधिर विश्लेषक का उपयोग अनुमान लगाया गया था मनाया गया।
यह शो थाn, इन विट्रो प्रयोगों में उपयोग करते हुए, C1498 कोशिकाओं सामान्य murine hematopoiesis घुलनशील कारकों 13 स्रावित द्वारा बाधित है। कई ट्यूमर माउस मॉडल में, अपरिपक्व माइलॉयड कोशिकाओं (monocytic और granulocytic कोशिकाओं सहित) भी अस्थि मज्जा से तिल्ली, जहां वे विरोधी ट्यूमर विशेष टी सेल सक्रियण और प्रसार 14 को बाधित करने के लिए विस्थापित करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रकार, hematopoietic कोशिकाओं में कमी है कि अस्थि मज्जा में मनाया गया तो hematopoiesis में और / या उनके उत्प्रवास से एक की कमी से हुई हो सकता था। यह बाद तंत्र परिधीय रक्त में monocytosis की उपस्थिति या तिल्ली में बढ़े माइलॉयड अंशों का अवलोकन समझा सकता है। यह भी बोधगम्य है कि इन कोशिकाओं में सुधार प्लीहा hematopoiesis से प्राप्त किया गया है हो सकता है। दरअसल, स्थिर राज्य शर्तों के तहत, प्लीहा बी कोशिकाओं के कुछ सबसेट की पहचान की गई परिपक्व बी के व्यापारियों लिम्फोसाइटों के रूप में 15। इसके अलावा, भड़काऊ शर्तों के तहत, मेडullary स्टेम और progenitors कोशिकाओं तिल्ली को स्थानांतरित करने के लिए परिपक्व monocytes 16 के उत्पादन के लिए प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रोटोकॉल हमें तंत्र है कि ल्यूकेमिया के विकास में शामिल हैं, और अतिरिक्त कार्यात्मक रूप में अच्छी तरह के रूप में आणविक assays ऐसा करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए के बारे में निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए अनुमति नहीं है। हालांकि, इन आंकड़ों तीव्र myelomonocytic ल्यूकेमिया के नैदानिक सुविधाओं के बारे में विस्तृत जानकारी शामिल है और मूल्यांकन करने और नए चिकित्सीय एजेंट के प्रभाव को समझने के लिए शोधकर्ताओं में मदद मिलेगी।
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the “Ligue Nationale contre le Cancer” (Comité du Septentrion), the SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) and the Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) for supporting this work. They would like to thank Delphine Taillieu and the animal facility staff for housing the mice and maintaining their welfare. We also thank Raphaëlle Caillerez and Nathalie Jouy for their respective help in microscopy and flow cytometry.
C1498 cell line | ATCC | TIB 49 | |
C57BL/6J-Ly5.1 | Charles River | B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl | |
Cells culture reagents | |||
2-Mercaptoethanol, Gibco | ThermoFisher Scientific | 21985 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10270 | |
HEPES, Gibco (1 M) | ThermoFisher Scientific | 15630 | |
Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco | ThermoFisher Scientific | 11140 | |
Penicillin-Streptomycin, Gibco | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) | ThermoFisher Scientific | 61870 | |
Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360 | |
Flow cytometry staining reagents | |||
anti-mouse B220 APC (1) | ebiosciences | 17-0452 | clone RA3-6B2, final dilution 1/100 |
anti-mouse B220 biotin (2) | ebiosciences | 13-0452 | clone RA3-6B2, 1/400 |
anti-mouse CD3 eFluor450 (1) | ebiosciences | 48-0032 | clone 17A2, 1/100 |
anti-mouse CD3 PE (2) | BD biosciences | 555275 | clone 17A2, 1/100 |
anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) | ebiosciences | 15-0031 | clone 145-2C11, 1/100 |
anti-mouse CD4 APC (1) | ebiosciences | 17-0041 | clone GK1.5, 1/500 |
anti-mouse CD4 PE (2) | ebiosciences | 12-0041 | clone GK1.5, 1/200 |
anti-mouse CD8 biotin (1) | ebiosciences | 13-0081 | clone 53-6.7, 1/100 |
anti-mouse CD8 eFluor450 (2) | ebiosciences | 48-0081 | clone 53-6.7, 1/500 |
anti-mouse CD11a biotin | ebiosciences | 13-0111 | clone M17/4, 1/100 |
anti-mouse CD11b PE | ebiosciences | 12-0112 | clone M1/70, 1/200 |
anti-mouse CD16/32 biotin | ebiosciences | 13-0161 | clone 93, 1/400 |
purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking) | BD biosciences | 553141 | clone 2.4G2 |
anti-mouse CD18 biotin (1) | ebiosciences | 13-0181 | clone M18/2, 1/100 |
anti-mouse CD18 FITC (2) | ebiosciences | 11-0181 | clone M18/2, 1/50 |
anti-mouse CD19 PE | ebiosciences | 12-0193 | clone 1D3, 1/200 |
anti-mouse CD21/35 PE | ebiosciences | 12-0211 | clone 8D9, 1/50 |
anti-mouse CD31 PE | ebiosciences | 12-0311 | clone 390, 1/100 |
anti-mouse CD34 eFluor660 | ebiosciences | 50-0341 | clone RAM34, 1/20 |
anti-mouse CD44 PE | BD biosciences | 553134 | clone IM7, 1/50 |
anti-mouse CD45.2 FITC | ebiosciences | 11-0454 | clone 104, 1/100 |
anti-mouse CD49b/Pan NK PE | BD biosciences | 553858 | clone DX5, 1/50 |
anti-mouse CD80 biotin | ebiosciences | 13-0801 | clone 16-10A1, 1/200 |
anti-mouse CD86 biotin | ebiosciences | 13-0862 | clone GL1, 1/200 |
anti-mouse CD107b (Mac-3) PE | ebiosciences | 12-5989 | clone M3/84, 1/40 |
anti-mouse CD115 PE | ebiosciences | 12-1152 | clone AFS98, 1/100 |
anti-mouse CD117 eFluor450 | ebiosciences | 48-1171 | clone 2B8, 1/100 |
anti-mouse CD127 PE | ebiosciences | 12-1271 | clone A7R34, 1/100 |
anti-mouse CD150 APC | ebiosciences | 17-1501 | clone 9D1, 1/20 |
anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin | ebiosciences | 13-5982 | clone MIH5, 1/200 |
anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | ebiosciences | 12-5981 | clone D7, 1/100 |
anti-mouse Ly-6C APC | ebiosciences | 17-5932 | clone HK1.4, 1/200 |
anti-mouse Ly-6G (Gr-1) biotin (1) | ebiosciences | 13-5931 | clone RB6-8C5, 1/400 |
anti-mouse Ly-6G FITC (2) | ebiosciences | 11-9668 | clone 1A8, 1/50 |
anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin | ebiosciences | 13-5999 | clone 28-14-8, 1/50 |
anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 | ebiosciences | 15-5321 | clone M5/114.15.2, 1/1000 |
anti-mouse NK1.1 PE | BD biosciences | 557391 | clone PK136, 1/50 |
anti-mouse TCRVb FITC | BD biosciences | 553170 | clone H57-597, 1/50 |
streptavidin PE-Cy5 | ebiosciences | 15-4317 | 1/200 |
Immunofluorescence staining reagents | |||
Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-16129 | 1/10 (20 µg/ml) |
anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) | Jackson Immunoresearch | 705-076-147 | 1/250 |
Normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | |
Hoechst solution | BD Biosciences | 561908 | 1/1000 |
Mounting medium 1 (Fluoromount) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
Acetone | VWR | 20066 | |
Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
Esterase cytochemical staining reagents | |||
Naphtol AS-D chloroacetate solution | Sigma-Aldrich | 911 | |
Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) | Sigma-Aldrich | 912 | |
pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) | Sigma-Aldrich | 913 | |
Sodium nitrite solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GHS3 | |
Acetone | VWR | 20066 | |
Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | F1635 | |
α-naphthyl butyrate solution | Sigma-Aldrich | 1801 | |
Phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 1805 | |
Sodium nitrite Tablet | Sigma-Aldrich | 1809 | |
Pararosaniline solution | Sigma-Aldrich | 1804 | |
Methylene blue solution | Sigma-Aldrich | 1808 | 1/10 |
mounting medium 2 (Clearmount) | Invitrogen | 00-8010 | |
May-Grünwald Giemsa staining reagents | |||
May-Grünwald solution | RAL Diagnostics | 320070 | |
Giemsa R solution | RAL Diagnostics | 320310 | 1/20 |
pH 6.8 buffer solution | RAL Diagnostics | 330368 | |
Others materials, reagents and equipment | |||
Ketamine 1000 (100 mg/mL) | VIRBAC | 3597132111010 | |
Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/mL) | CEVA | ||
Bovin albumin serum (BSA) powder | ThermoFisher Scientific | BP671 | |
PBS solution (1x concentrate) | ThermoFisher Scientific | 14190 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575 | |
Separating solution (Pancoll Mouse) | PANBIOTECH | P04-64100 | |
Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10X) | BD Biosciences | 555899 | 1/10 |
NaOH 10N | ThermoFisher Scientific | SS267 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | ThermoFisher Scientific | 15250-061 | 1/2 |
50 mL tube (Falcon) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
70µm Cell Strainer (Falcon) | Corning Life Sciences | 352350 | |
Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) | Thermo Scientific | A78710003 | |
Microscope Cover Glasses, 24x24mm | Knittel Glass | VD1 2424 Y100 | |
Slides (Starfrost – ground edges 90) | Knittel Glass | VS1137# 077FKB | |
EDTA Tube | Greiner Bio-One | 454034 | |
Pasteur Pipette 150MM (capillary tube) | Fisherbrand | 1154-6963 | |
26G needle | Terumo | NN-2613R | |
insulin syringe and needle 29G | Terumo | BS05M2913 | |
30G needle | Becton & Dickinson | 304000 | |
Flow cytometry tubes (blue) | Beckman Coulter | 2523749 | |
Water-repellent pen (Dakopen) | Dako | S200230 | |
Sharp sterile scissors | Nessi-care | SCI-01 | |
Sterile forceps | Dominique Dutscher | 956506 | |
Thoma cell counting chamber | VWR | 631-0397 | |
Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) | ThermoFisher Scientific | S33580A | |
Microcentrifuge tube (1.5 mL) | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
Cylindrical Restrainer 15-30 gm | Stoelting | 51338 | |
Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge | ThermoFisher Scientific | ||
10 mL syringe | Terumo | SS-10L | |
1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
Ethanol | Merck | 1.08543 | |
Sterile gauze sponges | URGO | 501580 |