An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.
Den kanoniske settet av aminosyrer fører til en usedvanlig bredt spekter av proteinfunksjonalitet. Likevel, det sett av rester fortsatt pålegger begrensninger på potensielle protein applikasjoner. Inkorporering av noncanonical aminosyrer kan forstørre dette omfang. Det er to komplementære fremgangsmåter for inkorporering av noncanonical aminosyrer. For stedsspesifikke inkorporering, i tillegg til de endogene kanoniske translasjonsforskning machineries, en ortogonal aminoacyl-tRNA-syntetase-tRNA pair må gis som ikke samhandler med de kanoniske seg. Følgelig er et kodon som ikke er tilordnet til en kanonisk aminosyre, vanligvis et stoppkodon, er også nødvendig. Denne genetiske kode utvidelse muliggjør inkorporering av en noncanonical aminosyre ved en enkelt, gitt område i proteinet. Den her presenterte arbeidet beskriver rest-spesifikk innlemmelse hvor den genetiske koden er overført innenfor den endogene translasjonell system. Oversettelsen maskineri enccepts den noncanonical aminosyren som et surrogat for å innlemme den i kanonisk foreskrevne steder, det vil si, er alle forekomster av en kanonisk aminosyre i proteinet erstattes av en noncanonical. Inkorporering av noncanonical aminosyrer kan forandre proteinstrukturen, forårsaker betydelig modifiserte fysikalske og kjemiske egenskaper. Noncanonical aminosyreanaloger ofte virke som cellevekst-inhibitorer for ekspresjonsverter siden de modifisere endogene proteiner, noe som begrenser in vivo proteinproduksjon. In vivo-inkorporering av toksiske noncanonical aminosyrer i proteiner forblir spesielt utfordrende. Her blir en celle-fri tilnærming for en fullstendig erstatning av L-arginin ved den noncanonical aminosyren L-canavanine presentert. Det omgår de iboende vanskelighetene med in vivo-ekspresjon. I tillegg er en protokoll for å forberede målproteiner for massespektralanalyse inkludert. Det er vist at L-lysin kan erstattes av L-hydroksy-lysin,om enn med lavere effektivitet. I prinsippet kan en hvilken som helst noncanonical aminosyreanalog inkorporeres ved å bruke den fremlagte fremgangsmåten, så lenge den endogene in vitro-translasjonssystem gjenkjenner det.
Den genetiske koden er universell til biosfæren. Det koder for et sett med 20 kanoniske aminosyrer, som er noen ganger forlenges med selenocystein en eller pyrrolysine to. Det er ribosomet som oversetter den genetiske koden ved hjelp av tRNA til kjeder av aminosyrer som foldes inn i proteiner. De funksjonelle gruppene av den kanoniske aminosyrer, i kombinasjon med posttranslational modifikasjoner, bidra til et usedvanlig bredt spekter av proteinfunksjon 3,4. I prinsippet kan funksjonelle begrensninger på grunn av begrenset sett med kanoniske aminosyrer bli overvunnet ved å innlemme ytterligere, noncanonical aminosyrer (ncAAs) som gjør det mulig for nye kjemikalier og ny funksjonalitet 3,4.
Det er to komplementære fremgangsmåter for inkorporering av ncAAs: den site eller den rest-spesifikk innlemmelse. Den tidligere metoden innebærer betydelige tekniske problemer, siden den kanoniske sett aminoacyl-tRNA-synthetases (Aars) og tRNAs må utvides med en ortogonal Aars-tRNA par som ikke må samhandle med endogen oversettelse maskiner. Basert på grundig engineering, inkorporerer denne tilnærmingen de ncAAs som enkeltpunktmutasjoner på de ønskede protein nettsteder. Sete-spesifikk innlemmelse av ncAAs er genetisk kodet for av et kodon som ikke er tilordnet til en kanonisk aminosyre (CAA), vanligvis et stoppkodon 5-9. Denne metoden medfører endringer i funksjon på et gitt område snarere enn på tvers av hele proteinet 10-13.
I kontrast, avhengig rest-spesifikk innlemmelse på feilaktig anerkjennelse av noncanonical aminosyre ved den kanoniske oversettelse maskiner. Inkorporeringen oppstår på grunn av manglende substrat spesifisitet av Aars. Resten spesifikke inkorporering av ncAAs, bygget på arbeidet til Cohen og medarbeidere 14, har ført til viktige applikasjoner 3,10, blant dem bio-ortogonale merking 15-17 av proteinereller strukturoppklaring av proteiner i røntgenkrystallografi 18.
Som naturlige Aars generelt foretrekker deres beslektet aminosyre over en isostrukturelle NCAA, effektiv in vivo rest-spesifikk innlemmelse vanligvis krever en auksotrop uttrykk verten ikke i stand til å syntetisere den kanoniske analog av NCAA. Vertscellene blir dyrket i vekstmedium som gir bare en lav konsentrasjon av det analoge CAA. Dens utmattelse i kombinasjon med påfølgende tilskudd med NCAA tvinger uttrykk vert å innlemme NCAA i modellen protein på flere, kanonisk foreskrevet nettsteder. I motsetning til den setespesifikke tilnærming, vanligvis har dette en dyp innvirkning på hele proteinstruktur, hvilket fører til betydelig modifisert fysikalske og kjemiske egenskaper av proteiner 19,20. Imidlertid har de fleste av de ncAAs er vekst inhibitorer for ekspresjon verten 3, som de er inkorporert i mange andre proteins foruten de av interesse i løpet av rekombinant genekspresjon. Dette begrenser klart in vivo tilnærming. In vivo-inkorporering av aminosyrer som er giftige eller har sterk innvirkning på proteinstrukturen forblir spesielt utfordrende. Men disse molekylene er blant de mest lovende for å konstruere proteiner med ekstraordinære funksjoner.
Et eksempel er giftig, noncanonical, naturlig forekommende L-canavanine (CAN), en analog av L-arginin (Arg). Det påvirker og blokker Arg tilhørende regulatoriske og katalytiske reaksjonsveier, og sin tilstedeværelse i den levende celle kan føre til umiddelbar død 3,21-23. Dens innlemmelse i proteiner på arginin posisjoner kan redusere proteinstabilitet 21-23. På grunn av den resulterende toksisitet, forblir ekspresjonen av canavanine inneholdende proteiner i Escherichia coli (E. coli) og andre vanlige ekspresjonsverter en utfordring. Av disse grunner, komplett in vivo incorporation av Can på alle Arg stillinger har riktig blitt bekreftet bare en gang 24, ved hjelp av en utdypet single-protein produksjonssystem. Kan imidlertid blitt foreslått som et middel mot kreft 25-27, og som en stimulator for autoimmune sykdommer i mennesker 28. I tillegg er det gjenstand for ulike studier på sin anti-metabolske, antibakteriell, soppdrepende og antivirale egenskaper 25. Disse egenskapene heve et behov for effektiv og enkel å utføre metoder for å uttrykke Kan inneholder proteiner for Farmasøytiske, medisinske og funksjonelle studier.
Selv om mange problemer som er knyttet til in vivo produksjon kan omgås ved å bruke cellefrie ekspresjonssystemer, in vitro rest-spesifikke tilnærmingsmåter har bare vært dårlig utforsket. Den celle-frie rest-spesifikk innlemmelse av en L-tryptofan analog 29 og multippel ncAAs 30 er rapportert. Disse fremgangsmåtene er basert på den meget efficient T7 RNA polymerase. T7 RNA polymerase innebærer bakteriofag-lignende transkripsjon, og dermed redusere genetisk funksjonalitet i forhold til endogen transkripsjon.
Den komplette rest-spesifikk innlemmelse av Can inn i en modell protein ved alle Arg posisjoner ble nylig rapportert 31, ved hjelp av et cellefritt ekspresjonssystem 32. En liten modifikasjon av det samme system aktivert sete-spesifikk innlemmelse av forskjellige pyrrolysine analoger inn i en modell-protein ved stoppkodon undertrykkelse 33. Den anvendte cellefritt system 31-33 er basert på en helt E. coli transkripsjon-oversettelse system. Ikke desto mindre gjør det proteinekspresjon så effektivt som i dagens bakteriofag systemer (0,5 til 1 mg / ml av rekombinant protein) 32, og samtidig beholde mye av den opprinnelige transkripsjon-translation modularitet.
I dette arbeidet er en detaljert protokoll gitt på hvordan residue-spesifikk innlemmelse av ncAAs kan realiseres, ved hjelp av denne alt E. coli cellefritt system 32. I tillegg er ytterligere skritt for å forberede de uttrykte proteiner for nødvendig utredning via HPLC-ESI massespektroskopi foreslått. Å utvide egenskapene til denne cellefritt system, gjør dette arbeidet ikke bare henvise til den publiserte inkorporering av Can 31, men presenterer også nye data knyttet til noncanonical L-lysin analog L-hydroxy-lysin.
Den følgende protokoll for rest-spesifikk innlemmelse av ncAAs er en tilpasning av en protokoll nylig publisert i Jove 34. Sistnevnte protokollen beskriver hvordan du utfører svært effektiv celle-frie uttrykk med standard aminosyrer. Videre presenterer det ved fremstillingen av det urene cellefrie ekstrakt, aminosyreoppløsningen, energien stamløsning og energibufferen som brukes i denne fremgangsmåten. Følgende protokoll fokuserer på modifiserte fremgangsmåten i forhold til den foregående protocol for å aktivere rest-spesifikke inkorporering av ncAAs. Kalibrerte pipetter, lav-bindende pipettespisser og mikro-sentrifugerør anbefales for preparatet. I det følgende er IUPAC-forkortelser for aminosyrene anvendes.
An-enkel å bruke celle-fri ytring system som en levedyktig strategi til rest-spesifikt innlemme ncAAs til proteiner, blir presentert. For dette formål blir det rå ekstrakt supplert med vektor-DNA som koder for proteinet av interesse, energibufferen og de tilsvarende aminosyrer. Legg merke til at det rå ekstrakt alikvot volum avhenger av råekstraktet proteinkonsentrasjon 34. Den cellefrie ekspresjon effektivitet optimaliseres avhengig av vektor-DNA konstruksjon konsentrasjon. Volumene av de energibufferkomponenter varierer som funksjon av optimalisert Mg- og K-glutamat-konsentrasjoner for å muliggjøre høye utbytter av cellefritt uttrykte modell protein.
En foreløpig vurdering av inkorporeringen eksperimentet kan oppnås ved å utføre SDS-PAGE av det urensede cellefritt reaksjonsmedium. For en mer detaljert analyse, er HPLC-ESI massespektroskopi foreslått som et middel for å sjekke for fullstendig, rest-spesifikk INCORporation av NCAA. Som en forberedelse til sistnevnte, er spin kolonne systemer som brukes til å aktivere His-tag rensing og bufferutveksling med små volumer som vi bruker i denne protokollen.
Inkludert HPLC-ESI massespektroskopi, kan hele protokollen bli utført i løpet av 2 dager. Det inkluderer ikke særlig kritiske trinn. Imidlertid konsentrasjonsoptimaliseringer av Mg- og K-glutamat, så vel som av vektor-DNA er svært viktige for å uttrykke høye utbytter av modellen proteinet. Bruken av svært effektiv ekspresjonsvektor pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 anbefales sterkt. Eluering av Hans-merkede proteiner er vanligvis på grunn av høy konsentrasjon av imidazol (> 150 mM) og andre salter, så som NaH 2PO 4 (> 300 mM) eller NaCl (> 50 mM) som genererer høy bakgrunnsstøy i massespektroskopianalyse 49 . Utveksling av slike elueringsbuffere med en egnet protein lagring buffer stabiliserer modellen beskytti og drastisk reduserer bakgrunnsstøy under massespektroskopi.
Som et resultat, kan erstatte Arg ved alle seks stillinger innenfor modellen protein. I uttrykket system, kan ingen Arg-rester påvises. Dette forenkler rest-spesifikke inkorporering av Arg analoger sammenlignet med andre uttrykk systemer som krever ytterligere utarming strategier 29,30. Den presenterte celle-fri tilnærming omgår de iboende begrensningene i vivo tilnærminger som skyldes Can toksisitet, eller den sterke avhengigheten av mRNA sekvens i ett proteinproduksjonsstrategier 24,31. I motsetning til det som anvendes in vitro system, til in vivo spalting av Can homoserin og hydroxyguanidine forekommer 31.
Imidlertid beholder cellefritt system en tilstrekkelig mengde av Lys å konkurrere med analoger som Hyl. HPLC-ESI-massespektroskopianalyse viser at produktet inneholder både protein, canonical så vel som den analoge noncanonical i forskjellige mengdeforhold. Resten spesifikke inkorporering av Lys er mulig generelt, men for fullstendig substitusjon, ytterligere utarming strategier, eller spesialkonstruerte Aars og tRNA optimalisert for godkjenning av ncAAs må utvikles.
Vi oppnådde gode utbytter av cellefrie uttrykt, modifiserte modell proteiner ved å legge NCAA i samme konsentrasjon som de kanoniske seg. Inkorporeringen effektivitet avhenger av arten av svømming som skal inkorporeres. Selv høyere avkastning kan fortsatt være realiserbar ved å optimalisere konsentrasjonen av NCAA.
De presenterte resultater viser anvendbarheten av det anvendte system for rest-spesifikk innlemmelse av ncAAs så lenge de er akseptert av den kanoniske endogene translasjonelle system. For resten spesifikke inkorporering av spesifikke ncAAs, til en ytterligere behov sjekke om rester av den analoge CAA forstyrb ekspresjonssystemet.
Cell-free transkripsjon oversettelsessystemer kan være konstruert fra ulike organismer å svare på ulike krav 54. All E. coli transkripsjon-oversettings machineries av her presenteres cellefritt system aktivere bruk av bakteriofag og E. coli-arrangører, og de kan fungere parallelt eller etter hverandre i kaskader 55. Den generelle anvendelighet og brukervennlighet gjør metoden et potent verktøy for videre forskning på aminosyren toksisitet og terapeutisk anvendelse.
The authors have nothing to disclose.
E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.
Protective eyewear | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z758841 | |
Nitrile gloves (size S) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z768960 | Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL |
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
Microbalance Discovery DV114CM | Ohaus, Greifensee, Switzerland | 80104140 | |
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z243213 | |
L-Canavanine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C9758 | Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves |
Hydroxylysine (racemic mixture) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H0377 | |
Cryo-gloves (size S, water resistent) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z183490 | Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany | BR1401801 | For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G) (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H6147 | |
ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8937 | |
CTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 14121 | |
GTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 16800 | |
UTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 23160 | |
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10109541001 | Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001 |
CoA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C4282 | |
NAD (from yeast ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | N6522 | |
cAMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A9501 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F7878 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8877 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 49605 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | G1149 | |
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 | Addgene, Cambridge, USA | Plasmid #40019 | |
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 81610 | |
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 50001 | |
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 05002 | |
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) | New England Biolabs, Ipswich, USA | P7702S | |
Methanol | Merck, Darmstadt, Germany | 1060091011 | Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood |
Acetic acid (99.8 %) | VWR International, Darmstadt, Germany | 20104.447 | |
Coomassie Blue G-250 (10 g) | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 902120 | |
His-Spin Protein Miniprep kit | Zymo Research Europe, Freiburg, Germany | P2002 | Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T1503 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H1758 | |
Glycerol, 99 % | VWR International, Darmstadt, Germany | 24397.296DB | |
CentriPure Z25 mini spin columns | Genaxxon bioscience, Ulm, Germany | CP-0205-Z100 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | S9888 | |
Concentrator 5301 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5301 000.210 | |
2xYT | MP biomedicals, Santa Ana, USA | 113012032 | |
Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | Biospec, Bartlesville, USA | 522S | |
Beads, 0.1mm dia. | Biospec, Bartlesville, USA | 11079101 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Merck, Darmstadt, Germany | 71402 | |
Bradford BSA protein assay Kit | Bio-Rad, München, Germany | 500-0201 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C1919 | |
Cuvettes, 1.5ml | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 14-955-127 | |
DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D0632 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad, München, Germany | 732-6204 | |
Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 142761 | |
Nunc sealing tape | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 232701 | |
PEG-8000 | Promega, Madison, USA | V3011 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8709 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 66382 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 85558 | |
1L centrifuge bottle | Beckman-Coulter, Brea, USA | A98813 | |
4L Erlenmeyer flask | Kimble Chase, Vineland (NJ), USA | 26500-4000 | |
Avanti J-26XP centrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 393127 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles. |
Forma 480 orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 480 | Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L . |
JLA-8.1000 rotor | Beckman-Coulter, Brea, USA | 363688 | Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles. |
Mini-Beadbeater-1 | Biospec, Bartlesville, USA | 3110BX | |
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 368831 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
Heating block HLC HBT 130 | Labexchange, Burladingen, Germany | 24465 | Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C |
Eppendorf MiniSpin centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5452000018 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z654760 | Or vortex equivalent |
Scotsman AF103 ice flaker machine | Kälte-Berlin, Berlin, Germany | AF103 | Or ice flaker machine equivalent |
MyTemp mini digital incubator | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z763314 | Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C |
EcoCell electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12005 | Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels |
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12001 | Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5278 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5279 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171101 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171301 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171501 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 50-0156 | |
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 525-0150 | |
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 187262 | |
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 567227-U | |
Agilent 1260 HPLC machine | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G1312B | |
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G6530BA | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 270717 | |
FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech, Ortenberg, Germany | 415-101 | Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein |
Hanna Checker pH meter | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z351091 | |
Formic acid eluent additive for LC-MS | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 56302 |