An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.
एमिनो एसिड की विहित सेट प्रोटीन कार्यक्षमता की एक असाधारण व्यापक रेंज की ओर जाता है। फिर भी, अवशेषों के सेट अभी भी संभावित प्रोटीन आवेदनों पर सीमाओं लगाता है। noncanonical अमीनो एसिड के समावेश इस दायरे के विस्तार कर सकते हैं। वहाँ noncanonical अमीनो एसिड के समावेश के लिए दो पूरक दृष्टिकोण हैं। साइट विशेष समावेश के लिए, अंतर्जात विहित translational मशीनरी के अलावा, एक orthogonal अमीनोएसिल-tRNA-synthetase-tRNA जोड़ी है कि विहित लोगों के साथ बातचीत नहीं करता है प्रदान की जानी चाहिए। नतीजतन, एक कोडोन कि एक विहित एमिनो एसिड है, आमतौर पर एक रोकने के कोडोन को नहीं सौंपा है, यह भी आवश्यक है। यह आनुवंशिक कोड विस्तार प्रोटीन के भीतर एक एकल, दिया साइट पर एक noncanonical एमिनो एसिड के समावेश सक्षम बनाता है। यहाँ प्रस्तुत काम अवशेषों से विशिष्ट समावेश जहां आनुवंशिक कोड अंतर्जात translational प्रणाली के भीतर फिर नियत किया जाता है वर्णन करता है। अनुवाद मशीनरी एकएक किराए की शास्त्रीय विधि निर्धारित स्थानों, यानी इसे शामिल करने के लिए के रूप में noncanonical एमिनो एसिड ccepts, प्रोटीन में एक विहित एमिनो एसिड की सभी घटनाओं noncanonical एक से बदल रहे हैं। noncanonical अमीनो एसिड के समावेश प्रोटीन संरचना को बदल सकते हैं, भौतिक और रासायनिक गुणों काफी संशोधित कारण। Noncanonical एमिनो एसिड analogs अक्सर अभिव्यक्ति मेजबान टीम के लिए सेल के विकास अवरोधकों के रूप में कार्य के बाद से वे अंतर्जात प्रोटीन, संशोधित करने, विवो प्रोटीन के उत्पादन में सीमित। प्रोटीन में विषाक्त noncanonical अमीनो एसिड के vivo समावेश विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। इधर, noncanonical अमीनो एसिड एल canavanine द्वारा एल arginine की एक पूरी प्रतिस्थापन के लिए एक सेल मुक्त दृष्टिकोण प्रस्तुत किया है। यह इन विवो अभिव्यक्ति के निहित कठिनाइयों में गतिरोध उत्पन्न। इसके अतिरिक्त, जन वर्णक्रम विश्लेषण के लिए लक्ष्य प्रोटीन तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है। यह दिखाया गया है कि एल एल लाइसिन हाइड्रोक्सी लाइसिन द्वारा बदला जा सकता है,कम क्षमता के साथ यद्यपि। सिद्धांत रूप में, किसी भी noncanonical एमिनो एसिड अनुरूप जब तक अंतर्जात इन विट्रो अनुवाद प्रणाली इसे पहचानता के रूप में प्रस्तुत विधि का उपयोग शामिल किया जा सकता है।
आनुवंशिक कोड जीवमंडल के लिए सार्वभौमिक है। यह 20 विहित अमीनो एसिड का एक सेट है, जो कभी कभी selenocysteine 1 या 2 pyrrolysine द्वारा बढ़ाया है के लिए कोड। यह राइबोसोम कि एमिनो एसिड की श्रृंखला है कि प्रोटीन में गुना में tRNAs की मदद से जेनेटिक कोड में तब्दील हो गया है। विहित अमीनो एसिड के कार्य समूहों, posttranslational संशोधनों के साथ संयोजन में, प्रोटीन समारोह 3,4 की एक असाधारण विस्तृत श्रृंखला के लिए योगदान करते हैं। सिद्धांत रूप में, विहित अमीनो एसिड के सीमित सेट के कारण कार्यात्मक सीमाओं आगे को शामिल करके दूर किया जा सकता है, noncanonical अमीनो एसिड (ncAAs) कि नए chemistries और नए कार्यक्षमताओं 3,4 सक्षम करें।
साइट- या छाछ-विशिष्ट समावेश: वहाँ ncAAs के समावेश के लिए दो पूरक दृष्टिकोण हैं। पूर्व विधि काफी तकनीकी कठिनाइयों पर जोर देता है, अमीनोएसिल-tRNA-synth के विहित सेट के बाद सेetases (Aars) और tRNAs एक orthogonal Aars-tRNA जोड़ी है कि अंतर्जात अनुवाद मशीनरी के साथ बातचीत नहीं करना चाहिए द्वारा विस्तारित किया जाना चाहिए। सावधान इंजीनियरिंग के आधार पर, इस दृष्टिकोण वांछित प्रोटीन साइटों पर एकल बिंदु उत्परिवर्तन के रूप में शामिल किया गया है ncAAs। NcAAs की साइट विशिष्ट समावेश आनुवंशिक रूप से एक कोडोन कि एक विहित एमिनो एसिड (सीएए), आम तौर पर 5-9 कोडोन एक रोकने के लिए नहीं सौंपा है के द्वारा इनकोडिंग है। इस विधि को नहीं बल्कि पूरे प्रोटीन 10-13 भर से एक दिया साइट पर समारोह में परिवर्तन पर जोर देता।
इसके विपरीत, छाछ-विशिष्ट समावेश विहित अनुवाद मशीनरी द्वारा noncanonical अमीनो एसिड की गलत मान्यता पर निर्भर करता है। समावेश Aars की सब्सट्रेट विशिष्टता की कमी के कारण होता है। NcAAs के अवशेषों से विशिष्ट समावेश, कोहेन और सहकर्मियों 14 के काम पर बनाया गया है, महत्वपूर्ण अनुप्रयोगों 3,10, उन के बीच में प्रोटीन की जैव orthogonal लेबलिंग 15-17 के लिए प्रेरित कियाया संरचना एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी 18 में प्रोटीन की व्याख्या।
प्राकृतिक Aars आम तौर पर एक isostructural एनसीएए पर उनके आत्मीय अमीनो एसिड, विवो अवशेषों से विशिष्ट समावेश में कुशल पसंद करते हैं जैसा कि आमतौर पर एक auxotrophic अभिव्यक्ति मेजबान एनसीएए का विहित अनुरूप synthesizing करने में सक्षम नहीं की आवश्यकता है। मेजबान कोशिकाओं मध्यम विकास है कि केवल अनुरूप CAA के एक कम एकाग्रता उद्धार में खेती कर रहे हैं। एनसीएए के साथ लगातार पूरकता के साथ संयोजन में अपनी थकावट अभिव्यक्ति मेजबान एकाधिक, शास्त्रीय विधि निर्धारित स्थलों पर मॉडल प्रोटीन में एनसीएए शामिल करने के लिए मजबूर करता है। साइट विशेष दृष्टिकोण के विपरीत, यह आम तौर पर पूरे प्रोटीन संरचना पर गहरा प्रभाव पड़ता है, अग्रणी काफी प्रोटीन 19,20 के भौतिक और रासायनिक गुण संशोधित करने के लिए है। हालांकि, ncAAs के सबसे अभिव्यक्ति मेजबान 3 के लिए विकास निरोधक, के रूप में वे कई अन्य prot में शामिल कर रहे हैंपुनः संयोजक जीन अभिव्यक्ति के दौरान ब्याज के उन लोगों के अलावा Eins। यह स्पष्ट रूप से इन विवो दृष्टिकोण को सीमित करता है। अमीनो एसिड होता है जो विषाक्त कर रहे हैं या प्रोटीन संरचना पर मजबूत प्रभाव है की इन विवो समावेश विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। हालांकि, इन अणुओं असाधारण कार्यों के साथ प्रोटीन इंजीनियर को सबसे होनहार में से एक हैं।
एक उदाहरण विषैले, noncanonical, स्वाभाविक रूप से होने वाली एल canavanine (कर सकते हैं), एल arginine (ARG) के एक अनुरूप है। यह प्रभावित करता है और ब्लॉक संबंधित विनियामक और उत्प्रेरक प्रतिक्रिया रास्ते ARG, और जीवित कोशिका में अपनी उपस्थिति को तत्काल मौत 3,21-23 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। Arginine पदों पर प्रोटीन में अपने शामिल प्रोटीन स्थिरता 21-23 को कम कर सकते हैं। जिसके परिणामस्वरूप विषाक्तता के कारण, कोलाई (ई कोलाई) और अन्य आम अभिव्यक्ति मेजबान में प्रोटीन युक्त canavanine की अभिव्यक्ति के लिए एक चुनौती बनी हुई है। इन कारणों के लिए, पूरा विवो मैंसभी Arg पदों पर कर सकते हैं की ncorporation उचित रूप से केवल एक बार 24 पुष्टि की गई है, एक सविस्तार एकल प्रोटीन के उत्पादन प्रणाली का उपयोग कर। हालांकि, कर सकते हैं एक कैंसर विरोधी एजेंट 25-27 के रूप में प्रस्तावित किया गया है, और मनुष्यों के 28 में स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों के लिए एक उत्तेजक के रूप में। इसके अतिरिक्त, यह अपने विरोधी चयापचय, जीवाणुरोधी रोधी पर विभिन्न अध्ययनों और एंटीवायरल गुण 25 का विषय है। इन गुणों के लिए एक मांग बढ़ाने के कुशल और आसान करने के लिए प्रदर्शन को व्यक्त करने के pharmaceutic, चिकित्सा और कार्यात्मक अध्ययन के लिए प्रोटीन युक्त सकते हैं तरीकों।
हालांकि कई समस्या है कि इन विवो उत्पादन से जुड़े हैं सेल मुक्त अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग कर उन्हें धोखा दिया जा सकता है, इन विट्रो अवशेषों से विशिष्ट दृष्टिकोण में ही खराब पता लगाया गया है। एक एल tryptophan अनुरूप 29 और कई ncAAs 30 की सेल मुक्त अवशेषों से विशिष्ट समावेश सूचना दी गई है। इन तरीकों में अत्यधिक effic के आधार पर कर रहे हैंient T7 शाही सेना पोलीमरेज़। T7 शाही सेना पोलीमरेज़ जीवाणुभोजी की तरह प्रतिलेखन जरूरत पर जोर देता है, जिससे अंतर्जात प्रतिलेखन की तुलना में आनुवंशिक कार्यक्षमता को कम करने।
पूरा अवशेषों से विशिष्ट सब Arg पदों पर एक मॉडल प्रोटीन में कर सकते हैं का समावेश हाल ही में 31 की सूचना मिली थी, एक सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए 32। एक ही सिस्टम की एक मामूली संशोधन दमन 33 कोडोन रोक के माध्यम से एक मॉडल के प्रोटीन में सक्षम अलग pyrrolysine analogs की साइट विशेष समावेश। नियोजित सेल मुक्त प्रणाली 31 – 33 एक सब ई पर आधारित है कोलाई प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली। – (पुनः संयोजक प्रोटीन की 1 मिलीग्राम / एमएल 0.5) 32 मूल प्रतिलेखन अनुवाद प्रतिरूपकता के ज्यादा बनाए रखते हुए फिर भी, यह कुशलता के रूप में वर्तमान जीवाणुभोजी प्रणालियों में के रूप में प्रोटीन अभिव्यक्ति सक्षम बनाता है।
इस काम में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल पर कैसे Resid प्रदान की गई हैncAAs की UE-विशिष्ट समावेश महसूस किया जा सकता है, यह सब ई का उपयोग कर कोलाई सेल मुक्त प्रणाली 32। इसके अतिरिक्त, एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से उचित मूल्यांकन के लिए व्यक्त प्रोटीन तैयार करने के लिए आगे कदम का प्रस्ताव है। इस सेल मुक्त प्रणाली के गुणों का विस्तार करने के लिए, इस काम ही कर सकते हैं 31 की प्रकाशित समावेश का उल्लेख नहीं है, लेकिन यह भी noncanonical एल Lysine अनुरूप एल हाइड्रोक्सी लाइसिन से संबंधित नए डेटा प्रस्तुत करता है।
NcAAs के अवशेषों से विशिष्ट शामिल करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक प्रोटोकॉल हाल ही में जौव 34 में प्रकाशित का रूपांतरण है। बाद के प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मानक एमिनो एसिड के साथ अत्यधिक कुशल सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए। इसके अलावा, यह कच्चे तेल की सेल मुक्त निकालने की तैयारी, अमीनो एसिड समाधान, ऊर्जा शेयर समाधान और ऊर्जा इस दृष्टिकोण में इस्तेमाल बफर प्रस्तुत करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल पिछले पी की तुलना में संशोधित कदम पर केंद्रितआदेश में rotocol ncAAs के अवशेषों से विशिष्ट समावेश कर सकें। कैलिब्रेटेड pipets, कम बाध्यकारी पिपेट सुझावों और सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयारी के लिए सिफारिश कर रहे हैं। बाद में, अमीनो एसिड के लिए IUPAC संक्षिप्त किया जाता है।
एक-आसान करने के लिए एक व्यवहार्य रणनीति अवशेषों से विशेष रूप से प्रोटीन में ncAAs को शामिल करने के रूप में सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करें, प्रस्तुत किया है। यह अंत करने के लिए, कच्चे तेल निकालने ब्याज की प्रोटीन, ऊर्जा बफर और इसी अमीनो एसिड के लिए वेक्टर डीएनए कोडिंग के साथ पूरक है। ध्यान दें कि कच्चे तेल निकालने विभाज्य मात्रा कच्चे तेल निकालने प्रोटीन एकाग्रता 34 पर निर्भर करता है। सेल मुक्त अभिव्यक्ति दक्षता वेक्टर डीएनए निर्माण एकाग्रता के आधार पर अनुकूलित है। ऊर्जा बफर घटकों की मात्रा क्रम में सेल मुक्त व्यक्त मॉडल प्रोटीन की उच्च पैदावार सक्षम करने के लिए अनुकूलित Mg- और कश्मीर ग्लूटामेट सांद्रता के समारोह के रूप में बदलती हैं।
समावेश प्रयोग का एक प्रारंभिक मूल्यांकन unpurified सेल मुक्त प्रतिक्रिया माध्यम से एसडीएस पृष्ठ के प्रदर्शन से प्राप्त किया जा सकता है। एक अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी पूरा, छाछ-विशिष्ट incor जांच करने के लिए एक साधन के रूप में प्रस्तावित किया गया हैएनसीएए की poration। बाद के लिए एक तैयारी के रूप में, स्पिन स्तंभ प्रणालियों उनकी टैग शुद्धि सक्षम और छोटी मात्रा में है कि हम इस प्रोटोकॉल में उपयोग के साथ विनिमय बफर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
एचपीएलसी-ईएसआई जन स्पेक्ट्रोस्कोपी सहित पूरे प्रोटोकॉल 2 दिनों के भीतर किया जा सकता है। यह किसी भी विशेष रूप से महत्वपूर्ण कदम शामिल नहीं है। हालांकि, Mg- और कश्मीर ग्लूटामेट की एकाग्रता अनुकूलन के रूप में अच्छी तरह से वेक्टर के रूप में डीएनए क्रम में मॉडल प्रोटीन की उच्च पैदावार को व्यक्त करने में महत्वपूर्ण हैं। अत्यधिक कुशल अभिव्यक्ति वेक्टर के उपयोग pBEST-or2-Or1 पीआर-UTR1-gene_of_model_protein-T500 पुरजोर सिफारिश की है। उनकी टैग प्रोटीन की क्षालन पीओ 4 (> 300 मिमी) या सोडियम क्लोराइड (> 50 मिमी) है कि बड़े पैमाने स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण 49 में उच्च पृष्ठभूमि शोर उत्पन्न imidazole के उच्च एकाग्रता (> 150 मिमी) और इस तरह नः 2 के रूप में अन्य लवण के कारण आमतौर पर है । एक उपयुक्त प्रोटीन भंडारण बफर के साथ इस तरह क्षालन buffers की एक्सचेंज स्थिर मॉडल proteमें और तेजी से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण के दौरान पृष्ठभूमि शोर कम कर देता है।
नतीजतन, मॉडल प्रोटीन के भीतर सभी छह पदों पर Arg की जगह कर सकते हैं। अभिव्यक्ति प्रणाली में, कोई Arg अवशेषों का पता लगाया जा सकता है। यह अन्य अभिव्यक्ति प्रणाली है कि आगे की कमी रणनीतियों 29,30 की आवश्यकता की तुलना में Arg analogs के अवशेषों से विशिष्ट समावेश सरल करता है। प्रस्तुत सेल मुक्त दृष्टिकोण कर सकते हैं कि विषाक्तता के कारण हैं विवो दृष्टिकोण में निहित सीमाओं, या एकल प्रोटीन के उत्पादन रणनीतियों 24,31 में mRNA अनुक्रम पर मजबूत निर्भरता में गतिरोध उत्पन्न। इन विट्रो प्रणाली में कार्यरत है के विपरीत, कर सकते हैं की इन विवो दरार homoserine करने और hydroxyguanidine 31 होती है।
हालांकि, सेल मुक्त प्रणाली लिस के लिए पर्याप्त मात्रा में इस तरह के रूप में HYL analogs के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए बरकरार रखती है। एचपीएलसी-ईएसआई बड़े पैमाने स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण से पता चलता है कि मॉडल प्रोटीन दोनों, सी होता हैanonical के साथ ही विभिन्न अनुपात में noncanonical अनुरूप। लिस के अवशेषों से विशिष्ट समावेश सामान्य रूप से संभव है, लेकिन पूरी प्रतिस्थापन, आगे कमी रणनीतियों, या विशेष रूप से इंजीनियर Aars और tRNA ncAAs की मान्यता के लिए अनुकूलित के लिए विकसित किए जाने की जरूरत है।
हम विहित लोगों के रूप में एक ही एकाग्रता में एनसीएए जोड़कर सेल मुक्त व्यक्त की, संशोधित मॉडल प्रोटीन का उत्कृष्ट पैदावार हासिल की। समावेश दक्षता एनसीएए की प्रकृति शामिल होने पर निर्भर करता है। यहां तक कि उच्च पैदावार अभी भी एनसीएए की एकाग्रता के अनुकूलन के द्वारा वसूली योग्य हो सकता है।
प्रस्तुत परिणाम के रूप में लंबे समय के रूप में वे विहित अंतर्जात translational प्रणाली द्वारा स्वीकार किए जाते हैं ncAAs के अवशेषों से विशिष्ट शामिल करने के लिए कार्यरत प्रणाली के लागू प्रदर्शित करता है। विशिष्ट ncAAs के अवशेषों से विशिष्ट शामिल करने के लिए, एक आगे की जरूरतों की जांच करने के लिए अगर अनुरूप CAA distur के अवशेषोंअभिव्यक्ति सिस्टम बी।
सेल मुक्त प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली विभिन्न मांगों को 54 पर प्रतिक्रिया के लिए विभिन्न जीवों से इंजीनियर जा सकता है। सभी ई कोलाई यहाँ प्रस्तुत सेल मुक्त प्रणाली के प्रतिलेखन अनुवाद मशीनरी जीवाणुभोजी और ई के प्रयोग को सक्रिय कोलाई प्रमोटरों, और वे समानांतर में या लगातार झरने 55 में कार्य कर सकते हैं। सामान्य प्रयोज्यता और प्रयोज्य विधि एमिनो एसिड विषाक्तता और चिकित्सीय आवेदन में आगे अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं।
The authors have nothing to disclose.
E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.
Protective eyewear | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z758841 | |
Nitrile gloves (size S) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z768960 | Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL |
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
Microbalance Discovery DV114CM | Ohaus, Greifensee, Switzerland | 80104140 | |
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z243213 | |
L-Canavanine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C9758 | Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves |
Hydroxylysine (racemic mixture) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H0377 | |
Cryo-gloves (size S, water resistent) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z183490 | Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany | BR1401801 | For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G) (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H6147 | |
ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8937 | |
CTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 14121 | |
GTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 16800 | |
UTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 23160 | |
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10109541001 | Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001 |
CoA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C4282 | |
NAD (from yeast ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | N6522 | |
cAMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A9501 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F7878 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8877 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 49605 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | G1149 | |
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 | Addgene, Cambridge, USA | Plasmid #40019 | |
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 81610 | |
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 50001 | |
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 05002 | |
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) | New England Biolabs, Ipswich, USA | P7702S | |
Methanol | Merck, Darmstadt, Germany | 1060091011 | Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood |
Acetic acid (99.8 %) | VWR International, Darmstadt, Germany | 20104.447 | |
Coomassie Blue G-250 (10 g) | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 902120 | |
His-Spin Protein Miniprep kit | Zymo Research Europe, Freiburg, Germany | P2002 | Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T1503 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H1758 | |
Glycerol, 99 % | VWR International, Darmstadt, Germany | 24397.296DB | |
CentriPure Z25 mini spin columns | Genaxxon bioscience, Ulm, Germany | CP-0205-Z100 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | S9888 | |
Concentrator 5301 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5301 000.210 | |
2xYT | MP biomedicals, Santa Ana, USA | 113012032 | |
Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | Biospec, Bartlesville, USA | 522S | |
Beads, 0.1mm dia. | Biospec, Bartlesville, USA | 11079101 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Merck, Darmstadt, Germany | 71402 | |
Bradford BSA protein assay Kit | Bio-Rad, München, Germany | 500-0201 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C1919 | |
Cuvettes, 1.5ml | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 14-955-127 | |
DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D0632 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad, München, Germany | 732-6204 | |
Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 142761 | |
Nunc sealing tape | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 232701 | |
PEG-8000 | Promega, Madison, USA | V3011 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8709 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 66382 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 85558 | |
1L centrifuge bottle | Beckman-Coulter, Brea, USA | A98813 | |
4L Erlenmeyer flask | Kimble Chase, Vineland (NJ), USA | 26500-4000 | |
Avanti J-26XP centrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 393127 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles. |
Forma 480 orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 480 | Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L . |
JLA-8.1000 rotor | Beckman-Coulter, Brea, USA | 363688 | Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles. |
Mini-Beadbeater-1 | Biospec, Bartlesville, USA | 3110BX | |
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 368831 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
Heating block HLC HBT 130 | Labexchange, Burladingen, Germany | 24465 | Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C |
Eppendorf MiniSpin centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5452000018 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z654760 | Or vortex equivalent |
Scotsman AF103 ice flaker machine | Kälte-Berlin, Berlin, Germany | AF103 | Or ice flaker machine equivalent |
MyTemp mini digital incubator | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z763314 | Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C |
EcoCell electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12005 | Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels |
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12001 | Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5278 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5279 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171101 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171301 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171501 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 50-0156 | |
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 525-0150 | |
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 187262 | |
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 567227-U | |
Agilent 1260 HPLC machine | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G1312B | |
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G6530BA | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 270717 | |
FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech, Ortenberg, Germany | 415-101 | Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein |
Hanna Checker pH meter | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z351091 | |
Formic acid eluent additive for LC-MS | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 56302 |