An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.
Den kanoniske sæt af aminosyrer fører til en usædvanlig bred vifte af protein funktionalitet. Ikke desto mindre sæt af rester stadig indebærer begrænsninger af potentielle protein-applikationer. Indarbejdelsen af noncanonical aminosyrer kan forstørre dette anvendelsesområde. Der er to komplementære tilgange til inkorporering af noncanonical aminosyrer. For stedsspecifik inkorporering, i tillæg til de endogene kanoniske translationelle machineries, en ortogonal aminoacyl-tRNA-syntetase-tRNA par skal gives, der ikke interagerer med de kanoniske dem. Derfor er en codon, der ikke er tildelt en kanonisk aminosyre, sædvanligvis en stopkodon, er også påkrævet. Denne genetiske kode ekspansion muliggør inkorporering af et noncanonical aminosyre i et enkelt, givet sted i proteinet. Den her præsenterede arbejde beskriver rest-specifikke inkorporering, hvor den genetiske kode er omfordelt inden for det endogene translationel system. Oversættelsen maskiner enccepts den noncanonical aminosyre som et surrogat til at optage det på canonically foreskrevne steder, dvs. at alle forekomster af en kanonisk aminosyre i proteinet erstattes med noncanonical én. Indarbejdelsen af noncanonical aminosyrer kan ændre proteinstruktur, der forårsager betydeligt modificerede fysiske og kemiske egenskaber. Noncanonical aminosyreanaloger fungerer ofte som cellevækstinhibitorer for ekspressionsværter da de ændrer endogene proteiner, begrænser in vivo proteinproduktion. In vivo inkorporering af toksiske noncanonical aminosyrer i proteiner stadig særdeles udfordrende. Her er en cellefri tilgang til en fuldstændig udskiftning af L-arginin ved noncanonical aminosyren L-canavanine fremlagt. Det omgår de iboende vanskeligheder i vivo-ekspression. Derudover er en protokol til at forberede målproteiner for masse spektralanalyse inkluderet. Det er vist, at L-lysin kan erstattes af L-hydroxy-lysin,dog med lavere effektivitet. I princippet kan enhver noncanonical aminosyreanalog skal iblandes efter præsenterede metode, så længe det endogene in vitro translationssystem genkender det.
Den genetiske kode er universel til biosfæren. Den koder for et sæt af 20 kanoniske aminosyrer, som undertiden forlænget ved selenocystein 1 eller pyrrolysin 2. Det er ribosomet der oversætter den genetiske kode ved hjælp af tRNA'er i kæder af aminosyrer, der folder i proteiner. De funktionelle grupper af de kanoniske aminosyrer, i kombination med posttranslationelle modifikationer, bidrage til en usædvanlig bred vifte af proteinfunktion 3,4. I princippet kan funktionelle begrænsninger på grund af det begrænsede sæt af kanoniske aminosyrer overvindes ved inkorporering yderligere, noncanonical aminosyrer (ncAAs), der muliggør nye kemiske og nye funktionaliteter 3,4.
Der er to komplementære tilgange til indarbejdelse af ncAAs: det websted-eller resten-specifikke inkorporering. Den tidligere metode indebærer betydelige tekniske vanskeligheder, da det kanoniske sæt af aminoacyl-tRNA-synthetases (Aars) og tRNA'er skal udvides med en ortogonal Aars-tRNA par, der ikke må interagere med den endogene oversættelse maskiner. Baseret på omhyggelig teknik, denne tilgang inkorporerer ncAAs som enkelte punktmutationer på det ønskede protein sites. Stedspecifik inkorporering af ncAAs er genetisk kodet af et codon, der ikke er tildelt en kanonisk aminosyre (CAA), sædvanligvis en stopkodon 5-9. Denne metode indebærer ændringer i funktion på et givet sted i stedet på tværs af hele protein 10-13.
I modsætning hertil rest-specifikke inkorporering afhængig fejlagtige anerkendelse af den noncanonical aminosyre af den kanoniske oversættelse maskiner. Inkorporeringen opstår på grund af manglende substratspecificitet af Aars. Resten-specifikke inkorporering af ncAAs, bygget på arbejdet i Cohen og kolleger 14, har ført til vigtige applikationer 3,10, blandt dem bio-retvinklede mærkning 15-17 af proteinereller struktur belysning af proteiner i røntgenkrystallografi 18.
Som naturlige Aars generelt foretrækker deres beslægtede aminosyre over et isostrukturelt NCAA, effektiv in vivo rest-specifikke inkorporering normalt kræver en auxotrof udtryk værten ikke er i stand til at syntetisere den kanoniske analog af NCAA. Værtscellerne dyrkes i vækstmedium, der leverer kun en lav koncentration af den analoge CAA. Dens udmattelse i kombination med den fortløbende tilskud med NCAA tvinger udtrykket vært at indarbejde NCAA i modellen protein på flere, canonically ordineret sites. I modsætning til den site-specifikke tilgang, er der normalt har en dyb indvirkning på hele proteinstruktur, hvilket fører til betydeligt ændrede fysiske og kemiske egenskaber af proteiner 19,20. Men de fleste af ncAAs er vækstinhibitorer for ekspressionsværten 3, da de er inkorporeret i mange andre proteins foruden dem af interesse under rekombinant genekspression. Dette begrænser klart in vivo fremgangsmåde. In vivo inkorporering af aminosyrer, der er toksiske eller har stor indflydelse på proteinet struktur forbliver særligt udfordrende. Men disse molekyler er blandt de mest lovende, at ingeniør proteiner med ekstraordinære funktioner.
Et eksempel er giftigt, noncanonical, naturligt forekommende L-canavanine (Can), en analog af L-arginin (Arg). Det påvirker og blokke Arg tilknyttede regulatoriske og katalytiske reaktionsveje, og dens tilstedeværelse i den levende celle kan føre til øjeblikkelig død 3,21-23. Dens inkorporering i proteiner ved arginin positioner kan reducere protein stabilitet 21-23. På grund af den resulterende toksicitet, ekspression af canavanin holdige proteiner i Escherichia coli (E. coli) og andre fælles ekspressionsværter fortsat en udfordring. Af disse grunde komplet in vivo incorporation af Can på alle Arg positioner er hensigtsmæssigt blevet bekræftet kun én gang 24, ved hjælp af en uddybet single-protein produktionssystem. Imidlertid kan er blevet foreslået som et anti-cancer middel 25-27, og som en stimulator for autoimmune sygdomme hos mennesker 28. Desuden er det genstand for forskellige undersøgelser af sin anti-metaboliske, antibakterielle, svampedræbende og antivirale egenskaber 25. Disse egenskaber hæve et krav til effektiv og nem at udføre metoder til at udtrykke Kan holdige proteiner for farmaceutiske, medicinske og funktionelle undersøgelser.
Selv om mange problemer, der er forbundet til in vivo-fremstilling kan omgås ved anvendelse af cellefrie ekspressionssystemer, in vitro restkoncentrationer tilgange er kun dårligt undersøgt. Det cellefrie rest-specifikke inkorporering af en L-tryptophan analog 29 og multipel ncAAs 30, er blevet rapporteret. Disse metoder er baseret på den yderst effekient T7 RNA-polymerase. T7 RNA-polymerase indebærer bakteriofag-lignende transkription, og derved reducere genetisk funktionalitet i forhold til endogen transkription.
Den komplette rest-specifikke inkorporering af Can til en model protein på alle Arg positioner blev for nylig rapporteret 31, ved anvendelse af et cellefrit ekspressionssystem 32. En mindre ændring af det samme system aktiveret stedsspecifik inkorporering af forskellige pyrrolysin analoger til en model protein via stop-codon undertrykkelse 33. Den anvendte cellefrit system 31. – 33 er baseret på en alt E. coli transkription-translationssystem. Ikke desto mindre muliggør proteinekspression så effektivt som i de nuværende bakteriofag systemer (0,5 – 1 mg / ml rekombinant protein) 32, og samtidig bevare meget af det oprindelige transkription-translation modularitet.
I dette arbejde, er en detaljeret protokol tilvejebragt på hvordan residue-specifikke inkorporering af ncAAs kan realiseres, ved hjælp af denne alt E. coli cellefrit system 32. Derudover foreslås yderligere skridt for at forberede de udtrykte proteiner til passende evaluering via HPLC-ESI massespektroskopi. At udvide egenskaberne for denne celle-fri-system, er dette arbejde ikke kun henvise til den offentliggjorte inkorporering af Can 31, men præsenterer også nye data relateret til noncanonical L-lysin analog L-hydroxy-lysin.
Følgende protokol for resten-specifikke inkorporering af ncAAs er en tilpasning af en protokol for nylig offentliggjort i JOVE 34. Sidstnævnte protokol beskriver, hvordan man udfører højeffektive celle-ytringsfrihed med standard aminosyrer. Endvidere viser fremstillingen af det rå cellefrie ekstrakt, aminosyreopløsningen, energien stamopløsningen og energien puffer anvendes i denne fremgangsmåde. Følgende protokol fokuserer på modificerede trin i forhold til den foregående protokol således at resten-specifikke inkorporering af ncAAs. Kalibrerede pipetter, lav-bindende pipettespidser og mikro-centrifugerør anbefales til præparatet. I det følgende er IUPAC forkortelser for aminosyrerne anvendt.
An-nem at bruge celle-frit ekspressionssystem som en levedygtig strategi til rest-specifikt indarbejde ncAAs i proteiner, præsenteres. Til dette formål er det rå ekstrakt suppleret med vektor-DNA der koder for proteinet af interesse, energibufferen og de tilsvarende aminosyrer. Bemærk, at den rå ekstrakt aliquot volumen afhænger af den rå ekstrakt proteinkoncentrationen 34. Den cellefrie ekspression effektivitet optimeres afhængigt af vektor-DNA-konstruktion koncentration. Mængden af energi bufferkomponenter variere som funktion af optimerede Mg- og K-glutamat koncentrationer for at give høje udbytter af det cellefrie udtrykt model protein.
Der kan opnås en foreløbig evaluering af inkorporeringen eksperimentet ved at udføre SDS-PAGE af det urensede cellefri reaktionsmedium. For en mere detaljeret analyse, er HPLC-ESI massespektroskopi foreslået som et middel til at kontrollere for fuldstændig, rest-specifikke INCORperforering af NCAA. Som forberedelse til den sidstnævnte, er spin-kolonne-systemer bruges til at aktivere His-tag rensning og buffer udveksling med de små mængder, som vi bruger i denne protokol.
Herunder HPLC-ESI-massespektroskopi, kan hele protokollen foretages indenfor 2 dage. Det omfatter ikke særligt kritiske trin. Men koncentration optimeringer af Mg- og K-glutamat samt af vektor-DNA er afgørende for at udtrykke høje udbytter af modelprotein,. Brugen af højeffektive ekspressionsvektor pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 anbefales kraftigt. Eluering af His-mærkede proteiner er normalt på grund af høj koncentration af imidazol (> 150 mM) og andre salte, såsom NaH 2 PO4 (> 300 mM) eller NaCl (> 50 mM), der genererer høj baggrundsstøj i massespektroskopisk analyse 49 . Udveksling af sådanne elueringspuffere med en passende protein opbevaring buffer stabiliserer model protei og drastisk reducerer baggrundsstøj under masse spektroskopisk analyse.
Som følge heraf kan erstatter Arg ved alle seks positioner i modelprotein. I ekspressionssystemet, kan påvises nogen Arg-rester. Dette simplificerer rest-specifikke inkorporering af Arg-analoger sammenlignet med andre ekspressionssystemer, der kræver yderligere udtynding strategier 29,30. Den præsenterede celle-fri tilgang omgår de iboende begrænsninger in vivo metoder, der skyldes Can toksicitet, eller den stærke afhængighed af mRNA sekvens i enkelt protein produktionsstrategier 24,31. I modsætning til den anvendte in vitro system, at in vivo spaltning af Can homoserin og hydroxyguanidine sker 31.
Imidlertid bibeholder en tilstrækkelig mængde af Lys til at konkurrere med analoger, såsom Hyl, det cellefrie system. HPLC-ESI massespektroskopisk analyse viser, at modellen protein indeholder både den Canonical samt noncanonical analogen i forskellige forhold. Resten-specifikke inkorporering af Lys er muligt i almindelighed, men for komplet udskiftning, yderligere udtynding strategier, eller specielt konstruerede Aars og tRNA optimeret til anerkendelse af ncAAs skal udvikles.
Vi opnåede fremragende udbytter af cellefrie udtrykte, modificerede model proteiner ved tilsætning af NCAA i samme koncentration som de kanoniske dem. Inkorporeringseffektiviteten afhænger af arten af NCAA skal indarbejdes. Selv højere udbytter måske stadig kunne realiseres ved at optimere koncentrationen af NCAA.
De præsenterede resultater viser anvendeligheden af den anvendte system til resten-specifikke inkorporering af ncAAs så længe de er accepteret af den kanoniske endogene translationel system. For resten-specifikke inkorporering af specifikke ncAAs, til et yderligere behov kontrollere, om resterne af den analoge CAA disturb udtrykket systemet.
Cellefri transskription-translationssystemer kan konstrueres fra forskellige organismer til at reagere på forskellige krav 54. Den helt E. coli transkription-oversættelse machineries af her præsenterede cellefrit system muliggøre brugen af bakteriofag og E. coli initiativtagere, og de kan virke parallelt eller efter hinanden i kaskader 55. Den generelle anvendelighed og brugervenlighed gør metoden en potent værktøj til yderligere forskning i aminosyre toksicitet og terapeutisk anvendelse.
The authors have nothing to disclose.
E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.
Protective eyewear | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z758841 | |
Nitrile gloves (size S) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z768960 | Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL |
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
Microbalance Discovery DV114CM | Ohaus, Greifensee, Switzerland | 80104140 | |
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z243213 | |
L-Canavanine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C9758 | Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves |
Hydroxylysine (racemic mixture) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H0377 | |
Cryo-gloves (size S, water resistent) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z183490 | Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany | BR1401801 | For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G) (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H6147 | |
ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8937 | |
CTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 14121 | |
GTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 16800 | |
UTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 23160 | |
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10109541001 | Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001 |
CoA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C4282 | |
NAD (from yeast ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | N6522 | |
cAMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A9501 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F7878 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8877 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 49605 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | G1149 | |
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 | Addgene, Cambridge, USA | Plasmid #40019 | |
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 81610 | |
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 50001 | |
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 05002 | |
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) | New England Biolabs, Ipswich, USA | P7702S | |
Methanol | Merck, Darmstadt, Germany | 1060091011 | Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood |
Acetic acid (99.8 %) | VWR International, Darmstadt, Germany | 20104.447 | |
Coomassie Blue G-250 (10 g) | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 902120 | |
His-Spin Protein Miniprep kit | Zymo Research Europe, Freiburg, Germany | P2002 | Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T1503 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H1758 | |
Glycerol, 99 % | VWR International, Darmstadt, Germany | 24397.296DB | |
CentriPure Z25 mini spin columns | Genaxxon bioscience, Ulm, Germany | CP-0205-Z100 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | S9888 | |
Concentrator 5301 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5301 000.210 | |
2xYT | MP biomedicals, Santa Ana, USA | 113012032 | |
Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | Biospec, Bartlesville, USA | 522S | |
Beads, 0.1mm dia. | Biospec, Bartlesville, USA | 11079101 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Merck, Darmstadt, Germany | 71402 | |
Bradford BSA protein assay Kit | Bio-Rad, München, Germany | 500-0201 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C1919 | |
Cuvettes, 1.5ml | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 14-955-127 | |
DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D0632 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad, München, Germany | 732-6204 | |
Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 142761 | |
Nunc sealing tape | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 232701 | |
PEG-8000 | Promega, Madison, USA | V3011 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8709 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 66382 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 85558 | |
1L centrifuge bottle | Beckman-Coulter, Brea, USA | A98813 | |
4L Erlenmeyer flask | Kimble Chase, Vineland (NJ), USA | 26500-4000 | |
Avanti J-26XP centrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 393127 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles. |
Forma 480 orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 480 | Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L . |
JLA-8.1000 rotor | Beckman-Coulter, Brea, USA | 363688 | Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles. |
Mini-Beadbeater-1 | Biospec, Bartlesville, USA | 3110BX | |
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 368831 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
Heating block HLC HBT 130 | Labexchange, Burladingen, Germany | 24465 | Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C |
Eppendorf MiniSpin centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5452000018 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z654760 | Or vortex equivalent |
Scotsman AF103 ice flaker machine | Kälte-Berlin, Berlin, Germany | AF103 | Or ice flaker machine equivalent |
MyTemp mini digital incubator | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z763314 | Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C |
EcoCell electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12005 | Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels |
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12001 | Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5278 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5279 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171101 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171301 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171501 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 50-0156 | |
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 525-0150 | |
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 187262 | |
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 567227-U | |
Agilent 1260 HPLC machine | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G1312B | |
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G6530BA | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 270717 | |
FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech, Ortenberg, Germany | 415-101 | Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein |
Hanna Checker pH meter | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z351091 | |
Formic acid eluent additive for LC-MS | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 56302 |